Рис. 9. Динаміка вмісту розчинної форми білка адгезії нервових клітин NCAM в структурах головного мозку щурів, що зазнали дії гемічної гіпоксії. I - кора великих півкуль; II - гіпокамп; III - смугасте тіло; IV - середній мозок; V - мозочок; VI - варолієв міст.
А - контрольні щури; Б - щури, що зазнали дії гемічної гіпоксії.
* - P < 0,05 при порівнянні з досліджуваним показником на 3 добу.
Рис. 10. Динаміка вмісту NCAM під час постнатального розвитку щурят, матері яких зазнали гемічної гіпоксії:
I - кора головного мозку; II - мозочок; III - середній мозок; IV - варолієв міст.
А - контрольні щури; Б - щурята, матері яких зазнали гемічної гіпоксії.
* - P < 0,05, при порівнянні із величиною досліджуваного параметру на 1 добу.
У варолієвому мості динаміка вмісту розчинної форми білка адгезії нервових клітин мала один максимум - збільшення на 82% на 9 добу після дії нітрита натрія. Головний мозок під час розвитку є особливо чутливим до кисневого голодування, тому, як і очікувалось, в структурах головного мозку щурят, матері яких зазнали дії гемічної гіпоксії, відбувався більш істотний перерозподіл білка адгезії нервових клітин NCAM внаслідок зменшення її вмісту в корі великих півкуль (рис. 10). На 6 та 12 добу постнатального розвитку, тобто у період, коли найбільш інтенсивно ідуть процеси міграції нейронів, у цьому мозковому утворенні зниження вмісту мембранної форми NCAM складало 78% та 30%, відповідно, а розчинної форми – 40% на 6 добу при порівнянні з контролем. Зміни вмісту NCAM можуть сприяти порушенню процесів синаптогенезу, що особливо важливо при розвитку та формуванні ЦНС (Edelman G. et al., 1998; Козяр В.С. и др., 1994; Moase C.E. et al., 1991).
Вміст NCAM у сироватці крові щурів після опромінення та впливу гемічної гіпоксії. Зниження концентрації NCAM, характерне для головного мозку в процесі розвитку та старіння організму, спостерігається також і в сироватці крові щурів (рис. 11), що погоджується з літературними даними (Krog L. et al., 1992; Neubauer C. et al., 1990). Подібна динаміка зміни вмісту NCAM у мозку та сироватці крові може свідчити на користь припущення про мозкове джерело цього нейроспецифічного білка в крові, хоча в невеликих концентраціях NCAM присутній в нервових клітинах інших органів (Березин В.А., Белик Я.В., 1990), а також на поверхні NK-кілерів (Lanier L.L. et al., 1991).
Рис. 11. Вміст NCAM в сироватці крові щурів під час постнатального розвитку:
а) - дані кількісного визначення NCAM методом імуноферментного аналізу;
б) - дані имуноблотінга, що вказують на присутність двох ізоформ NCAM.
Одним з важливих питань при дослідженні білків ЦНС в сироватці крові є питання про їх спроможність проходити через гематоенцефалічний бар‘єр (ГЕБ). Молекулярна маса та фізико-хімічні властивості перешкоджують проходженню NCAM через це утворення. Отримані нами дані свідчать, що найбільш висока концентрація NCAM у сироватці крові спостерігається протягом першого місяця постнатального розвитку, що, можливо, зумовлено формуванням самого ГЕБ. Існує думка, що функціональна зрілість бар‘єру настає перед народженням. Але, з іншого боку, специфічні властивості в транспорті макромолекул до мозку ембріону і в неонатальному періоді підтримують гіпотезу про незрілість ГЕБ у цей час (Горбань В.А., 1992). У деяких ділянках мозку, а саме у гіпофізі, епіфізі та підбугор’ї, ГЕБ як специфічне бар’єрне утворення відсутній (Siegel J. et al., 1999). У період функціональної зрілості ГЕБ вміст NCAM у сироватці крові є невеликим і, можливо, підтримується за рахунок немозкових джерел цього білка.
Рис. 12. Динаміка вмісту NCAM в сироватці крові щурів після:
а) - впливу одноразового (1) та фракціонованого (2) опромінення в дозі 0,25 Гр;
б) – впливу гемічної гіпоксії;
в) – впливу пренатальної гемічної гіпоксії.
- контроль; - щури, які зазнали гемічної гіпоксії.
Порушення гомеостазу головного мозку внаслідок дії будь-яких факторів фізичної або хімічної природи, як і порушення проникливості ГЕБ - це фактори, що можуть привести до появи більшої кількості нейроспецифічних білків у сироватці крові. Одним з таких агентів є іонізуюча радіація (Rubin et al., 1994; Trnovec T. et al., 1990).
