Библиотечный каталог авторефератов Украины

де Δn - кількість молекул води, необхідних для здійснення переходу;

μср і μ2  - хімічні потенціали, відповідно, у середній точці і після переходу (, де -відносна вологість). Результати розрахунків наведено в табл.4.

Величина зміни вільної енергії при структурному переході залежить від нуклеотидного складу. Із збільшенням вмісту GC-пар стабільність зростає. Термостабільність корелює з цим ефектом. Оскільки вода, завдяки ентальпійному члену, вносить основний внесок у ΔG, вона і визначає стабільність, а також термостабільність спіральних структур нуклеїнових кислот. Не дивлячись на те, що ступінь гідратації poly(rG)-poly(rC) нижче, ніж poly(rA)-poly(rU) (табл.1), його підвищена термостабільність визначається високим значенням ΔЕгідр (табл.3), оскільки молекули води зв'язуються з GC-комплексом більш міцними водневими зв'язками (рис.4).  Можливо, гідратне

Таблиця 4

Термодинамічні параметри конформаційних переходів НК,

індукованих зміною гідратації

оточення poly(rG)-poly(rC) більш жорстке, ніж poly(rA)-poly(rU). Це підтверджується даними РСА про довжини водневих зв'язків у водяних містках оліго- і полінуклеотидів AU- і GC-типу (Rich, 1976). Сильне зв'язування молекул води з GC-комплексом мабуть призводить до утворення вторинної гідратної оболонки, яка сприяє зберіганню первинної оболонки, і тим самим опосередковано стабілізує структуру poly(rG)-poly(rC). Про це свідчить істотне значення надлишкової енергії гідратації при 92-96% ВВ.

Величина зміни ентропії ΔS при Р→А або Р→В-переході НК (табл.4) за абсолютним значенням помітно менше, ніж при тепловому переході спіраль-клубок. Це свідчить про те, що НК при малому вмісті води (Р-форма) частково упорядковані.

У розділі 5 подано результати ІЧ-спектроскопічного дослідження плівок ДНК з тимуса теляти при різних значеннях ВВ в інтервалі температур від +20 до -1900С. Охолодження сухої плівки викликає зріст інтенсивності смуг поглинання ДНК, пов'язаний зі зміною заселеності коливальних рівнів. Для ДНК, зволоженої вище 50% ВВ (рис.5), зниження температури призводить до структурних змін, основною причиною яких є молекули води:

Рисунок 5

Рис.5. ІЧ-спектри плівок ДНК

при 86%ВВ та t = +200С и -1900С

-низькочастотні зсуви та зростання інтенсивності смуг поглинання фосфатних груп свідчать про підсилення водневого зв'язку вода-фосфат, яке призводить до локалізації молекул води на РО-групах і збільшенню жорсткості спіралі ДНК;

-високочастотні зсуви смуг поглинання дезоксирибози пов'язано з обмеженням псевдообертання фуранозного кільця внаслідок скорочення водневих зв'язків вода - сахар.

Слабка чутливість смуг поглинання азотних основ до зниження температури пов'язана, мабуть, з їх більш жорсткою локалізацією в структурі ДНК. Порівняння спектрів ДНК до охолодження і після відігріву свідчить про повну оборотність низькотемпературних структурних змін.

Для дослідження стану гідратної оболонки ДНК при низьких температурах отримано ІЧ-спектри частково дейтерованих плівок ДНК в області ОD-коливань води, яка зв’язана з ДНК. При ВВ<80% низькотемпературні спектральні зміни пов'язані з підсиленням водневого зв'язку вода-ДНК і вода-вода (рис.6,а). При 90%ВВ зниження температури призводить до появи піка, що відповідає льодоподібній фазі води (рис.6,б). Поділ смуг, що перекриваються, дозволив провести аналіз їхніх інтегральних інтенсивностей, який показав, що величини фракцій води, яка не вимерзає та тієї, що вимерзає, складають, відповідно, 12 і 3 молекули води на нуклеотид. Збільшення вмісту домішкової солі до 8% зменшує фракцію, що не вимерзає, до 9 молекул води на нуклеотид.

Шляхом екстраполяції низькотемпературного частотного зсува валентних коливань зв'язаної води до 10К оцінено, що зменшення довжин водневих зв'язків у ланцюжку з 3-5 молекул води призводить до скорочення поперечного розміру головного жолобка на 0,3-0,5А0, що раніше спостерігалося методом РСА (Дикерсон, 1982).

Рисунок 6

Рис.6. ІЧ-спектри ОD-коливань води, яка зв’язана з ДНК,

при 86% ВВ (а) і 90% ВВ (б) та температурах +200С і -1900С.

