Библиотечный каталог авторефератов Украины

Рис. 8. Схема створення гібридної конструкції, що містить lacZ-ген під pelX-промотором. Вказано промоторні ділянки pelX та суміжного гена. Стоп-кодони виділено прямокутниками. СЗР- сайт зв’язування з рибосомою

сляцію lacZ-транскрипту. PstI-SmaI фрагмент pLC28P розміром 700 п. н., що включав 608 п. н. вище pelX- гена та 92 п. н. його кодуючої частини, було клоновано в полілінкер рСВ192. Конструкцією, що отримала назву pGalP (див. рис. 8), було трансформовано E. coli JM109 та K. oxytoca VN13.

Створену конструкцію було використано для вивчення характеру експресії pelX-гена, що визначався за рівнем β-галактозидазної активності. Увагу було приділено двом індукторам- полігалактуронату (ПГН), продукти розщеплення якого відомі як індуктори експресії пектиназних генів E. chrysanthemi та E. carotovora, та рослинному екстракту, що діє аналогічним чином. Отримані дані порівнювалися з даними для загальної пектатліазної активності K. oxytoca VN13 (рис.9).

Рис. 9. β- галактозидазна активність E. coli JM109 та K. oxytoca VN13, трансформованих pGalP та загальна пектатліазна активність K. oxytoca VN13. А- β- галактозидазна активність E. coli JM109 (pGalP); Б- β- галактозидазна активність K. oxytoca VN13 (pGalP); В- загальна пектатліазна активність K. oxytoca VN13.ГЛІЦ.- гліцерин; ГЛЮК.- глюкоза; ПГН- полігалактуронат; РЕ- рослинний екстракт

Потрібно зазначити ряд закономірностей, що простежуються в результатах даного дослідження.

1. В шістнадцять разів  вищий  базовий  рівень  β- галактозидазної  активності  в E. coli (27,55 од.) порівняно з експресією створеної конструкції в K. oxytocа VN13 (1,71 од.) свідчить про зарепресованість pelX-гена в K. oxytoca при відсутності індукції.
2. Додавання глюкози, при наявності в середовищі гліцерину як доступного джерела вуглецю, призводить до незначного зниження активності β- галактозидази (з 1,71 до 0,79 од., тобто в 1,6 разів), що узгоджується з відсутністю в регуляторній ділянці гена оператора для БАК.
3. Полігалактуронат, який додавали в середовище, призвів до дворазового збільшення активності β- галактозидази в K. oxytoca VN13 ( з 1,71 до 3,97 од.), в той час як збільшення загальної пектатліазної активності цієї бактерії відбулося у вісім з половиною разів (з 0,008 до 0,068 од.). Оскільки субстрат не повною мірою знімає репресію вказаного гена в K. oxytoca VN13 , можна припустити існування додаткового негативного регулятора його активності. Дані про низький рівень індукції експресії pelX при додаванні полігалактуронату суперечать даним про наявність KdgR- операторів в промоторній ділянці pelX. Щодо E. chrysanthemi та E. carotovora відомо, що додавання полігалактуронату призводить до знімання репресії у генів, які контролюються KdgR (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996). Можливим поясненням було б припущення про існування, крім KdgR, додаткового негативного регулятора експресії pelX, який не впливає на експресію решти пектатліаз. Варто зазначити, що рівень експресії клонованого гена полігалактуронази K. oxytoca VN13 (pehX) в E. coli та K. oxytoca VN13 не відрізняється (Ковтунович та ін., 2000), що може свідчити на користь припущення про суттєві відмінності між регуляцією pelX та інших генів пектолітичної системи.
4. Оскільки полігалактуронат є складовою частиною клітинної стінки рослин, то така незначна індукованість експресії рelX в даних умовах може свідчити про відсутність ролі цього ферменту K. oxytoca в процесі внутрішньої колонізації рослин. На користь такого припущення свідчать також отримані нами раніше дані (Ковтунович та ін., 2002), що екзопектинази, зокрема екополігалактуроназа K. oxytoca VN13, не беруть участі в процесі внутрішньої колонізації рослинних тканин цією бактерією. Це не суперечить даним літератури щодо екзопектиназ фітопатогенних бактерій роду Erwinia, які не беруть участі в процесі патогенезу, що пов'язаний з деструкцією пектину серединної пластинки рослинних клітин.
5. Рослинний екстракт, як це видно з діаграм, не впливає на рівень експресії β- галактозидази  ні в E. coli ( 27,55 од. на гліцерині та 28 од. при додаванні екстракту) ні в K. oxytoca VN13 (1,71 та 1,91 од., відповідно). Найцікавішим є той факт, що додавання рослинного екстракту в середовище призводить до півтораразового зниження загальної пектатліазної активності K. oxytoca VN13 ( 0,008 од. на гліцерині та 0,005 од. при додаванні екстракту), на фоні високого рівня індукції ПГН. Цей результат відрізняється від існуючих літературних даних щодо індукції експресії пектатліазних генів E. chrysanthemi і E. carotovora, загальна пектатліазна активність яких значно збільшується в присутності рослинного екстракту.

