Фаги 1-ї та 2-ї груп мали дуже подібні спектри літичної активності, лізували найбільшу кількість випробуваних культур і відповідно характеризувалися найвищими індексами літичної ативності – близькими до 0,2. Згідно з даними літератури, такі величини індексів не є високими, але широка географія розповсюдження та значний відсоток технологічних відхилень, спричинених бактеріофагами, свідчать, що навіть при таких низьких індексах ці фаги представляють велику проблему для молочної галузі України.
Цікавим і несподіваним фактом стало те, що віруси 1-ї та 2-ї літичних груп, які становлять переважну більшість колекційних ізолятів (67%), лізували штами як мезофільних лактококів, так і термофільних стрептококів. Хоча в літературі ми не знайшли повідомлень про здатність фагів до перехресного інфікування мезо- та термофільних МКБ, така „поведінка” досліджуваних фагів цілком відповідає сучасній теорії модульної еволюції бактеріальних вірусів (Hendrix R.W. et al., 1999; Hendrix R.W., 2003).
У бактеріофагів 3-ї та 4-ї груп індекси літичної активності були значно менші, оскільки зазначені віруси лізували невелике число штамів. Фагів, активних лише до однієї бактеріальної культури виявлено не було.
Подальші дослідження проводили з використанням ізолятів 3Ф, 8Ф і 9Ф, які представляли різні літичні групи і відрізнялися морфологією часток.
Визначення поліпептидного складу досліджуваних фагів. Здійснено порівняльне вивчення поліпептидного складу вірусів. Як видно з фореграми (рис. 2), між 3Ф і 9Ф (група с2) спостерігали значну подібність щодо вмісту деяких поліпептидів, зокрема, чотирьох мажорних білків (72,5; 54; 43 і 29 кДа) та одного мінорного (63 кДа). Фаг 8Ф за поліпептидним складом суттєво відрізнявся від 3Ф та 9Ф, щоправда, цей ізолят також містив мажорний поліпептид масою 29 кДа.
Згідно з даними літератури, фаги МКБ дуже гетерогенні за ознакою білкового складу. Проте, в поліпептидних профілях с2-подібних фагів виявлено декілька мажорних білків, причому серед них неодмінно є поліпептиди з порівняно великою молекулярною масою (Moineau S. et al., 1992; Azaпez S.R.C. et al., 1998), що пов’язано з формуванням ковалентно зв’язаних мультимерних білків голівки (Lubbers M.W. et al., 1995). Отже, результати досліджень підтвердили належність 3Ф і 9Ф до с2-подібних фагів.
Серологічна спорідненість. Визначення серологічних властивостей фагів проводили з використанням мишачих поліклональних сироваток у трьох розведеннях, що дозволило оцінити ступінь вираженості імунологічних реакцій.
Як видно з рисунка 3, ізоляти 3Ф та 9Ф у перехресних реакціях з антисироватками до 9Ф та 3Ф показали досить високі значення оптичної густини, порівняно з тими, що отримано у реакціях з гомологічними антисироватками. Це свідчить про наявність спільних для цих вірусів антигенних детермінант. Серологічна спорідненість фагів 3Ф та 9Ф становила 93,2%, на підставі чого їх віднесено до одного серотипу (1). В гетерологічних системах фагів 3Ф та 9Ф з сироваткою до 8Ф отримано значення оптичної густини, що знаходяться нижче порогового рівня чутливості даного методу. Аналогічні результати спостерігали за умов взаємодії фага 8Ф з антисироватками до 3Ф та 9Ф – вищеназваний фаг дав позитивну реакцію лише з гомологічною антисироваткою (рис. 3). Тому ізолят 8Ф віднесено до окремого серотипу (2).
За даними літератури (Geller B.L. et al., 1998), слабка нейтралізація фагів МКБ у гетерологічних системах чи її відсутність корелює з фаговими групами. Тому, очевидно, що бактеріофаги серотипів 1 та 2 належать до різних груп. Отже, отримані дані підтвердили належність 3Ф та 9Ф до однієї групи, а ізолята 8Ф – до іншої групи фагів МКБ.
Чутливість фагів молочнокислих бактерій до фізичних та хімічних факторів.