Аналізуючи динаміку вмісту NCAM у сироватці крові після одноразового та фракціонованого опромінення, слід відзначити її фазність. Тривалість періодів фазності виявилася різною: ранній період після одноразового опромінення був більшим, ніж після фракціонованого опромінення (рис. 14). Звертає на себе увагу той факт, що динаміка концентрації NCAM у сироватці крові та у головному мозку опромінених тварин подібні. Цей факт дозволяє припустити, що головний мозок є джерелом NCAM, який виявляється в сироватці крові.
Схожість динаміки вмісту NCAM спостерігається не для всіх структур головного мозку, а тільки для кори великих півкуль та гіпокампа. Інші автори також спостерігали різну проникність ГЕБ у різних регіонах мозку після радіаційного впливу (Qin D.X. et al., 1990; Cicciarello R. et al., 1990; Lo E.H. et al., 1992). Це дає можливість запропонувати метод визначення рівня NCAM у сироватці крові для встановлення ступеня розвитку патологічних процесів у головному мозку, що були спричинені радіацією.
Висновки
1. Методом твердофазного імуноферментного аналізу із застосуванням моноспецифічної поліклональної антисироватки встановлено, що розподіл білка адгезії нервових клітин NCAM у стуктурах головного мозку дорослого організму є нерівномірним. Найвищий вміст цього нейроспецифічного білка виявлений в гіпокампі та смугастому тілі, найнижчий – у середньому мозку та варолієвому мості. Рівень та внутрішньоклітинний розподіл NCAM у структурах головного мозку щурів залежали від статі тварин (у корі великих півкуль самок вміст мембранної форми був вищим у 2,9 разів).
2. Після тотального одноразового рентгенівського опромінення в дозі 25 сГр виявляються зміни вмісту мембранної та розчинної форм NCAM у структурах головного мозку тварин обох статей, які носять фазний характер: максимум підвищення вмісту NCAM відмічений через 12 та 168 годин після опромінення. Встановлено перерозподіл білка NCAM на користь розчинної форми у середньому мозку та варолієвому мості після опромінення.
3. Виявлено зміни вмісту NCAM у структурах головного мозку щурів обох статей після фракціонованого (1 сГр протягом 25 днів) рентгенівського опромінення у дозі 25 сГр. На відміну від виявленого ефекту після одноразового опромінення, зміни вмісту NCAM були менш виражені в усіх структурах головного мозку, а їх фазний характер спостерігали лише у корі великих півкуль та смугастому тілі.
4. Встановлено, що після фракціонованого рентгенівського опромінення самок у дозі 25 сГр відбуваються зміни динаміки вмісту мембранної та розчинної форм NCAM у структурах головного мозку народжених ними щурят під час постнатального розвитку: у корі великих півкуль спостерігали найнижчий рівень цього білка, який становив 50% від контролю.
5. Вміст метгемоглобіну в крові щурів зростав як після введення нітриту натрія, так і після рентгенівського опромінення. Встановлено, що максимального рівня даний показник досягав на 5 добу після одноразового та фракціонованого опромінення і складав, відповідно, 14,75% та 8,54% при порівнянні з контролем, що свідчить про розвиток гемічної гіпоксії.
6. Встановлено, що внутрішньоклітинний перерозподіл та підвищення вмісту NCAM у корі великих півкуль та гіпокампі дорослих щурів спостерігаються на 3 та 9 добу після введення нітриту натрія.
7. За умов пренатальної гемічної гіпоксії відбувався перерозподіл мембранної форми білка адгезії NCAM у структурах головного мозку щурів під час постнатального розвитку, – вміст цієї форми NCAM у корі великих півкуль зменшувався на 30%, а у мозочку підвищувався на 50% відносно контролю.
8. Встановлено, що за умов пренатального стресового впливу відбуваються зміни вмісту мембранної форми NCAM у структурах головного мозку, а саме: мозочку, гіпокампі, варолієвому мості виявлено підвищений вміст цього білка на 124%, 79%, 66%, відповідно, проте у корі великих півкуль - зменшення на 30%, що свідчить про перерозподіл цієї форми NCAM на користь мозочка.
9. Вплив іонізуючого опромінення та гіпоксії спричиняє підвищення концентрації NCAM у сироватці крові щурів, динаміка якої є подібною до зміни вмісту цього нейроспецифічного білка у структурах головного мозку. Це дає можливість запропонувати метод імуноферментного визначення рівню NCAM у сироватці крові як додаткового біохімічного діагностичного тесту для з’ясування ступеню розвитку патологічних процесів в головному мозку, що були спричинені радіацією та гіпоксією.
