У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у розробці та селекції нових ліній трансгенних рослин Arabidopsis thaliana та отримано результати, які дозволяють зробити наступні висновки:
1. Отримані лінії ТР Arabidopsis thaliana, чутливі до хімічних чинників, можуть використовуватися як модельний об'єкт, для підвищення ефективності тестування мутагенів довкілля.
2. Встановлено гени, які регулюють структуру хроматину - RPD3, S1R2, SU(VAR) 3-7. Розроблено методичний підхід до створення конструкцій генів RPD3, S1R2, SU(VAR) 3-7 із векторами pMEX, pTA7002, BinAR.
3. Методом агробакгеріальної трансформації отримано 25 ліній ТР Arabidop sis thatiana з генами RPD3, S1R2 та SU(VAR) 3-7, що було підтверджено сегрегаційним методом і Саузерн-аналізом.
4. В експерименті з обробкою проростків трансгенних рослин різними концентраціями MMS, MN, MNU, дексаметазону і мітоміцину С проведено тестування всіх трансгенних ліній Arabidopsis thaliana на чутливість до хімічних мутагенів. Гістохімічним аналізом на реставрацію β-глукуронідазного гена виявлено незначне зменшення явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації під впливом MMS, MN, MNU, дексаметазону та підвищену чутливість проростків ТР до мітоміцину С.
5. Проведення експериментів впливу тяжких металів (кадмію, міді, хрому, кобальту, нікелю) на частоту гомологічної рекомбінації підтвердило чутливість 2 транс генних ліній: N1DC4 no.561 pMEX/SiR2 №2, NlDC4 no.561 pMEX/SiR2 №4. За ступенем генетичних ефектів солі тяжких металів складають ряд мутагенної дії: кадмій > кобальт > мідь > хром > нікель.
6. Інкубація проростків ТР із трихостатином А змінює здатність рослинного генома до проникнення Т-ДНК. Проростки, вирощені у середовищі з ТСА, мали підвищену ефективнісгь трансформації, порівняно з контролем, від 23,47 до 37,90 % залежно від лінії Arabidopsis thaliana.
7. При пророщуванні насіння трансгенних рослин ліній. Соl-О BinAR/SIR2-8, Col-0 BinAR/SIR2-7, BAR BinAR/RPD3-1, BAR BinAR/RPD3-9, N1DC4 no.561 pTA/ SiR2-2, NlDC4 no.561 pTA/SiR2-3, NlDC4no.561 pMEX/SiR2-2, N1DC4 no.561 pMEX/ SiR2-4 у зразках грунтів із хімічно забруднених зон (міста Івано-Франківськ, Калуш, Бурштин), встановлено виражені зміни фенотипу та зменшення частоти відновлення GUS гена порівняно з контролем (Верховинський район).
8. У лініях трансгенних рослин N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-2 і N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-4 не виявлено підвищення числа рекомбінаційних явищ під впливом хімічних мутагенів. Вони можуть використовуватися в подальших експериментах по отриманню генетичне модифікованих рослин, стійких до хімічних сполук.
СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Орел Н.О. Вплив генів-регуляторів хроматинової структури на стабільність рослинного геному // Наукові записки Тернопільського педагогічного інституту. Серія: Біологія. - 2000.-№ 3 (10). - С.31-35.
2. Орел Н.О. Вплив трихостатину А на рівень частоти трансформацій в Arabidopsis thaliana // Наукові записки Тернопільського держ. педінститу. Серія: Біологія. - 2002 -№2(17).-С.85-89.
3. Orel N., Puchta H.. Differences in the processing of DNA ends in Arabidopsis thaliana and tobacco: possible implication for genome evolution// Plant Molecular biology. - 2003. -Vol. 51.- P.523-531. Особистий внесок складає 60%. Він полягає у виділенні і дослідженні ДНК, статистичній обробці даних частоти ІГР, кореляційному аналізі.
4. Orel N., Kink A., Puchta H. Speciel-specifik differences in the repair of double-strand breaks in plants are due to diferences in the processing of DNA ends // 6 Gatersleben Research Conference. Plant Cenetic Resources in the Genomis Era: Genetic Diversity, Genome Evolution and New Applications. - 2002.- March 07 to 11. - S.85. Особистий внесок складає 30%. Він полягає у розробці методики отримання трансгенних ліній рослин, експериментах з класичними мутагенами для вивчення репараційних процесів ДНК.
5. Orel N., Sluchyk V., Sluchyk I. Use of transgenic plants at system of environment ecogenetic monitoring // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. Abstracts book. - Kyiv.- 2001. - September 20-22. - S.I 24. Особистий внесок складає 50%. Він полягає у розробці чутливих до хімічних мутагенів трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana, визначенні частоти явищ гомологічної рекомбінації за кількістю та розподілом синіх плям.