Суттєвий рівень конститутивного синтезу РelX та низький рівень індукції рelX-гена при додаванні субстрату, може вказувати на роль його продукту  як ініціатора процесу пектинолізису. Незначна кількість продуктів розщеплення пектину, що утворюється внаслідок конститутивного синтезу РelX, перетворюючись на власне індуктори- 5-кето-4-дезоксиуронат, 2,5- дикето-3- дезоксиглюконат та 2- кето- 3- дезоксиглюконат, дозволяють зняти репресію інших генів, задіяних у процесі деполімеризації клітинної стінки рослини, що входять до складу KdgR-регулону.

Інгібування експресії пектатліазних генів рослинним екстрактом може вказувати на те, що рослина продукує певні речовини, які контролюють пектолітичну, тобто, мацеруючу активність ендофітної K. oxytoca. Присутність пектину в середовищі, стимулює бактерію до його розщеплення і дозволяє колонізувати рослину, а рослинні продукти контролюють ріст рівня експресії різних генів пектолітичної системи, уникаючи мацерації тканин та підтримуючи певну чисельність бактерій в асоціації. Наявність такого механізму дозволила б пояснити чому, навіть, при здатності до високого рівню синтезу пектатліаз, ендофітна K. oxytoca VN13, на відміну від фітопатогенних бактерій роду Erwinia, не спричиняє м'якої гнилі рослин.

ВИСНОВКИ

1. Проаналізовано структуру та особливості експресії гена екзопектатліази ендофітної бактерії K. oxytoca VN13.
2. Створено плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та клоновано ген, який кодує пектатліазу. Визначено повну нуклеотидну послідовність клонованого гена та прилеглих ділянок, що становить 2950 п. н. Встановлено екзосубстратну специфічність продукту pelX.
3. У промоторній ділянці pelX-гена виявлено дві консенсусні послідовності для зв’язування KdgR- репресора, що вказує на приналежність даного гена до KdgR- регулону K. oxytoca VN13. Значно вищий рівень експресії клонованого гена в E. coli свідчить про можливість існування в K. oxytoca VN13 додаткового негативного регулятора експресії pelX-гена.
4. Створено інсерційний мутант K.oxytoca VN13 з неактивною копією pelX-гена та за його допомогою встановлено, що K. oxytoca VN13 має додатковий пектатліазний ген (-и), який не має суттєвої гомології ДНК- послідовності з pelX-геном.
5. Створено гібридну конструкцію, яка містить lacZ-ген під pelX- промотором та за його допомогою встановлено конститутивний характер експресії pelX-гена K. oxytoca VN13 та незначний рівень його  індукованості в присутності індукторів рослинного походження, що може вказувати на роль його продукту як активатора процесу пектинолізису.
6. Запропоновано існування механізму контролю пектолітичної активності та чисельності бактерій-асоціантів K. oxytoca VN13 у внутрішніх тканинах кореня рослини, що полягає в здатності рослини до синтезу певних речовин, які прямо або опосередковано є інгібіторами синтезу бактеріальних пектатліаз.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Kovtunovych G., Lar O., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Enhancing the internal plant colonization rate with endophytic nitrogen-fixing bacteria // Биополимеры и клетка. - 1999. -  Т. 15, № 4. - С. 300-305.

2. Kovtunovych G., Lar O., Kamalova S., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N.. Correlation between pectate lyase activity and ability of diazotrophic Klebsiella oxytoca VN13 to penetrate into Plant Tissues by // Plant and Soil. -  1999. - Vol. 215.-  P. 1-6.

3. Лар О. В., Ковтунович Г. Л., Козировська Н. О. Клонування і аналіз гена пектатліази pelX Klebsilla oxytoca VN13 // Біополімери і клітина.- 2002.-Т.17, № 5.- С. 417-422.