Чутливість до дії температури. Проводили термоінактивацію в бульйоні та знежиреному молоці за різних температур. Процес термо-інактивації фагів описувався двокомпонентними кривими: під час першої фази (І) спостерігали швидке, а під час другої (ІІ) – повільніше падіння інфекційності вірусів. Найшвидше інактивувався фаг 3Ф, константа інактивації якого у молоці при 60°С для фракції I становила 65,5Ч10-2Чхв-1, а найстабільнішим був фаг 9Ф, який за цих умов практично не втрачав інфекційності, тоді як при 70°С його константа інактивації чисельно дорівнювала 126,9Ч10-2Чхв-1. Фаг 8Ф виявився чутливішим до температури, ніж 9Ф, про що свідчить майже удвічі більша константа інактивації при 70°С. Важливо відмітити, що термостійкість фагів залежала від середовища, зокрема, у молоці вона була дещо вищою, ніж за тієї ж температури у бульйоні (табл.5).
Таблиця 5
Константи теплової інактивації фагів у молоці та бульйоні
Вивчали вплив на інфекційність фагів режимів пастеризації молока, прийнятих для вироблення різноманітних кисломолочних продуктів та для приготування виробничої закваски. Встановлено, що залежно від рівня терморезистентності фаги у більшому чи меншому титрі виявлялися за всіх режимів пастеризації, за винятком режиму, прийнятого для приготування виробничої закваски (рис. 4).
Отримані результати збігаються з даними подібних досліджень, які проводилися стосовно фагів, активних щодо мезофільних лактококів, термофільних стрептококів та лактобацил (Binetti A.G., Reinheimer J.A., 2000; Chopin M.C., 1980; Madera C. et al., 2004; Suarez V.B., Reinheimer J.A., 2002).
Чутливість фагів до цитрату натрію. Як відомо (Габрилович И.М., 1973), двовалентні іони, зокрема кальцію, можуть впливати на репродукцію бактеріофагів. Оскільки молоко та отриманий на його основі гідролізований бульйон містять іони кальцію, для їх зв’язування у середовище додавали цитрат натрію. Таким чином, чутливість до цитрату може вказувати на потребу фагів у іонах кальцію.
Результати досліджень свідчать про різну потребу вірусів в іонах кальцію. Зокрема, 3Ф та 9Ф лізували чутливі до них штами навіть у середовищі з 4% цитрату натрію. Тоді як титр 8Ф у середовищі з 1% цитрату знизився майже на 2, а в середовищі з 1,5% – більш як на 4 логарифмічні одиниці. За наявності 2% цитрату натрію 8Ф повністю втрачав здатність до утворення негативних колоній (рис.5).
Оскільки за умов виробництва репродукція як бактерій, так і фагів відбувається в рідкому середовищі, важливо дослідити чутливість до цитрату натрію за цих умов. З огляду на дані, отримані при дослідженні репродукції бактеріофагів на агаризованому середовищі, тестування проводили за таких умов: 8Ф – за концентрацій 1%, 1,5% та 2%, а ізолятів 3Ф і 9Ф – 2% цитрату. Результати визначали, спостерігаючи за значеннями оптичної густини та рН середовища. Як видно з рисунків 6, 7 і 8, отримані дані підтвердили результати тестування фагів 8Ф, 3Ф та 9Ф на агаризованому середовищі.
Важливо зазначити, що цитрат натрію, поряд з інгібуючою дією на репродукцію фага 8Ф, також виявив стимулюючий вплив на ріст популяцій бактерій-хазяїв. Про це свідчить збільшення майже удвічі оптичної густини зразків, які містили 1,5% та 2% цитрату (К+1,5%ц; К+2%ц), порівняно з оптичною густиною культури без цитрату (К) (рис. 6, 8).
Таким чином, з огляду на широке розповсюдження в молочній галузі України фагів, для репродукції яких необхідні іони Са2+, одним із дієвих заходів, спрямованих на обмеження фаголізису заквасок, може бути створення та запровадження у маточне виробництво безкальцієвих середовищ, у тому числі із залученням цитратів.
Стабільність фагів за умов зберігання. Інформація щодо здатності бактеріофагів зберігати чи втрачати інфекційність за умов, у яких вони знаходяться на виробництві, є важливою для виявлення джерел фагового забруднення та розробки рекомендацій, спрямованих на запобігання контамінації.
Під час проведення моніторингу в ропі з-під сичужного сиру було виявлено три фагові ізоляти, тоді як у сироватці – жодного (див. табл. 1). Встановлення цього факту дозволило припустити, що віруси можуть зберігати активність у ропі. Результати досліджень (рис. 8) підтвердили досить високу стабільність бактеріофагів за умов, у яких відбувається соління сичужного сиру (рН~5,5; температура 10°С; концентрація хлориду натрію 20%).