У додатку наведено значення спектральних параметрів смуг поглинання азотистих основ, отримані шляхом поділу смуг, що перекриваються в експериментальних спектрах.

ВИСНОВКИ

1. Методами ІЧ-спектроскопії і п'єзогравіметрії вивчено гідратно-залежний процес формування канонічних спіральних структур синтетичних полінуклеотидів і природних ДНК різного нуклеотидного складу та визначено центри їхньої гідратації. Виявлено, що інтервали структурних переходів залежать від вмісту GC-пар у зразку, однак А→В перехід для всіх вивчених ДНК відбувається при зв'язуванні більше 11 молекул води на нуклеотид.
2. Проведений квантово-хімічний розрахунок електронної щільності 5'-ГМФ⋅2Na+ показав, що переміщення іона Na+ відносно нуклеотида поряд із впливом гідратації може служити якісним поясненням спектральних змін, що спостерігаються на початковій стадії гідратації.
3. Отримано "енергетичні спектри" води, зв'язаної з НК. Ці залежності для всіх зразків, незалежно від нуклеотидного складу, мають монотонно-спадаючий характер. При збільшенні вмісту GC - пар взаємодія між молекулами води і НК підсилюється.
4. Вперше отримано експериментальні значення надлишкової енергії гідратації при формуванні А- і В-форм НК. Встановлено, що енергія гідратації моногідратного шару і повна енергія гідратації збільшуються з ростом вмісту GC-пар в ДНК. Незалежно від нуклеотидного складу для А→В переходу необхідні незначні витрати енергії.
5. Проведено оцінку внесків різних типів взаємодій в енергію стабілізації спіральних форм НК. Виявлено, що основним фактором, який стабілізує НК будь-якого АТ/GC-складу, є взаємодія молекул води з азотистими основами і сахарофосфатним ланцюгом (~70%). Внесок енергій водневих зв'язків в уотсон-криківських парах складає ~25%, інші типи взаємодій - не більше 5%.
6. При термодинамічному дослідженні переходів НК з неупорядкованого стану в А- і В-форми виявлено кореляцію між термостабільністю НК і зміною вільної енергії переходу. Оскільки вода за рахунок ентальпійного члена вносить основний внесок у вільну енергію, вона і визначає стабільність, а також термостабільність двоспіральних структур НК. Зміни ентропії свідчать про те, що при малому вмісті води НК знаходяться у частково упорядкованому стані.
7. Вивчення впливу низьких температур (до 80К) на зволожені плівки ДНК показало, що зниження температури призводить до оборотнього скорочення довжин водневих зв'язків між молекулами води і гідратно-активними центрами ДНК, а також у водяних містках, що є причиною зменшення поперечних розмірів жолобків. Підвищений вміст домішкової солі викликає зменшення кількості води, що не кристалізується при охолодженні.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Веревкин А.Г., Березняк Е.Г., Семенов М.А., Малеев В.Я. ИК-спектроскопическое изучение влияния низких температур на структуру и гидратацию ДНК // Проблемы криобиологии. - 1991. - №4. - С.5-10.
2. Семенов М.А., Малеев В.Я., Березняк Е.Г., Гасан А.И., Больбух Т.В. Гидратация и стабильность комплекса поли (rG)-поли (rC) // Мол.биология. - 1991. - Т.25. - №6. - С.1626-1634.
3. Березняк Е.Г., Семенов М.А., Больбух Т.В. Гидратация и стабильность нуклеиновых кислот с различным АТ и ГЦ - составом в конденсированном состоянии // Вісн.Харк.ун-ту. - 1998. - №410.Біофізичний вісн. Вип.1. - С.5-20.
4. Березняк Е.Г., Семенов М.А., Стариков Е.Б., Педаш Ю.Ф., Больбух Т.В., Матвеев Д.А., Малеев В.Я. ИК-спектроскопическое и квантово-химическое изучение гидратации динатриевой соли рибогуанозин-5'-монофосфата // Вісн.Харк.ун-ту. - 1998. - №422.Біофізичний вісн. Вип.2. - С.29-34.
5. Березняк Е.Г., Семенов М.А. Спектральные параметры нуклеотидов и полинуклеотидов в D2О. - Харьков: 1989. - 16с. (Препринт №379. / ИРЭ АН Украины).
6. Веревкин А.Г., Березняк Е.Г. ИК-спектроскопическое проявление гидратации и конформационного состояния ДНК при низких температурах // Тезисы докл. II межд. конф. "Молекулярные основы биотехнологии". - Пущино. - 1987. - С.7.
7. Веревкин А.Г., Березняк Е.Г., Семенов М.А., Малеев В.Я. Сравнительный анализ состояния нативной и денатурированной ДНК во влажных пленках при низких температурах // Тезисы докл. VI конф. по спектроскопии биополимеров. - Харьков. - 1988. - С.69-70.
8. Семенов М.А., Березняк Е.Г. ИК-спектроскопические особенности гидратации одно- и двуспиральных полинуклеотидов поли рГ и поли рЦ // Тезисы докл. VI конф. по спектроскопии биополимеров. - Харьков. - 1988. - С.264-265.
9. Веревкин А.Г., Березняк Е.Г., Семенов М.А., Малеев В.Я. Влияние низких температур на ион-гидратную оболочку и конформацию ДНК // Тезисы докл. межд. конф. "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины". - Харьков. - 1989. - С.12.
10. Семенов М.А. Березняк Е.Г. Гидратация, структурные переходы и стабильность нуклеиновых кислот в пленках // Abstr. of Conf. on physics of biological systems. - Pouskcha-Vodytsa, Kiev (Ukraine). - 1998. - P.37.
11. Семенов М.А., Больбух Т.В., БерезнякЕ.Г. Термодинамические аспекты взаимодействия нуклеиновых кислот с водой // Тезисы II съезда биофизиков России. - Москва (Россия) - 1999. - Т.1. - С.155.

