Для дослідження глікозаміноглікан-зв’язуючої активності мембранних білків in vitro не можна застосовувати непрямий метод твердофазного вуглевод-ферментного аналізу (ВФА), оскільки присутність тритону Х-100 в концентрації більш ніж 0,05% гальмує сорбцію білків полістиролом більш ніж на 50%. У таких випадках необхідно застосовувати конкурентний спосіб ВФА. Присутність тритона Х-100 у діапазоні концентрації 0-1% у буфері під час інкубації сорбованих білків із гіалуронат-ферментним кон’югатом не змінює істотно спорідненість цих білків до вуглеводу. Тільки за умов збільшення вмісту детергенту до 2 % гіалуронат-зв’язуюча активність білків починає вірогідно знижуватися.
Для дослідження вуглевод специфічної спорідненості сечовинорозчинних білків можна застосовували непрямий метод ВФА, у разі розведення проб в 20-40 разів. У випадках низької концентрації загального білка у цих зразках необхідно застосовувати також конкурентний варіант ВФА.
Використання додецилсульфата натрію для екстракції мембранних білків із подальшим визначенням глікозаміноглікан-зв’язуючої активності не можливо, тому що даний аніонний детергент навіть у концентрації 0,03% повністю блокує спорідненість білків до відповідних вуглеводів.
Зв’язування специфічного кон’югату з дослідними компонентами необхідно проводити в умовах низької іонної сили (концентрація як Са2+, так й Mg2+ не повинна перевищувати 4 мМ, оптимальна концентрація Na+ чи К+ 60 мМ становлять для гепарансульфата та 20 мМ – для гіалуроната).
Указані вище умови, найсприятливіші й для проведення гістохімічного забарвлення зрізів мозку за допомогою визначених кон’югатів.
Розподіл глікозаміноглікан-зв’язуючих білків у мозку під час ембріогенезу. На 6-13 добу ембріонального розвитку щура гепарансульфат-, й гіалуронат-зв’язуючі білки зосереджені у вентрикулярному шарі нервової трубки. При збільшенні мікроскопічного зображення в області вентрикулярного шару клітин видно, що глікозаміноглікан-зв’язуючі центри в найбільшій кількості присутні в області навколо плазматичної мембрани проліферуючих та мігруючих клітин. Дослідження гістохімічних зрізів голови ембріонів людини 6 - 7 тижнів розвитку показали, що розподіл ГАГ-зв’язуючих компонентів у мозкових міхурах співпадає за характером із таким у мозку щурів під час ембріогенезу (рис. 4).
Найбільша кількість центрів зв’язування гепарансульфату та гіалуронату також виявлена у вентрикулярному та субвентрикулярному шарах нервової трубки, де клітини інтенсивно діляться й мігрують.
Кількісний аналіз підтвердив вуглеводгістохімічні дані про найвищий рівень глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків мозку на самих перших етапах морфогенезу, під час активної проліферації й міграції клітин. Глікозаміноглікан-зв’язуюча здібність білків мозку під час ембріогенезу на три порядки вище за таку у дорослої людини. Оскільки на гістохімічних зрізах було чітко видно зосередження глікозаміноглікан-зв’язуючих компонентів саме в областях плазматичної мембрани нервових клітин, був проведений диференційований аналіз гепарансульфат та гіалуронат-зв’язуючої здібності білків у мембраноасоційованій, мембранній та екстрацеллюлярній фракціях із мозку ембріонів людини. Як для гепарансульфату, так і для гіалуронату найбільша кількість рецепторів виявлена у мембранній фракції (рис. 5).
Рис. 5. Гепарансульфат (А)- та гіалуронат (Б)-зв’язуюча активність білків мозку ембріонів та дорослої людини у мембраноасоційованій (1), мембранній (2) та екстрацелюлярній (3) фракціях; n=8-12.
Розподіл глікозаміноглікан-зв’язуючих білків у мозку під час постнатального розвитку. На момент народження щурів у мозку визначається значне зменшення кількості центрів зв’язування для гепарансульфату та гіалуронату. Найбільше ГАГ-зв’язуюча активність виявляється тільки в областях де продовжується проліферація й міграція нервових клітин. Характер локалізації цих сайтів схожий з таким на 21 добу ембріогенезу щурів .
Найбільша щільність пофарбованих клітин спостерігається в гермінативних зонах, навколо IV шлуночку мозку (вентрикулярний та субвентрикулярний шари). Також висока гепарин/гепарансульфат-зв’язуюча активність білків була виявлена в субвентрикулярній зоні латерального шлуночку мозку й у прилеглих областях кори великих півкуль і гіпокампу.