Список опублікованих за темою дисертації робіт
1. Лещинська І.О., Чорна В.І. Вміст молекули клітинної адгезії NCAM в головному мозку щурів, яких піддавали пренатальному стресу // Нейрофизиология. - 1999. - Т. 31, № 2. - с. 167-168.
2. Лещинская И.А., Дука Т.И., Черная В.И. Поведенческие реакции и содержание нейроспецифических белков в мозге крыс после однократного радиационного воздействия // Нейрофизиология. - 2000. - Т.32, №1. - С.28-22.
3. Дука Т.И., Лещинская И.А., Черная В.И. Влияние гемической гипоксии средней тяжести на содержание NCAM и ГФКБ в развивающемся мозге и мозге взрослых животных // Доповіді НАН України. - 2000. - № 4. - с. 164 - 170.
4. Leshchins’ka I.A., Duka T.I., Chornaya. V.I. The sexual difference of NCAM and GFAP levels in rat brain after irradiation of 0,25 gy X-ray singly. // 29th Annual Meeting Society for Neuroscience (abstracts). - USA, Miami, 1999. - V. 25, P.1. - Р. 217.
5. Duka T.I., Leshchins’ka I.A., Chornaya V.I. The ncam and gfap level of rats brain after hemic hypoxic injury // 29th Annual Meeting Society for Neuroscience (abstracts). - USA, Miami, 1999. - V. 25, P.1. - Р. 570.
6. Duka T.I., Leshchins’ka I.A., Kudersky A.V., Chornaya V.I. The ncam and gfap level of rats brain after prenatal hemic hypoxic injury // The Int. conference for Students Young Physicians (abstracts). - Lviv, 1999. - P. 104.
7. Leshchyns’ka I.A., Duka T.I., Chornaya V.I. The sexual difference of NCAM and GFAP levels in rat brain and blood serum after irradiation of 0,25 Gy X-ray singly // FENS Winter School. Abstr. - Austria, 1999.
8. Duka T.I., Leshchyns’ka I.A., Chornaya V.I. The ncam and gfap level in rats brain after hemic hypoxic injury // FENS Winter School. Abstr. - Austria, 1999.
9. Leshchyns’ka I.A., Duka T.I., Shapovalova M., Chornaya V.I. The NCAM, GFAP and S100b levels in blood serum of low dose X-irradiated rats // J. Neurochemistry. - 1999. - V.73, suppl. - S58A.
Лещинська І.О. Розподіл білка адгезії нервових клітин NCAM в структурах головного мозку за умов дії іонізуючої радіації в малій дозі. Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2001 р.
Дисертація присвячена вивченню ролі нейроспецифічного білка NCAM у механізмах регуляції морфо-функціонального стану головного мозку за умов дії рентгенівського випромінювання в малій дозі (25 сГр), а також реалізації вторинних ефектів іонізуючої радіації. Встановлено, що у нормі білок адгезії NCAM, який опосередковує адгезивні взаємодії нервових клітин за гомофільним та за гетерофільним механізмами, неоднаково розподілений у структурах головного мозку щурів різної статі. Після тотального рентгенівського опромінення в дозі 25 сГр виявлені фазні зміни вмісту мембранної та розчинної форм NCAM в структурах головного мозку тварин обох статей, вираженість яких залежала від типу опромінення, терміну пострадіаційного періоду та мала свої особливості у структурах головного мозку. Після одноразового опромінення в дозі 25 сГр відбувається більш суттєвий перерозподіл NCAM ніж після фракціонованого. Вплив іонізуючого випромінювання в дозі 25 сГр спричиняє підвищення рівню метгемоглобіна, що свідчить про розвиток гемічної гіпоксії. За умов експериментальної гемічної гіпоксії відбувається тимчасовий перерозподіл NCAM в структурах головного мозку. Мозок під час постнатального розвитку виявився більш чутливим до гіпоксичного ушкодження за гемічним типом. Вплив іонізуючого випромінювання та гіпоксії спричиняє підвищення вмісту NCAM в сироватці крові щурів, динаміка якого східна до зміни концентрації цього нейроспецифічного білка в структурах головного мозку. Це дає можливість запропонувати метод імуноферментного визначення рівню NCAM в сироватці крові в якості додаткового біохімічного діагностичного тесту для з’ясування ступеню розвитку патологічних процесів в головному мозку, що були спричинені радіацією.
