АННОТАЦИЯ
Сытник Е.С. Разработка модельной системы получения транспластомных растений на примере представителей семейства паслёновых. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2004.
В диссертационной работе предложен и разработан новый подход к осуществлению пластидной трансформации. Подход состоит в создании с помощью соматической гибридизации цибридных растений с ядром растений имеющих высокую регенерационную способность и пластидами интересующих растений, но имеющих низкую регенерационную и трансформационную способность; генетической трансформации пластид созданных цибридных растений и переносе их в клетки того же вида, которому принадлежат пластиды или в клетки другого вида, ядро которого совместимо с данным пластомом.
На первом этапе экспериментов с помощью метода обработки протопластов полиэтиленгликолем выполнили трансформацию хлДНК ранее созданых цибридных растений Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis) и Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata). Трансформацию осуществляли векторной конструкцией с селективным геном aadA (ген аминогликозид-3`-аденилтрансферазы), окруженным гомологическими последовательностями хлДНК ( геном rpl32 (рибосомальный белок) и геном trnL (тРНК лейцина) малой уникальной области пластома табака), что обеспечивает встраивание трансгена в определенную область пластома.
Второй этап экспериментов состоял в переносе с помощью соматической гибридизации трансгенных пластид из цибридных растений Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) в растения Salpiglossis sinuata дикого типа. Для отбора необходимых продуктов слияния (растений с ядром Salpiglossis sinuata и трансгенным пластомом Salpiglossis sinuata) развитие одного из родителей, донора хлоропластов (транспластомное цибридное растение Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata)) инактивировали облучением γ-лучами в дозе 500 – 600 Гр (источник - Со60, 0,1 Гр/сек). Деление протопластов второго родителя, растения Salpiglossis sinuata дикого типа, предотвращали добавлением в питательную среду селективного антибиотика спектиномицина.
С четырьмя отбранными на селективной среде растениями был осуществлен молекулярно-биологический анализ ядерной, хлоропластной и митохондриальной ДНК. Анализ подтвердил присутствие трансгена в пластоме отобранных растений, показал, что растения имеют пластом Salpiglossis sinuata, а митохондриальная ДНК унаследована как от растений N. tabacum так и от растений S. sinuata. ПЦР-анализ и рестриктный анализ ряда областей ядерной ДНК, а также анализ множественных молекулярных форм ферментов амилазы и эстеразы показал, что во всех случаях фрагменты ДНК транспластомных растений S. sinuata идентичны тем, которые синтезируются с ДНК растений S. sinuata дикого типа и отличаются от фрагментов табака.
В следующей серии экспериментов получили транспластомные растения табака и перенесли с помощью соматической гибридизации трансгенные хлоропласты табака в растения Lycium barbarum. Для этих експериментов использовали векторную конструкцию с селективным геном aadA и репортерным геном uidA (ген β-глюкуронидазы). Гены находяться между последовательностями psbA (D1 белок фотосистемы ІІ) и trnH (тРНК гистидина) большой уникальной области пластома табака. В результате экспериментов была отобрана одна колония, которая через восемь месяцев культивирования на регенерационной селективной среде дала пять регенерантов. Морфологически растения-регенеранты похожи на растения Lycium barbarum дикого типа. Молекулярно-биологический анализ колонии показал, что ген aadA присутствует в пластоме, пластиды унаследованы от табака, а ядро – от Lycium barbarum. Гистохимический анализ активности гена β-глюкуронидазы в тканях листа дал специфическую синюю окраску, что подтверждает наличие экспрессии uidA гена.
Ключевые слова: табак, паслёновые, цибрид, протопласт, пластидная трансформация, соматическая гибридизация, ген аминогликозид-3`-аденилтрансферазы, ген β-глюкуронидазы.
SUMMERY
Sytnyk K.S. Development of model system of transplastomic plants receiving by the example of Solanaceae family representatives.- Manuscript.
Thesis for a PhD degree (Biology) by speciality 03.00.20 – biotechnology. – Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.
The thesis is devoted to development of a new approach to recalcitrant species plastid transformation. We studied plastid transformability of remote cytoplasmic hybrids (cybrids) that combine nucleus of tobacco, an easily transformable species, and plastids of other, recalcitrant Solanaceae species. In such experiments tobacco cells used as a transformable intermediary host. In present work, we carried out genetic transformation of plastids of cybrid Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis) and Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) plants. The vector plasmid that contains selective aadA gene (aminoglycoside 3`-adenylyntransferase) flanked by rpl32 (ribosomal protein) and trnL (tRNA-Leu) genes of tobacco plastome for targeting aadA gene to this specific region of chloroplast genome was used. Second stage of our experiments was transferring by somatic hybridization Salpiglossis sinuata transgenic chloroplasts from cybrid plants to wild type Salpiglossis sinuata plants.
The next series of our experiments consists in creation of transplastomic tobacco plants and transferring by somatic hybridization transgenic tobacco plastids to Lycium barbarum plants. For these experiments vector plasmid that contains selective aadA gene and reporter uidA (gene that encode β-glucuronidase) was used.
Key words: tobacco, Solanaceae, cybrid, protoplast, plastid transformation, somatic hybridization, aminoglycoside 3`-adenylyntransferase, β-glucuronidase.
| 