Отже, зважаючи на здатність фагів зберігати інфекційність у ропі та з огляду на те, що, відповідно до технологічних вимог, її слід міняти не рідше, ніж раз на рік і пастеризувати не рідше, ніж раз на місяць, можна зробити висновок: ропа – джерело фагової інфекції на сироварних заводах.
Відбір та перспективи використання чутливих до фагів тест-культур молочнокислих бактерій. За умов, коли дослідження з бактеріофагії у молочній промисловості тривалий час не проводилися та за ситуації втрати колекції індикаторних до фагів штамів, актуальним завданням є пошук нових тест-культур, які були б максимально чутливими до розповсюджених на виробництві бактеріофагів.
Отже, за результатами дослідження літичної активності фагів було визначено коло їх хазяїв. Подальшими етапами створення колекції індикаторних культур стали виявлення та відбір штамів, які найефективніше підтримували репродукцію фагів, та дослідження цих культур на лізогенність.
За результатами досліджень вище названі вимоги задовольняли три штами: S. salivarus ssp. thermophilus 2152, L. lactis ssp. lactis 1100 та L. lactis ssp. lactis 1112, тому їх і рекомендовано використовувати як тест-культури для проведення фагового моніторингу на виробництві.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі представлено експериментальні та теоретичні узагальнення наукового завдання, яке полягало у дослідженні біологічних та фізико-хімічних властивостей фагів молочнокислих бактерій. Запропоновано ряд практичних рекомендацій щодо вирішення проблеми фаголізису в молочній промисловості України. У ході роботи було зроблено такі висновки:
1. За умов виробництва молочних ферментованих продуктів на підприємствах України виділено 13 фагових ізолятів молочнокислих бактерій. Наявність фагів невисокого титру суттєво не впливала на показники якості продукції, тоді як зростання їх титру призводило до збоїв у технологічному циклі і навіть до зупинення виробництва. При цьому, внаслідок фаголізису культур закваски, спостерігали активний ріст сторонньої мікрофлори, що суттєво погіршувало якість продукту та знижувало рівень його епідеміологічної безпеки. Проблема запобігання виникнення ситуації масового фаголізису в умовах виробництва полягає в необхідності зниження титру фага у цільовому продукті до значень, нижчих від 106 БУО/мл.
2. Серед виділених фагів домінували ізоляти, здатні лізувати штами мезофільних (Lactococcus lactis) та термофільних (Streptococcus salivarіus ssp. thermophilus) молочнокислих бактерій.
3. За даними електронно-мікроскопічних досліджень, усі фаги мали довгі нескоротливі хвостові відростки, що є ознакою родини Siphoviridae, порядку Caudovirales. За наявністю ізометричної голівки дев’ять ізолятів віднесено до морфотипу В1; за ознакою видовженої голівки чотири ізоляти віднесено до с2-подібних лактококових фагів морфотипу В2.
4. Білковий склад фагів представлений набором мажорних та мінорних поліпептидів. Значення молекулярних мас знаходилися в межах 21,5–87 кДа. Фаги морфотипу В2 характеризувалися чотирма мажорними поліпептидами з молекулярними масами 72,5; 54; 43 і 29 кДа; фаг морфотипу В1 мав один мажорний поліпептид молекулярною масою 29 кДа.
5. Встановлено високий ступінь серологічної спорідненості с2-подібних фагів; між ізолятами морфотипів В1 та В2 спільних антигенних детермінант не виявлено.
6. Досліджено чутливість фагів до фізико-хімічних факторів:
Процес термоінактивації описувався двокомпонентними кривими, фаги відрізнялися термостійкістю: константа термоінактивації найчутливішого до температури фага у молоці при 60°С для фракції I становила 65,5Ч10-2Чхв-1, а найстійкішого при 70°С – 126,9Ч10-2Чхв-1. Встановлено, що жоден із режимів пастеризації молока, які використовуються для виробництва кисломолочних продуктів, не забезпечує повної інактивації фагів. Віруси втрачали інфекційність лише за режиму пастеризації, прийнятого для приготування закваски.
Для репродукції переважної більшості виділених фагів необхідні іони кальцію. Це вказує на можливість розробки та використання в маточному виробництві декальцинованих середовищ (у тому числі із залученням цитрату натрію) для запобігання фаголізису заквасок у вітчизняній молокопереробній галузі.
Фаги здатні зберігати інфекційність за умов знаходження у ропі, яку слід вважати джерелом фагового забруднення на сироварних заводах та брати до уваги на етапі проектування заводу та проводячи ротації заквасок.