Головною субклітинною структурою, що мала високу гепарансульфат-зв’язуючу активність, було клітинне ядро, що, можливо, вказує на присутність гепарансульфат- зв’язуючих білків у ядрі й участі у регуляції біосинтезу білків. У молекулярному шарі кори мозочка, що формується, крім клітинних ядер, незначно офарбовувався міжклітинний матрикс (рис. 6).
А Б
ЗГШ ЗГШ
ВГШ ВГШ
Протягом перших 4 діб спостерігається різке зниження інтенсивності фарбування гепарансульфат-зв’язуючих центрів. У мозку новонароджених щурів область найвищої гіалуронат-зв’язуючої активності білків співпадає з областями високої гепарансульфат-зв’язуючої активності й характерна для періплазматичного та міжклітинного простору та значна менша для ядерних компонентів гранулярних клітин (рис. 7). Зниження гіалуронат-зв’язуючої активності у мозку щура у перші дні постнатального розвитку також відбувається дуже швидко. На 5 добу після народження високий вміст гіалуронат-зв’язуючих центрів визначається тільки в апікальному конусі росту клітин Пуркін’є під час перших етапів формування дендритного дерева, а також у навколоклітинному просторі.
На 10 добу постнатального розвитку в мозку щура вдається визначити слабке забарвлення місць зв’язування гіалуроната тільки у міжклітинного просторі.
Дані кількісного аналізу свідчать про специфічність субклітинного розподілу гепарансульфат-зв’язуючих білків у мозку ссавців під час постнатального розвитку.
Твердофазний вуглеводферментний аналіз за чутливістю перевищує на два порядки вуглеводгістохімічний аналіз. Тому можна визначити ступінь зв’язування вуглеводів у фракції білків із мозку щурів на пізніх етапах постнатального розвитку, тоді як на зрізах мозку тварин цього віку не можна чітко візуалізувати цей параметр. Згідно отриманим результатам у новонароджених щурів загальна гепарансульфат-зв’язуюча активність білків мозочка у середньому на 25% вища ніж у великих півкулях.
У фракціях мембранних білків із мозочка новонароджених щурів середній рівень загальної гепарансульфат-зв’язуючої активності складає 8 нг зв’язаного гепарансульфату на 1 мг загальної кількості білка, а у гіпокампі – 6 нг зв’яз. ГП/мг ЗБ. У фракціях сечовинорозчинних білків рівень досліджуваного параметра складає десь 500 та 370 нг зв’язаного гепарансульфату/мг загального білка у мозочку та великих півкулях, відповідно (рис. 8). Таким чином, рівень загальної гепарансульфат-зв’язуючої активності сечовинорозчинних білків у мозку новонароджених щурів більш ніж у 60 разів перевищує рівень загальної гепарансульфат-зв’язуючої активності мембранних білків.
Рис. 8. Динаміка загальної гепарансульфат-зв’язуючої активності розчинних (1), мембраноасоційованих (2), мембранних (3) та сечовинорозчинних екстрацеллюлярних/цитоскелетних (4) білків із мозочка (А) та великих півкуль щурів протягом 30 діб постнатального розвитку (n=12-16).
Термін активної проліферації клітин та міграції у досліджуваних структурах мозку відрізняється. У великих півкулях активна фаза цих процесів відбувається під час ембріогенезу, на відміну від мозочка, котрий у щурів активно розвивається протягом 2 тижнів після народження.
Кількісний аналіз указує на різке зниження гепарансульфат-зв’язуючої активності у мозку щурів протягом перших 5 діб до досягнення на 20 добу найнижчого рівня цього параметра, який підтримується постійним у дорослих тварин за нормальних умов. Порівняльний аналіз указує на вагомий внесок у загальну гепарансульфат-зв’язуючу активність сечовиннорозчинних білків з екстрацелюлярної/цитоскелетної фракції. За наявністю значного зниження загальної здатності до зв’язування гепарансульфата у мозку щура на 30 добу постнатального розвитку у порівнянні з новонародженими найбільший внесок у загальний показник надають все одно сечовиннорозчинні білки та білки мембранної фракції (рис. 9).
Оскільки вагомий внесок у рівень загальної гепарансульфат-зв’язуючої активності білків мозку дорослих щурів належить сечовинорозчинним компонентам було досліджено данний параметр у різних відділах мозку самців та самиць окремо. У всіх відібраних відділах мозку загальна гепарансульфат-зв’язуюча активність сечовинорозчинних білків не перевищувала 25 нг зв’яз. ГП/мг ЗБ (рис. 10).
