СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Борзова Н.В., Маланчук В.М., Варбанец Л.Д., Школьный А.Т., Соколова Е.В., Харкевич Е.С., Жданова Н.Н., Нагорная С.С. Скрининг продуцентов α-Ν-ацетилгалактозаминидазы среди микроорганизмов различных таксономических групп // Мікробіол. журн. – 2000.– 62, №5. – С.3-13.
2. Борзова Н.В., Маланчук В.М., Варбанец Л.Д., Сейфуллина И.И., Зубков С.В. Оптимизация условий культивирования Aspergillus niger для синтеза α-Ν-ацетилгалактозаминидазы и α-галактозидазы // Мікробіол. журн. – 2001.- 63, № 4. – С.27-36.
3. Борзова Н.В. Вплив деяких цукрів на синтез α-N-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази Aspergillus niger // Науковий вісник Ужгородського університету. – Серія “Біологія” - № 10. -Ужгород, 2001. – С. 130-132.
4. Сейфуллина И.И., Марцинко Е.Э., Батракова О.Л., Борзова Н.В., Иванко Е.В., Варбанец Л.Д. Влияние координационных соединений германия на синтез и активность ферментов // Мікробіол. журн. – 2002. - 64, №4. – С. 3-11.
5. Борзова Н.В., Варбанец Л.Д., Маланчук В.М., Школьный А.Т., Жданова Н.Н. Грибная α-Ν-ацетилгалактозаминидаза // Материалы международной конференции “Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия” (Мінськ, 1-2 червня 2000) –Тез. доп.: Минск, 2000. – С.106-107.
6. Борзова Н.В., Маланчук В.М., Варбанец Л.Д., Сейфуллина И.И., Зубков С.В. Производные гуанидина – индукторы синтеза α-Ν-ацетилгалактозаминидазы и α-галактозидазы // Бюллетень інс-ту сільсько-господарської мікробіології – Чернігів – 2000. -№ 7. – С.26-27.
7. Сейфуллина И.И., Марцинко Е.Э., Батракова О.Л., Борзова Н.В., Иванко Е.В., Варбанец Л.Д. Координационные соединения германия как эффекторы синтеза и активности ферментов // Материалы XX международной Чугаевской конференции по координационной химии (Ростов-на-Дону, 25-29 червня 2001г.)- Тез.доп.: Ростов-на-Дону, - 2001. – С. 401.
8. Borzova N.V., Varbanets L.D., Seifullina I.I., Zubkov S.V. α-Galactosidase and α-N-acetylgalactosaminidase of Aspergillus niger // Glycoconjugate J. - XVI International Symposium on Glycoconjugates: Proc. (Hague, Netherlands, 19-24 August, 2001). –2001. - V. 18, № 1/2. – P. 108.
9. Borzova N.V., Malanchuk V.M., Varbanets L.D. The studies of functional groups of fungal α-galactosidases active center // 11th European carbohydrate symposium Eurocarb XI – Proc. (Lisboa, Portugal, 2-7 September, 2001) – Lisboa, 2001. – P. 385.
10. Борзова Н.В., Варбанец Л.Д. Выделение и характеристика грибных гликозидаз — α-N-ацетилгалактозаминидазы и α-галактозидазы //Укр. біохім. журн. – 2002. – 74, № 4б. - Матеріали VIII Українського Біохімічного з’їзду (Чернівці, 2002) – С.151.
АНОТАЦІЯ
Борзова Н.В. α-N-ацетилгалактозамінідаза та α-галактозидаза Aspergillus niger 185ш. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2003.
