АНОТАЦІЯ
Задорожна М.Б. Роль α-2-антиплазміну на різних етапах фібринолітичного процесу. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Київ, 2006.
Дисертацію присвячено дослідженню регуляторної ролі α-2-антиплазміну – основного інгібітору плазміну – на різних етапах фібринолітичного процесу.
Виявлено, що в утворенні комплексу плазміну з α-2-антиплазміном приймають участь лізинзв’язувальні ділянки кринглів 1-3, 4, 5 та ділянка серин-протеїназного домену молекули ферменту, відмінної від активного центру. Багатоцентрова взаємодія плазміну з α-2-антиплазміном забезпечує специфічність та ефективність дії інгібітора. Результати вивчення кінетики інгібування α-2-антиплазміном амідолітичної активності плазміну, міні- та мікро-плазміну показали, що кринглові домени молекули ферменту не є необхідними для процесу інгібування, але контролюють швидкість реакції між плазміном та α-2-антиплазміном.
Вперше показано, що α-2-антиплазмін взаємодіє з фібрин(оген)ом за відсутності активованого фактора ХІІІ. Ділянки зв’язування розташовані в D-доменах молекули фібрин(оген)у в зоні D-D-контакту.
Встановлено інгібуючий вплив α-2-антиплазміну на процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині і, як наслідок, на лізис фібринових згустків.
Показано, що α-2-антиплазмін утворює комплекс з тканинним активатором плазміногену за участі лізинзв’язувальної ділянки кринглу 2 молекули активатора. Комплексоутворення не супроводжується зміною амідолітичної активності тканинного активатора. Інгібітор не впливає на взаємодію тканинного активатора плазміногену з фібрином.
Запропоновано дві моделі, що пояснюють інгібуючий вплив б-2-антиплазміну на процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині.
Розроблено новий спосіб одержання б-2-антиплазміну, що дозволяє в один етап з плазми крові людини, виснаженої на плазміноген, виділити інгібітор без домішок гістидинбагатого білка.
Ключові слова: б-2-антиплазмін, плазміноген, плазмін, фібрин, тканинний активатор плазміногену, процес активації.
АННОТАЦИЯ
Задорожная М.Б. Роль б-2-антиплазмина на различных этапах фибринолитического процесса. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. – Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины. Киев, 2006.
Диссертация посвящена исследованию регуляторной роли б-2-антиплазмина – основного ингибитора плазмина – на различных этапах фибринолитического процесса.
Установлено, что в образовании комплекса плазмина с б-2-антиплазмином участвуют лизинсвязывающие участки кринглов 1-3, 4, 5 и область в серин-протеиназном домене молекулы фермента. Многоцентровое взаимодействие обеспечивает специфичность и эффективность действия ингибитора. С использованием специфического хромогенного субстрата плазмина S2251 исследована кинетика ингибирования б-2-антиплазмином амидолитической активности плазмина и его функционально активных производных: мини- и микро-плазмина. Полученные результаты свидетельствуют, что крингловые домены молекулы плазмина не являются необходимыми для процесса ингибирования, но контролируют скорость реакции фермента с ингибитором.
Впервые показано, что б-2-антиплазмин без участия активированного фактора ХІІІ взаимодействует с фибрин(оген)ом. Исследование проводилось с использованием принципа иммуно-ферментного анализа и меченных биотином белков. Ингибитор выявляет сродство к фибриногену, дезАА-, дезААВВфибрину, D- и Х-фрагментам фибриногена, D-димеру фибрина, но не связывается с Е-фрагментом.
Изучение влияния б-2-антиплазмина на процесс активации Glu-плазминогена тканевым активатором на фибрине и фрагментах фибрин(оген)а показало, что ингибитор снижает скорость активации на фибрине, DDЕ-комплекске, D-димере и не влияет – на бромциановом фрагменте фибриногена Ho1-DSK. На основании полученных данных и величин констант диссоциации взаимодействия ингибитора с дезААВВфибрином (68,6 нМ), D-фрагментом (119,0 нМ) и D-димером (65,0 нМ) сделан вывод о локализации участков связывания ингибитора в D-домене молекулы фибрина в зоне D-D-контакта.С использованием метода турбидиметрии показано увеличение в присутствии б-2-антиплазмина времени полулизиса фибринового сгустка плазмином, образующимся при активации Glu-плазминогена тканевым активатором.
Показано, что образование комплекса б-2-антиплазмина с тканевым активатором плазминогена опосредовано лизинсвязывающим участком крингла 2 молекулы активатора и не сопровождается блокированием активного центра фермента. Ингибитор незначительно снижает величину связывания тканевого активатора с фибрином.
Таким образом, б-2-антиплазмин, связываясь с фибрином, ингибирует процес активации Glu-плазминогена тканевым активатором и последующий лизис фибринового сгустка.
Эффект б-2-антиплазмина на процесс активации можно объяснить созданием стерических препятствий для взаимодействия профермента и его активатора или конформационными изменениями в молекуле тканевого активатора при образовании его комплекса с б-2-антиплазмином, приводящими к снижению способности активировать плазминоген.
Предложен новый способ выделения б-2-антиплазмина из плазмы крови человека. Использование двух форм кринглов 1-3 молекулы плазминогена позволяет без дополнительных этапов очистки получить высокоактивный ингибитор без примеси близкого по молекулярному весу гистидинбогатого белка.
Ключевые слова: б-2-антиплазмин, плазминоген, плазмин, фибрин, тканевой активатор плазминогена, процесс активации.
SUMMARY
Zadorozhna M.B. Role of б-2-antiplasmin in different stage of fibrinolytic process. – Manuscript.
Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – Biochemistry. – Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 2006.
The thesis describes the investigation of the role of б-2-antiplasmin – main inhibitor of plasmin – in different stage of fibrinolysis. Participation of kringles 1-3, 4 and 5 lysine-binding sites and region of serine-proteinase domain different from active site in complex plasmin-б-2-antiplasmin formation was demonstrated. The multisites interaction between plasmin and б-2-antiplasmin provides for the specificity and efficiency of the inhibitor action. Study of inhibition plasmin, mini- and micro-plasmin amidolytic activity by б-2-antiplasmin showed that kringle domains are not necessary for the inhibition, but control the rate of reaction between enzyme and inhibitor.
б-2-antiplasmin interacts with fibrin(ogen) without actived factor XIII. Binding sites of the inhibitor are localized in D-domain molecule fibrin(ogen) in D-D contact zone. It was established that б-2-antiplasmin inhibits of the Glu-plasminogen activation by tissue activator on fibrin and subsequent lysis of fibrin clot are inhibited as well.
Kringle 2 lysine-binding site of tissue activator molecule takes part in complex formation wiht б-2-antiplasmin. The complex formation doesn’t change amidolytic activity of tissue plasminogen activator. Inhibitor doesn’t influence on tissue activator interaction with fibrin. It was proposed two models for explanation of the б-2-antiplasmin effect on the Glu-plasminogen activation by tissue activator on fibrin.
Purification of б-2-antiplasmin from human plasma using two form kringles 1-3 of plasminogen without histidine-rich glycoprotein contamination was developed.
Key words: б-2-antiplasmin, plasminogen, plasmin, fibrin, tissue plasminogen activator, process of activation.
| 