6. Kovalchuk L., Orel N.O., Tdjuk P. Application of the plant-based test-systems for the estimation of the mutagenic background intensivenes // Abstracts 30th Annual Meeting ofEEMS.- Budapest- 2000.-P.81. Особистий внесок складає 30%. Він поляж у отри манні насіння трансгенних ліній рослин, визначенні частоти явищ гомологічної рекомбінації.
7. КовальчукЛ.Є, Случик В.М., Орел Н.О., Телюк П.М„ Шутак B.I., Козовий Р.В. Комплексна рослинна тест-система визначення мутагенів у довкіллі та ризику для здоров'я населення // Довкілля та здоров'я. - 2003. - №2(25). - С.74. Особистий внесок складає 20%. Він полягає у визначенні частоти явищ ІГР ДНК трансгеиних рослин, пророщених на зразках грунтів різних екологічних районів Прикарпаття.
8. Ковальчук Л.Є., Орел Н.О., Ковальчук О.В., Козовий Р.В., Телюк П.М., Кочерга З.Р. Комплексна система оцінки впливу антропогенного забруднення довкілля на спадковий апарат живих організмів // Матер. конф. "Ангропогенно змінене середовище України: Ризики для здоров'я та екологічних систем".- Київ. - 2003. - С.56 Особистий внесок складає 20%. Він полягає у молекулярно-генетичному аналізі трансгенних рослин на виявлення репараційних процесів ДНК.
9. Ковальчук Л.Є., Козовий Р.В. Орел Н.О. Розробка тест-системи для оцінки впливу іонізуючого опромінення на основі трансгенних рослин // Тези III з'їзду з радіаційних досліджень. - Київ. - 2003. - С.41. Особистий внесок складає 20%. Він полягає у визначенні частоти явищ гомологічної рекомбінації ДНК трансгенних рослин, опромінених радіоактивним кобальтом.
10- Ковальчук Л.Є., Орел Н.О. Розробка та використання генетичне модифікованих рослин для оцінки реальних навантажень забруднення довкілля // Матер. наук. -практ-конф. "Актуальні питання гігієни та екологічної безпеки України". - Київ. -2003. - С. 28-30. Особистий внесок складає 50%. Він полягає у проведенні експерименту по впливу на репараційні процеси ДНК трансгенних рослин солей важких металів, визначенню частоти гомологічної рекомбінації у рослин пророщених на зразках грунтів хімічно забруднених територій.
11. Ковальчук Л.Є, Козовьш Р.В., Орел Н.А., Кочерга З.Р. Разработка й внедрение комплексной тест-системы для оценки экогенетических эффектов ионизирующей радиации// Матер. научн.-практ. конф. "Медицинские и экологические зффекты ионизирующего излучения". Северск-Томск. - 2003.-С. 94-%. Особистий внесок складає 20%. Він полягаєу визначенню впливу іонізуючої радіації на репараційні процеси ДНК трансгенних рослин.
Подано Деклараційний патент України на винахід №52183А. МПК А61В10/00 Спосіб тестування антропогенного забруднення довкілля//Л.Є. Ковальчук, Н.О.Орея, Р-В. Козовий. Заявлено 12.03.2003.
АНОТАЦІЯ
Орел Н.О. Розробка трансгеннихліній Arabidopsis thaliana чутливих до хімічних мутагенів. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15. - генетика. - Інститут гігієни та медичної екологін ім. О.М.Марзе-єва АМН України, Киів, 2003.
Розроблено методологію отримання 25 трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana з генами RPD3, SIR2, SU(VAR) 3-7, які регулюють структуру хроматину. Створено конструкції цих генів із векторами pMEX, pTA7002, BinAR. Досліджено чутливість трансгенних ліній до різних концентрацій хімічних мутагенів. Гістохімічним аналізом на реставрацію β-глукуронідазного гена виявлено незначне зменшення явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації під впливом MMS, MN, МNU, дексаме-тазону та підвищену чутливість проростків ТР до мітоміцину С. Встановлено, що солі тяжких металів впливають на репаративні процеси ДНК 2 трансгенних ліній: N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-2, N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-4. За ступенем генетичних ефектів солі тяжких металів складають ряд за активністю мутагенної дії: кадмій > кобальт > мідь > хром > нікель. Доведено, що трихостатином А підвищену ефективність трансформації залежно від лінії Arabidopsis thaliana.
Обгрунтовано використання отриманих ліній ТР, чутливих до хімічних чинників, як модельного об'єкта, для підвищення ефективності тестування мутагенів довкілля.
Ключові слова: трансгенні рослини Arabidopsis thaliana, гени-регулятори структури хроматину, гомологічна рекомбінація, хімічні мутагени.