4. Kovtunovych G., Lar О., Kozyrovska N. Molecular mechanisms of diazotrofic Klebsiella oxytoca enter inside the plant tissue: the role of polygalacturonase and pectate lyase // Fourth European Nitrogen Fixation Conference. - Seville (Spain). - 2000. - P. 151.

Анотація

Лар О. В. Клонування та аналіз структури і особливостей експресії гена екзопектатліази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22- молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2003.

В дисертації викладено результати дослідження пектатліазної активності ендофітної бактерії K. oxytoca VN13, що використовується як основа біопрепаратів для рослинництва.

Клоновано та визначено нуклеотидну послідовність pelX-гена, який кодує екзопектатліазу. Проведено аналіз кодуючої та регуляторних ділянок вказаного гена. Виявлено операторні ділянки для репресора пектолітичної системи - KdgR. Велика ймовірність існування сигнального пептиду на N-кінці первинного транслянту pelX-гена вказує на позацитоплазматичну локалізацію зрілого РelX – білка.

Сконструйовано мутантний штам K. oxytoca VN13 з інактивованим pelX – геном та виявлено наявність додаткового пектатліазного гена (генів) K. oxytoca VN13. Створено гібридну конструкцію, що містить lacZ – ген, який кодує   β– галактозидазу, під pelX – промотором та за її допомогою встановлено конститутивний характер експресії pelX-гена K. oxytoca VN13. Конститутивний характер експресії pelX та відсутність його індукованості в присутності полігалактуронату та рослинного екстракту, може вказувати на роль його продукту як ініціатора процесу пектинолізису.

Запропоновано можливість існування механізму контролю пектолітичної активності та чисельності бактерій - асоціантів K. oxytoca VN13 у внутрішніх тканинах кореня рослини, що полягає в здатності рослини до синтезу певних речовин, які прямо або опосередковано є інгібіторами синтезу бактеріальних пектатліаз.

Ключові слова: Klebsiella oxytoca, пектиназа, пектатліаза, pelX.  

Аннотация

Лар Е. В. Клонирование и анализ структуры и особенностей экспрессии гена экзопектатлиазы эндофитной бактерии K. oxytoca VN13.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22- молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2003.

В диссертации изложены результаты по продолжению исследования пектолитической системы эндофитной бактерии K. oxytoca VN13, которая используется как основа биопрепаратов для растениеводства.

С целью поиска генов пектинолизиса K. oxytoca VN13 была создана геномная библиотека на основе вектора pUC19 с использованием для ее создания Sau3A-фрагментов хромосомной ДНК K. oxytoca VN13. Клонирован фрагмент хромосомной ДНК K. oxytoca VN13 размером 5,2 тыс. п. н. содержащий ген pelX, кодирующий пектатлиазу. При помощи метода хроматографии на бумаге установлена экзосубстратная специфичность продукта гена pelX. Определена и проанализирована полная нуклеотидная последовательность кодирующей части pelX-гена, а также его регуляторных областей. Определены потенциальные промоторные участки, найдены сайты для связывания репрессора генов пектинолизиса - KdgR. Высокая степень вероятности существования сигнальной последовательности на N-конце первичного транслянта pelX–гена указывает на внеклеточную либо периплазматическую локализацию зрелого РelX–белка, что согласуется с данными относительно экзопектатлиазы РelX Erwinia  chrysanthemi, которая локализуется в периплазме. Проведен сравнительный анализ гомологии нуклеотидной последовательности pelX–гена и выведенной аминокислотной последовательности первичного транслянта с соответствующими последовательностями, депонированными в электронном банке генов. Не найдено существенной гомологии нуклеотидной последовательности гена с известными  ДНК-последовательностями других микроорганизмов, кроме нескольких участков ДНК, длиной до 150 н.п. гомологичных pelX–гену Erwinia  chrysanthemi. Кроме того, установлено, что участок нуклеотидной последовательности, прилежащий к началу pelX–гена K. oxytoca VN13 содержит начало открытой рамки считывания (ОРС), транскрибируемой по противоположной цепи ДНК, и гомологичной glmU- гену Escherichia coli, что совпадает с данными относительно аналогичного участка хромосомной ДНК, прилежащего к pelX-гену E. chrysanthemi.