Дисертація присвячена виділенню та дослідженню ферментного препарату з α-Ν-ацетилгалактозамінідазною та α-галактозидазною активностями. Штам-продуцент A. niger 185ш було відібрано в результаті поетапного скринінгу серед 1514 культур мікроміцетів, бактерій та дріжджів. Було вивчено трофічні потреби продуцента та вплив різних факторів на процес біосинтезу позаклітинних α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази. Були виявлені ряд природних (суха бичача кров, глюкоза, мальтоза та сахароза) та синтетичних (гуанідин карбонат, нітроаміногуанізон саліцилового та диметиламінобензальдегідів, координаційні сполуки германію з янтарною та оксіетилімінодіоцтовою кислотами) речовин, здатних спричиняти активуючий вплив на біосинтез ферментів. Додавання цих сполук до середовища росту збільшувало секрецію α-Ν-ацетилгалактозамінідази та α-галактозидази на 50 – 200 %. Здійснена очистка в 600 разів та отримано ферментний препарат з α-галактозидазною та α-Ν-ацетилгалактозамінідазною активностями 25 та 10,5 Е/мг білка, відповідно. Були досліджені фізико-хімічні та каталітичні властивості ферменту, специфічність його дії. Встановлено, що препарат характеризується високим вмістом гідрофобних та кислих амінокислот, а також присутністю манози, галактози, глюкозаміну та двох неідентифікованих гексозамінів в його вуглеводному компоненті. Фермент проявляє вузьку специфічність щодо глікону. α-Ν-ацетилгалактозамінідазна та α-галактозидазна активності препарату A. niger 185ш інгібуються відповідними синтетичними субстратами та продуктами реакції: Ν-ацетилгалактозаміном та D-галактозою. Молекула ферменту не містить атомів металу. α-Ν-Ацетилгалактозамінідазна реакція активується іонами германію (ІV) на фоні пригнічення α-галактозидазної активності ферменту. Показано, що в активному центрі глікозидази присутні карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти та імідазольна група гістидину. Сульфгідрильні групи не беруть участі у каталізі, але відіграють важливу роль у підтриманні активної конформації білкової молекули. Препарат ферменту був нетоксичним, але проявляв пірогенні властивості. Встановлено серологічну спорідненість між ферментом A. niger та α-галактозидазою С. cladosporioides.
Ключові слова: α-Ν-ацетилгалактозамінідаза, α-галактозидаза, Aspergillus niger, очистка, фізико-хімічні властивості, каталітична активність.
АННОТАЦИЯ
Борзова Н.В. α-N-ацетилгалактозаминидаза и α-галактозидаза Aspergillus niger 185ш. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2003.
Диссертация посвящена выделению и исследованию ферментного препарата с α-Ν-ацетилгалактозаминидазной и α-галактозидазной активностями. Штамм-продуцент A. niger 185ш был получен в результате поэтапного скрининга, проведенного среди 1514 культур микромицетов, бактерий и дрожжей. Выделенный продуцент A. niger 185ш характеризовался наиболее высоким уровнем α-Ν-ацетилгалактозаминидазной и α-галактозидазной активности в культуральной жидкости, а также отсутствием α-фукозидазной активности. Для увеличения выхода ферментов были изучены трофические свойства продуцента, а также исследовано влияние различных факторов на процесс биосинтеза α-Ν-ацетилгалактозаминидазы и α-галактозидазы. Были выявлены ряд природных (сухая бычья кровь, глюкоза, мальтоза, сахароза) и синтетических (гуанидин карбонат, нитроаминогуанизон салицилового и диметиламинобензальдегидов, координационные соединения германия с янтарной и оксиэтилиминодиуксусной кислотами) веществ, способных оказывать активирующий эффект на продукцию ферментов культурой A. niger 185ш. Было показано, что внесение этих соединений в среду роста увеличивало секрецию искомых гликозидаз на 50-200 %. Для получения высокоочищенного препарата были использованы методы препаративной биохимии: фракционирование сульфатом аммония (30 и 90 % насыщения), гель-фильтрация и анионообменная хроматография на TSK-гелях, рехроматография на сефарозе 6В. В результате получили очищенный в 600 раз с выходом 28 % ферментный препарат, удельная α-Ν-ацетилгалактозаминидазная активность которого составила 10,5 Е/мг белка, а α-галактозидазная - 25 Е/мг белка. Препарат был гомогенным: по данным гель-фильтрации на сефарозе 6В его молекулярная маса составила 430 кДа, ДСН-ПААГ - 70 кДа, что даёт основание предположить олигомерное строение молекулы фермента. Установлено, что молекула