NCAM, ІФА, структури головного мозку, іонізуюча радіація, гемічна гіпоксія
Leshchyns’ka I. A. Distribution of the neural cell adhesion molecule NCAM in different brain structures after low-dose X-ray irradiation. Manuscript.
Dissertation for the defense of the PhD degree according to the specialty 03.00.04 – biochemistry. – Kiev Taras Shevchenko national university, Kiev, 2001.
The dissertation work investigates the role of the neurospecific protein NCAM in the mechanisms that regulate structural and functional state of the brain under the influence of low-dose X-ray irradiation (25 cGy) and during development of the secondary effects of ionizing radiation. It is shown that under the normal conditions adhesion molecule NCAM, that mediates homophilic and heterophilic adhesive interactions between neurons, is non-uniformly distributed in different structures of the brain in rats of different sex. Levels of membrane and soluble forms of NCAM change periodically after the total 25 cGy X-ray irradiation in different brain structures in rats of both sexes. Magnitude of these changes depends on the type of irradiation protocol, time interval after the irradiation, and is different in various brain structures. Redistribution of NCAM in different brain structures is more pronounced after single 25cGy irradiation than after fractionated one. Ionizing 25 cGy radiation leads to increase of methhemoglobin level that is an indication of the development of the hemic hypoxy. A transient redistribution of NCAM in different brain structures occurs also under the influence of experimental hemic hypoxy. Postnatal brain is more sensitive to hypoxic injury of the hemic type. Ionizing radiation and hypoxy lead to the increase of NCAM level in rat blood that changes in a way similar to the dynamics of the concentration of this neurospecific molecule in brain structures. According to this observation, determination of NCAM concentration in blood serum by means of ELISA can be suggested as a supplemental biochemical diagnostic test to define level of pathological processes in the brain that could be caused by the X-ray irradiation.
NCAM, ELISA, X-ray irradiation, structures of brain, hemic hypoxy.
Лещинская И.А. Распределение белка адгезии нервных клеток NCAM в структурах головного мозга после воздействия радиации в малой дозе. Рукопись.
Дисcертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2001 р.
Дисcертация посвящена изучению распределения нейроспецифического белка клеточной адгезии NCAM в морфо-функциональных структурах головного мозга крыс после воздействия рентгеновского излучения в дозе 25 сГр, а также при моделировании возможных вторичных эффектов ионизирующей радиации – гемической гипоксии мозга, экспериментально вызванной введением нитрита натрия, и стресса. Методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением моноспецифической поликлональной антисыворотки было установлено, что распределение NCAM в структурах головного мозга является неравномерным и зависит от пола животных. В головном мозге самцов наибольшее содержание его мембранной формы выявлено в полосатом теле и гиппокампе, наименьшее – в среднем мозге и варолиевом мосту. В головном мозге самок наблюдалось иное распределение мембранной формы NCAM: наибольший уровень был выявлен в коре больших полушарий, который был в 2,1 раза больше соответствующего показателя самцов. После тотального рентгеновского облучения в дозе 25 сГр в головном мозге крыс обоих полов наблюдались фазные или периодичные изменения содержания мембранной и растворимой форм NCAM: в онтносительно ранний период (1-24 часа после облучения) изменения были более выраженными по сравнению с их величиной в относительно поздний период (24-168 чвсов) после облучения. Изменения концентрации мембранной и растворимой форм NCAM, максимум которых отмечали через 12 и 168 часов после облучения, свидетельствуют о существенном перераспределении этого белка между структурами головного мозга, которое было более существенным после однократного радиационного влияния в дозе 25 сГр. После облучения в дозе 25 сГр наблюдается увеличение содержания метгемоглобина в крови облученных крыс, что свидетельствует о развитии гемической гипоксии. При экспериментальной гемической гипоксии наблюдается временное перераспределение NCAM в структурах головного мозга крыс, которое отмечалось только на 3 и 9 дни после введения нитрита натрия, классического метгемоглобинобразователя. К его влиянию оказался более чувстительным головной мозг в раннем постнатальном развитии. В результате пренатальной гемической гипоксии наблюдается 30% дефицит мембранной формы NCAM в коре головного мозга. Влияиние ионизирующей радиации и гемической гипоксии приводит к повышению содержания NCAM в сыворотке крови крыс, динамика которого подобна изменениям концентрации данного нейроспецифического белка в структурах головного мозга. Это дает возможность предложить метод иммуноферментного определения уровня белка NCAM в сыворотке крови в качестве дополнительного биохимического диагностического теста для уточнения степени развития патологического процесса в головном мозге, индуцированном влиянием радиации.
NCAM, ИФА, ионизирущее излучение, структуры головного мозга, гемическая гипоксия
| 