АНОТАЦІЯ

Березняк К.Г. Вплив гідратації на стабільність спіральних форм нуклеїнових кислот різного AT/GC-складу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, Харків, 2000.

Методами ІЧ-спектроскопії та п'єзогравіметрії вивчено гідратно-залежний процес формування канонічних форм синтетичних полінуклеотидів і природних ДНК різного АТ/GC - складу, визначено центри їхньої гідратації та інтервали структурних переходів. Послідовний облік надлишкової енергії гідратації виявив основні типи взаємодій у системі нуклеїнова кислота - вода. Незалежно від нуклеотидного складу взаємодія молекул води з азотистими основами і сахарофосфатним ланцюгом складає 70-75% від загальної ентальпії стабілізації спіральних структур, водневі зв'язки в парах основ - 25-30%, інші типи взаємодій - близько 5%. Термодинамічний аналіз структурних переходів, індукованих зміною гідратації, показав, що підвищена термостабільність GC- збагачених зразків визначається їхньою взаємодією з молекулами води. Зміни ентропії свідчать про те, що при малому вмісті води (Р-форма) нуклеїнові кислоти частково упорядковані. Низькотемпературне дослідження вологих плівок ДНК показало, що основна причина зворотних структурних змін ДНК при охолодженні пов'язана з молекулами води гідратної оболонки. Оцінка зменшення довжин водневих зв'язків ДНК - вода і вода - вода пояснили причини скорочення поперечних розмірів жолобків ДНК внаслідок зниження температури. Виявлено залежність розміру внутрішньої гідратної оболонки від кількості домішкової солі.

Ключові слова: нуклеїнові кислоти, ІЧ-спектроскопія, гідратація, енергетика, стабільність, низькі температури.

АННОТАЦИЯ

Березняк Е.Г. Влияние гидратации на стабильность спиральных форм нуклеиновых кислот различного AT/GC-состава. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет им. В.Н.Каразина, Харьков, 2000.

Методами ИК-спектроскопии и пьезогравиметрии изучен гидратно-зависимый процесс формирования канонических форм синтетических полинуклеотидов и природных ДНК различного АТ/GC - состава, определены центры их гидратации и интервалы структурных переходов. Последовательный учет избыточной энергии гидратации выявил основные типы взаимодействий в системе нуклеиновая кислота - вода. Независимо от нуклеотидного состава взаимодействие молекул воды с азотистыми основаниями и сахарофосфатной цепью составляет 70-75% от общей энтальпии стабилизации спиральных структур, водородные связи в парах оснований - 25-30%, остальные типы взаимодействий - около 5%. Термодинамический анализ структурных переходов, индуцированных изменением гидратации, показал, что повышенная термостабильность GC- обогащенных образцов определяется их взаимодействием с молекулами воды. Изменения энтропии свидетельствуют о том, что при малом содержании воды (Р-форма) нуклеиновые кислоты частично упорядочены. Низкотемпературное исследование влажных пленок ДНК показало, что основной причиной обратимых структурных изменений ДНК при охлаждении являются молекулы воды гидратной оболочки. Оценка сокращения длин водородных связей ДНК-вода и вода-вода объяснила природу уменьшения поперечных размеров желобков при понижении температуры. Обнаружена зависимость размера внутренней гидратной оболочки от содержания примесной соли.

Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, ИК-спектроскопия, гидратация, энергетика, стабильность, низкие температуры.