Инсерционный мутант K. oxytoca VN13 по pelX-гену был создан с целью установления наличия дополнительных пектатлиазных генов у K. oxytoca VN13. Измерение пектатлиазной активности данного мутанта продемонстрировало наличие еще одного или нескольких пектатлиазных генов K. oxytoca VN13.

С целью изучения характера экспрессии pelX- гена в сравнении с общей пектатлиазной активностью K. oxytoca VN13 была создана гибридная конструкция, содержащая lacZ- ген, кодирующий β – галактозидазу,  под pelX- промотором. Был показан низкий базовый уровень экспрессии данного гена, а также его слабая индуцибельность в присутствии продуктов пектинового катаболизма и растительного экстракта. Такой результат свидетельствует, что в проникновении во внутренние ткани растения продукт гена pelX K. oxytoca VN13, скорее всего, играет роль инициатора процесса деполимеризации растительной клеточной стенки. Незначительное количество продуктов деградации пектину, которые образуются вследствие конститутивного синтеза РelX, превращаясь в собственно индукторы- 5-кето-4-дезоксиуронат, 2,5- дикето-3- дезоксиглюконат и 2- кето- 3- дезоксиглюконат, позволяют снять репрессию других генов, задействованых в процессе деполимеризации клеточной стенки растения, которые входят в состав KdgR-регулона.

Существенная разница в уровне экспрессии β- галактозидазы в E. coli и в K. oxytoca VN13 (в шестнадцать раз выше в E. coli чем в K. oxytoca VN13 ), а также неполная дерепрессия экспрессии pelX при добавлении субстрата, может свидетельствовать в пользу наличия у K. oxytoca VN13 дополнительного негативного регулятора экспрессии pelX. В пользу этого предположения свидетельствует также тот факт, что уровень экспрессии гена экзополигалактуроназы K. oxytoca VN13 в E. coli и K. oxytoca VN13 практически не отличается.

Ингибирование экспрессии пектиназных генов растительным экстрактом может свидетельствовать о том, что растение продуцирует определенные вещества, контролирующие пектолитическую активность эндофитной K. oxytoca VN13. Присутствие пектина в среде стимулирует бактерию его расщеплять и позволяет колонизировать растение, а растительные продукты контролируют рост уровня экспрессии различных генов пектолитической системы, не приводя к мацерации тканей и поддерживая определенную численность бактерий в ассоциации.    

Указывается на возможность существования механизма контроля численности бактерий- ассоциантов K. oxytoca VN13 во внутренних тканях корня растений, что проявляется в способности растения к синтезу определенных веществ, выступающих, прямо или косвенно, ингибиторами синтеза бактериальных пектатлиаз. Существование такого механизма могло бы пояснить почему, при высоком уровне синтеза пектиназ в условиях полной дерепрессии экспрессии соответствующих генов, эндофитная K. oxytoca VN13 не вызывает мягкой гнили растений.

Ключевые слова: Klebsiella oxytoca, пектиназа, пектатлиаза, pelX.

Summаry

Lar O. V. Cloning and analysis of the structure and a character of expression of exo- pectate lyase gene of  endophytic bacteria Klebsiella oxytoca VN13.- Manuscript.

Тhesis for a candidate’s scientific degree of biological science by speciality 03.00.22- molecular genetic. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2003.

This manuscript presents results of investigation of the pectate lyase activity of endophytic bacteria Klebsiella oxytoca VN13, which is used for inoculant production.

The pelX gene of Klebsiella oxytoca VN13, coding for the pectate lyase activity, was cloned and sequenced. Coding and regulatory regions of pelX were analyzed. Two boxes for the KdgR repressor binding located in the promoter region were founded. Amino- terminal signal sequence for PelX was deduced, this indicate possible extracytoplasmatic location of PelX protein.

The mutant with the defect chromosomal copy of the pelX gene has been constructed and the presence of additional pectate lyase gene (-s) in the Klebsiella oxytoca VN13 genome was revealed. Fusion of the pelX promoter part and the coding part of the lacZ gene, coding for в – galactosidase activity, has been constructed. Constitutive character of the pelX expression and the absence of the pelX expression level  elevation, when the polygalacturonate and the plant extract are added, indicate the possible role of pelX as the pectinolysis activator.

The possibility of the control mechanism for pectolytic activity and the number of bacteria associated with the internal plants tissues are surmise. It is possible, that the plant is able to produce certain substances- bacteria pectinase production inhibitors.  

Key words: Klebsiella oxytoca, pectinase, pectate lyase, pelX.