Тобто була більш ніж у 40 разів меншою за даний рівень активності сечовинорозчинних білків із мозку новонароджених щурів.
Як у самців, так і у самиць найбільша активність зв'язування гепарансульфату специфічними білками була виявлена в стріатумі, а найменша - у середньому мозку. У самиць значний рівень даної активності був визначений у гіпокампі, тоді як у самців у гіпокампі, корі великих півкуль, мозочку й у варолієвому мості рівні активності практично збігалися. У всіх відібраних відділах мозку дорослих щурів, за винятком гіпокампу, загальна гепарансульфат-зв’язуюча активність білків була у середньому на 22% вища у самців, ніж у самиць.
Дослідження загальної гіалуронат-зв’язуючої активності білків в отриманих фракціях із мозочка та великих півкуль мозку щурів показали схожу динаміку здатності білків мозку щодо специфічного зв’язування гіалуронату під час розвитку (рис. 11).
Рис. 11. Динаміка загальної гіалуронат-зв’язуючої активності розчинних (1), мембраноасоційованих (2), мембранних (3) та сечовинорозчинних екстрацеллюлярних/цитоскелетних (4) білків із мозочка (А) та великих півкуль (Б) щурів протягом 30 діб постнатального розвитку (n=12-16).
Найвищий рівень гіалуронат-зв’язуючої активності зареєстрований у фракції сечовинорозчинних білків із мозочка новонароджених щурів, що складав у середньому
4 мкг зв’яз. гіалуроната (ГК) / мг ЗБ. Аналіз субклітинного розподілу гіалуронат-зв’язуючої активності у фракціях, отриманих із мозочка та великих півкуль, вказує на вагомий внесок мембранних та мембраноасоційованих білків у загальний показних афінності до гіалуронату на відміну від гепарансульфатспецифічних білків. Ці данні підтверджуються попередньо отриманими гістохімічними даними стосовно розподілу гіалуронат-зв’язуючих сайтів саме у періплазматичних областях мігруючих нервових клітин. Порівняльний аналіз загальної гіалуронат-зв’язуючої активності білків на 0 та 30 добу постнатального розвитку вказує на перерозподіл даної властивості між мембранними та мембраноасоційованими компонентами (рис. 12).
Одночасні, незалежні дослідження кількісного субклітинного розподілу гепарансульфат- та гіалуронат специфічних білків у мозочку та великих півкулях мозку щурів й їх гістохімічне підтвердження надають можливість сформувати уявлення про специфіку розподілу цих білків під час раннього постнатального розвитку мозку та визначити їх незмінний рівень у мозку дорослих осіб за нормальних умов. Отримані дані вказують на те, що в процесах постнатального розвитку мозку у першу чергу значну роль відіграють мембранні й екстрацелюлярні макромолекули, що мають ГАГ-зв’язуючі домени. Накопичення гіалуронату в міжклітинному матриксі збігається зі стадіями клітинної міграції, коли гіалуронат обумовлює високу гідратованість й проникливість матриксу, що сприяє руху клітин. Мігруючі клітини використовують різні специфічні рецептори (наприклад, ламінін/еластинові рецептори, інтегрини і т.д.) для забезпечення свого руху. На додаток до цього експресія незайнятих рецепторів гіалуронової кислоти може дозволяти клітинам взаємодіяти з вільним гіалуронатом і транспортувати сигнал крізь гіалуронат-збагачений екстрацелюлярний матрикс. Іншим важливим аспектом взаємодії гіалуронату з гіаладгеринами, цілком ймовірно, є формування міжклітинного матрикса шляхом іммобілізації гіалуроната специфічними білками. Відношення зв'язаного гіалуроната до його вільної форми збільшується в міру розвитку мозку. Отже, у процесі розвитку під час клітинної міграції у легко проникному матриксі може активуватися мобілізація гіалуроната, що створює стерічні перешкоди для міграційних сигналів до клітини. Крім самого гіалуроната в утворенні конденсованого матрикса беруть участь як мембрані рецептори цього глікозаміноглікана, так і молекули міжклітинного матриксу.
Вплив глікозаміногліканів на морфогенез нейронів у культурі. Дослідження біохімічних механізмів морфогенезу нервових клітин мають велике значення не тільки в плані розуміння розвитку нервової системи, але й для розробки ефективних заходів терапії нейродегенеративних випадків, як успадкованих (наприклад, хвороба Альцгеймера), так й вторинне придбаних (травми, пухлини, інфекції). Техніка культури нейронів надає можливість в умовах in vitro змінювати хімічні складові системи, де нервові клітини проходять головні етапи морфогенезу: диференціацію, ріст аксонів й дендритів, синаптогенез. З метою дослідження впливу гіалуронату та гепарансульфату на морфогенез окремих нейронів була застосована первинна дисоційована культура нейронів гіпокампу низької щільності.