SUMMARY

Bereznyak E.G. Influence of hydration on stability of helical forms of nucleic acids with different AT/GC - composition.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.02 - Biophysics. - Karazin National Kharkov University, Kharkov, 2000.

It is known that the structural state and stability of nucleic acids (NA) are determined by numerous factors such as interactions with water molecules and ions, hydrogen bonds in Watson - Crick pairs, interplanar interactions (so-called stacking interaction), hydrophobic and other types of interactions. Increasing recognition has recently been given to the concept according to which the stabilization of the helical structure of NA is provided with their interaction with a hydrate-ionic environment. This concept is based on the results of many experimental and theoretical studies of hydration behavior of NA in various conditions including the condensed state. Studies of a wide set of crystallohydrates of NA duplexes by X-ray diffraction have shown convincingly that the coupled water molecules are structural elements of their helical conformations. Encouraging results for the understanding of a role of water in stabilization of NA were obtained by Monte Carlo computer simulations. However, there are no systematic experimental data about energy of different type of interactions. In this paper the results of an experimental study of the influence of water on structure, structural transitions and stability of synthetic and natural NA are discussed. It has allowed to estimate the contributions of various types of interactions to total energy of the stabilization of helical structures of NA.

Infrared spectroscopy of synthetic polynucleotides and natural DNA of various nucleotide composition in the NA - water system with variable water content has been used to investigate the process of formation of NA structure and its hydration environment. From the analysis of the features of the frequencies and intensities of the absorption bands assigned to vibrations of the nitrogenous bases and sugar phosphate chain in the dependencies on relative humidity, three intervals of moisture have been found in which three structural states (the P-, A- and B-form) of NA are realized. The "energy spectrums" of bound water for NA with different AT/GC - composition have been found from the IR spectroscopic study of water sorbed on NA and also from the results obtained by piezogravimetry and calorimetry,. It is discovered that the binding energies decrease with the process of sorption of water molecules with the hydration-active centers of NA and connected water molecules. The water molecules form stronger H-bonds with the hydration-active centers of GC-enriched NA. An excess hydration energy for complex poly rG-poly rC and DNA from M.lysodeikticus has a significant value at the final stage of formation of hydration environments.

The consecutive account of an excess hydration energy on formation of the NA structures has revealed the basic types of interactions stabilizing the canonical A- and B-forms of NA. Foremost, it is the interaction of water molecules with the nitrogenous bases and sugar-phosphate chains of NA. It was found that the energy of this interaction (the contribution to total energy of stabilization of helical structure amounts to about 70%) does not depend either on the quantity of water molecules, forming of any structures, or on the AT- or GC-composition of the NA. The latter statement has been confirmed in X-ray research on hydrated duplexes, since the analysis of these data has shown that the lengths of H-bonds in water bridges depend on nucleotide composition. The contribution of energies of H-bonds in Watson - Crick pairs to total energy of stabilization of the A- and B-forms of NA, irrespectively of nucleotide composition, is estimated to be about 30%. According to our estimations, however, the stacking interaction and other types of interactions do not make considerable contributions to the total energy of stabilization of NA.

Thermodynamic studies of the transition from the monohydration state into the helical A- and B-forms was carried out with the purpose of revealing the contribution of water molecules to the thermostability of the NA and determining their structural state under conditions of low water content. Interest in the study of the structural state of the monohydration form is connected to the problem of the choice of conditions for long-term preservation of NA. It was found that the values of the free energy change at a structural transition depends on the nucleotide composition: with increase of GC-composition the stability grows. Thermostability correlates with this effect. Due to the presence of the enthalpy term, water brings the largest contribution to the free energy and hence it should determine the stability and thermostability of double-helical structures of NA. Estimation of the entropy changes of the P→A or P→B transition testifies the fact that, irrespective of nucleotide composition, NA in the monohydration state are partially ordered.

Thus, our results demonstrate that the hydration environment plays a determining role in the formation and stabilization of helical structures of NA with various nucleotide compositions and in their dynamic behavior.

The effect of low temperatures (to 80K) on the absorption spectra of nitrogen bases, sugar-phosphate chain and bound water in humid films of thymus DNA was studied. It has been found that the decrease of temperature leads to a reversible shortening of the hydrogen bonds between water molecules and phosphate groups, thus narrowing the DNA grooves. A detailed analysis of water spectra at low temperatures allowed to determine the amounts of frozen and unfrozen water of the DNA hydrate environment versus the composition of the DNA-water-ions system. This appears to be important for choice of optimum conditions for preservation of NA.

Key words: nucleic acids, IR-spectroscopy, hydration, energetics, stability, low temperatures.