АННОТАЦИЯ
Орел НА. Разработка трансгенных линий Arabidopsis thaliana чувствитепьных к химическим мутагенам. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15. - генетика. - Институг гигиены и медицинской экологии им. О.М. Марзеева АМН Украини, Киев, 2003.
Разработана методология получения 25 трансгенных линий растений Arabidopsis thaiianac генами RPD3, SIR2, SU(VAR) 3-7, которые регулируют структуру хроматина. Созданы конструкции этих генов с векторами pMEX, pTA7002, BinAR. Исследована чувсгвительность трансгенных линий к разным концентрациям химических мутагенов:
MMS, MN, MNU, дексаметазона и митомицина С. Гистохимическим анализом на реставрацию β-глукуронидазного гена (GUS гена) выявлено незначительное уменьшение явлений интрахромосомной гомологической рекомбинации под влиянием MMS, MN, MNU, дексаметазона и повышенную чувствительность проростков ТР к митомицину С. Установлено, что соли тяжелых металлов влияют на репаративные процессы ДНК 2 трансгенных линий: N1DC4 no.561 pMEX/Si2-2, N1DC4 no.561 pMEX/Si2-4. По степени активности генетических эффектов соли тяжелых металлов составляют ряд: кадмий > кобальт > медь > хром > никель.
Доказано, что инкубация проростков ТР с трихостатином А изменяет способ-ность растительного генома к проникновению Т-ДНК. Растения, проросшие в среде с добавлением ТСА, имели повышенную эффективность трансформации, по сравне-нию с контролем, от 23,47 до 37,90 % в зависимости от линий Arabidopsis thaliana.
При проращивании семян трансгенных растений линий Col-0 BinAR/SIR2-8, Col-0 BinAR/SIR2-7, BAR BinAR/RPD3-1, BAR BinAR/RPD3-9, N1DC4 no.561 pTA/ SiR2-2, N1DC4 no.561 pTA/SiR2-3, N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-2, N1DC4 no.561 pMEX/ SiR2-4 в пробах почв химически загрязненных зон (города Ивано-Франковск, Калуш, Бурштин), установлено вираженные изменения фенотипа и уменьшение частоты во-становдения GUS гена по сравнению с контролем (Верховинский район). В линиях TPN1DC4 no.561 pMEX/SIR2-2 і N1DC4 no.561 pMEX/SIR2-4 не выявлено повышения количества рекомбинационных явлений под воздействием химических мутагенов. Эти линни могут использоваться в последующих экспериментах по разработке генетически модифицированных растений, устойчивых к химическим соединениям.
Обосновано использования полученных линий ТР, чувствительных к химическим факторам, в качесгве модельного обьекта для повышения эффективности тестирования мутагенов окружающей среды.
Ключевые слова: трансгенные растения Arabidopsis thaliana, гены-регуляторы структуры хроматина, гомологичная рекомбинация, химические мутагены.
ANNOTATION
Orel N.O. Work out transgenic lines Arabidopsis thaliana perceptible to chemical. mutagents. - Manuscript.
The dissertation for a candidate's degree in Biology, specialty 03.00.15 - genetics (biological science). -A.N. Marzeev's Institute for Hygiene and Medical Ecology of Ukrainian Academy of Medicine. - Kiev, 2003.
The methodology developing of 25 transgenic plant lines of Arabidopsis thaliana were given. Three genes, which regulating chromatin structure and taking part in homologous recombination (RPD3, SIR2, SU(VAR)3-7) were mapped and cloned in vectors pMEX, pTA7002 and BinAR. Sensitivity transgenic lines to different concentration of chemical mutagenes were tested. Histochemical analysis for restoration of functional β-glucuronidase gene reveals insignificant reduction of the phenomena inrtachromosome homologous recombination under treatment with MMS, MN, MNU, dexametason and the raised sensitivity of TP to the Mitimicyn С. The influence of heavy metals on frequency of homologous recombination confirmed sensitivity of 2 transgenic lines: N1DC4 no.561 pMEX/Si2-2, N1DC4 no.561 pMEX/Si2-4. Mutagemcity of heavy metals on genetic effects make an activity line: cadmium > cobalt > copper > chrome > nickel. It is proved, that trichostatin A increased efficiency of transformation in Arabidopsis thaliana.
It is substantiated using of received sensitive to chemical factors transgenic lines, as modelling object, for increase of efficiency of testing мутагенов an environment,
The carried out experiments showed the expediency of developing the new plant tests-systems for estimation of chemical environmental contamination.
Key words transgenic plants Arabidopsis thaliana, genes-regulators of chromatfai structure, homologous recombination, chemical mutagenes.
| 