Згідно попередніх результатів найвища кількість гіалуронат-зв’язуючих білків знаходиться у навколомембранній області та у міжклітинному матриксі. Тому подалі ми визначили вплив вільного гіалуроната, присутнього в субстраті, на морфогенез нейронів гіпокампу (рис. 13).
Нейрони вирощувалися на субстраті з полі–L-лізином, куди додавали різну кількість гіалуроната (діапазон концентрації від 0 до 20 мкг гіалуроната на 1 мл субстрату). Культури нейронів досліджували за допомогою інвертованого мікроскопа та імуногістохімічного забарвлення фіксованих культур нейронів із використанням антитіл проти нейрофіламенту Н (Affinity Inc., Great Britain). Наявність вільного гіалуроната в міжклітинному матриксі призводило до збільшення спорідненості нейронів до субстрату, що підтверджується збільшенням кількості нейронів, що прикріпилися.
Згідно отриманим даним адгезивність нейронів гіпокампу до субстрату знаходиться не в прямій залежності від кількості гіалуроната, а має куполоподібний характер. Проблема полягає у багатоскладовому комплексі, що визначає ступінь адгезії однієї клітини до другої in vivo. Зараз накопичуються експериментальні дані про вплив окремих складових цього комплексу, що модулюють поведінку клітини під час морфогенезу. Отримані нами дані з експерименту на культурі нейронів гіпокампу дали можливість припустити модуляторну адгезивну властивість гіалуронату, за рахунок чого можна контролювати перші етапи морфогенезу. Пізніше, у 2002 році, експерименти Zimmerman та співавторів підтвердили наші припущення. Авторами був продемонстрований вплив гіалуроната на процеси адгезії А6 клітин до кальцій-(R,R) та (S,S)-тартрат тетрагідратних кристалів. Вони показали, що обробка гіалуронідазою епітеліальних клітин нирок із Xenopus luevis перед посадкою їх на субстрат значно знижує ступень адгезії. Знижену адгезію клітин, що були оброблені гіалуронадазою, можна частково або повністю поновити додаванням екзогенного гіалуроната. Але, надмірне збільшення екзогенного гіалуроната у вільній від сироватки рідині (10-1000 мкг/мл), що використовувалася для попередньої обробки клітин перед посадкою, призводить до гальмування адгезії клітин.
Гіалуронат є довгий лінейний глікозаміноглікан, який складається тільки з повторів дисахариду, що містить глюкуронову кислоту та N-ацетилглюкозамін. Молекула такої довжини є добрий кандидат для забезпечення взаємодії клітин із поверхнею. Кожна молекула гіалуронату може мати масу до декілька мільйонів дальтон та довжину десь 10 мкм, але це не характерне для фізіологічних умов у біологічних тканинах. Однак, Laurent (1992) указував на те, що одна молекула гіалуроната може простиратися на декілька мікронів від поверхні, до якої клітина торкається чи сорбується.
Отримані нами дані свідчать про те, що гіалуронат впливає не тільки на ступінь адгезії нейронів до субстрату, але й на термін морфогенезних подій. Нейрони, що були сорбовані на субстрат в умовах присутності гіалуроната, залишалися значно довгий час в округлій формі (указані стрілками, рис. 14), ріст аксонів та дендритів починався пізніше ніж у нейронів контрольних культур. Затримка початку диференціації спричинила збільшення терміну життя нейронів у культурі. У контрольній культурі на 30 году культивування нейрони вже диференційовані гинули в умовах низької щільності. За умов присутності у субстраті гіалуроната спостерігалося збільшення кількості недиференційованих нейронів, які були диференційовані пізніше, на 30 годину культури. Детальне дослідження нейронів офарбованих проти нейрофіламенту Н указує на те, що нейрони, котрі сорбовані на субстрат у присутності гіалуроната, мають більш інтенсивне забарвлення на нейрофіламент Н, ніж контрольні нейрони. На основі цих даних можна припустити, що гіалуронат впливає не тільки на адгезивність нейронів за рахунок взаємодії з мембранними рецепторами, але й може передавати сигнал про модифікацію цитоскелету, що також важливо під час морфогенезу нейронів.
Субстрат-зв’язані та вільні екстрацелюлярні молекули впливають на різні складові регуляторного ланцюга під час контролю розміру та полярності нейронів (Lochter et al., 1991).
Контрольна
культура
| 