фермента характеризуется высоким содержанием гидрофобных (около 30 %) и кислых (20 %) аминокислот. В препарате также отмечено присутствие углеводного компонента (около 10 %), который представлен незаряженными (манноза, галактоза) и заряженными (глюкозамин, два неидентифицированых гексозамина) моносахаридами. Термо- и рН-оптимумы гидролиза ферментом нитрофенильных субстратов находились при 60о С и рН 3,5-4,1. Препарат стабилен в диапазоне температур 0о-20о С, рН - 3,0-7,0, устойчив при хранении. Ферментный препарат проявляет узкую специфичность относительно гликона. α-Ν-ацетилгалактозаминидазная и α-галактозидазная активности препарата A. niger 185ш ингибируются соответствующими синтетическими субстратами и продуктами реакции: Ν-ацетилгалактозамином и D-галактозой. Изученная гликозидаза является металлонезависимым ферментом, молекула которого не содержит атомов металла. Показано, что α-Ν-ацетилгалактозаминидазная реакция активируется ионами германия (ІV) на фоне уменьшения α-галактозидазной активности фермента. В активном центре молекулы фермента присутствует карбоксильная группа С-концевой аминокислоты (возможно аспарагиновой или глутаминовой) и имидазольная группа гистидина. Вблизи активного центра присутствуют сульфгидрильные группы, которые, хотя и не участвуют в катализе, однако играют важную роль в поддержании активной конформации молекулы фермента, обеспечивая проявление α-галактозидазной активности. Показано, что препарат фермента нетоксичный (500 мг/кг), однако пирогенный (0,04 мг/кг). Установлено серологическое сродство между ферментом A. niger и α-галактозидазой С. cladosporioides.
Ключевые слова: α-Ν-ацетилгалактозаминидаза, α-галактозидаза, Aspergillus niger, очистка, физико-химические свойства, каталитическая активность.
ABSTRACT
Borzova N.V. α-N-acetylgalactosaminidase and α-galactosidase of Aspergillus niger 185ш. – Manuscript.
The thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.07 – microbiology.- Institute of microbiology and virology named D.K. Zabolotny of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2003.
The thesis is focused on the isolation and investigation of enzyme with α-Ν-acetylgalactosaminidase and α-galactosidase activity. The screening for α-Ν-acetylgalactosaminidase among 1514 cultures of micromycetes, yeast and bacteria permit to select strain-producer A. niger 185ш. Its trophic characteristics examined and different factors for their effect on the process of biosynthesis of extracellular α-Ν-acetylgalactosaminidase and α-galactosidase have been investigated. A number of natural (dry bovine blood, glucose, maltose and sucrose) and synthetic (guanidine carbonate, nitroaminoguanizone dimethylbenzaldehyde and nitroaminoguanizone salicilic aldehyde, germanium complexes with succinic and oxyethyliminodiacetic acids) agents possess increasable effect on synthesis of the above mentioned enzymes (50-200 %). The enzyme was purified about 600-fold, activity of α-Ν-acetylgalactosaminidase and α-galactosidase in enzyme preparation were 10,5 and 25 U/mg protein, respectively. The molecular weight of the enzyme was estimated to be 430 kDa and 70 kDa by gel filtration and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, respectively. Enzyme preparation including high content of the dicarbonic and hydrophobic aminoacids and carbohydrate component, containing the mannose, galactose, glucosamine and two nonidentified hexosamines. Enzyme was found to exhibit strict specificity towards the glycon. α-Ν-acetylgalactosaminidase and α-galactosidase activity of A. niger enzyme was inhibited by corresponding synthetic substrates and reaction products – Ν-acetylgalactosamine and D-galactose. There are absent groups containing the atoms of metals in the enzyme molecule. Glycosidase active center appears to contain the carboxyl group and imidazole histidine group. Sulfhydryl groups are not involved in the catalysis; however, it's possible they may play essential role in supporting the active conformation of the protein molecule. Preparation of enzyme was nontoxic, but pyrogenic. Serological relationship between A. niger enzyme and C. cladosporioides α-galactosidase was found.
Key words: α-Ν-acetylgalactosaminidase, α-galactosidase, Aspergillus niger, purification, physical and chemical properties, catalitic activity.
|