7. Для виявлення фагів молочнокислих бактерій за умов виробництва як тест-культури запропоновано використовувати три штами молочнокислих бактерій, які забезпечували найвищий рівень репродукції досліджуваних фагів та не містили індуцибельних профагів.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Шугай М.О., Бойко А.Л., Рожанська О.М., Кігель Н.Ф. Виявлення фагів молочнокислих бактерій в умовах виробництва // Агроекологічний журнал. – 2004. – № 3. – С. 69–71.
Шугай М.О., Бойко А.Л. Термоінактивація фагів молочнокислих бактерій // Вісник КНУ ім. Т. Шевченка. – 2004. – № 42–43. – С. 109–110.
Шугай М.О., Шевченко Т.П., Бойко А.Л. Серологічні властивості фагів молочнокислих бактерій // Вісник КНУ ім. Т. Шевченка. – 2005. – № 44, С. 34–35.
Бойко А.Л., Шугай М.О. Виділення та характеристика фагів молочнокислих бактерій // Доповіді НАН України. – 2005. – № 8. – С. 157–162.
Шугай М.О., Бойко А.Л. Виявлення лактофагів на молокозаводах України // IV Всеукраїнська наукова конференція студентів та аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні”. 24–25 квітня. – Київ, 2004. – С. 64–65.
Шугай М.О., Бойко А.Л. Чутливість фагів молочнокислих бактерій до дії температури // Х з’їзд Товариства мікробіологів України. 15–17 вересня. – Одеса, 2004. – С. 373.
Шугай М.О., Бойко А.Л. Біологічні властивості фагів молочнокислих бактерій // IV Міжнародна конференція “Біоресурси та віруси”, 27–30 вересня. – Київ, 2004. – С. 28.
АНОТАЦІЯ
Шугай М.О. Біологічні та фізико-хімічні властивості фагів молочнокислих бактерій, виділених за умов виробництва молочних ферментованих продуктів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2006.
Роботу присвячено вивченню біологічних та фізико-хімічних властивостей фагів молочнокислих бактерій (МКБ), поширених на підприємствах молочного профілю України. Простежено негативний вплив фагів високого титру на якість та рівень епідеміологічної безпеки цільового продукту. Встановлено, що проблема запобігання виникнення ситуації масового фаголізису полягає у необхідністі зниження фагового титру в цільовому продукті до значень, нижчих від 106 БУО/мл.
Уперше в Україні досліджено на фагочутливість культури термофільних стрептококів та показано здатність фагів перехресно лізувати штами мезофільних (Lactococcus lactis) та термофільних (Streptococcus salivarіus ssp. thermophilus) МКБ.
Досліджено морфолого-структурну організацію фагових часток та їх поліпептидний склад. Встановлено високий ступінь серологічної спорідненості с2-подібних фагів; між ізолятами морфотипів В1 та В2 спільних антигенних детермінант не виявлено.
Досліджено чутливість фагів до фізико-хімічних факторів та стабільність вірусів за різних умов зберігання.
Ключові слова: фаги молочнокислих бактерій, літична активність, термоінактивація, інгібування репродукції фагів, джерела фагової інфекції.
АННОТАЦИЯ
Шугай М.А. Биологические и физико-химические свойства фагов молочнокислых бактерий, выделенных в условиях производства молочных ферментированных продуктов. – Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 – вирусология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2006.
Диссертация посвящена изучению биологических и физико-химических свойств фагов молочнокислых бактерий (МКБ), распространенных на предприятиях молочной промышленности Украины. Фаги выделяли из образцов кисломолочных продуктов, смывов с оборудования, а также подсырних сыворотки и рассола. Титры бактериофагов составляли 102–109 БОЕ/мл. Изучено влияние титра фагов на технологический процесс и качество получаемого продукта. Показано, что проблема предупреждения возникновения ситуации массового фаголизиса состоит в необходимости снижения фагового титра в целевом продукте к уровню ниже 106 БОЕ/мл.
Впервые в Украине исследованы на фагочувствительность культуры термофильных стрептококков и впервые показано способность фагов перекрестно лизировать штаммы мезофильных (Lactococcus lactis) и термофильных (Streptococcus salivarіus ssp. thermophilus) МКБ. Индексы литической активности бактериофагов находились в пределах 0,02–0,2.
Изучена морфолого-структурная организация фаговых частиц. Вирусы характеризовались наличием длинного несокращающегося отростка, что, согласно современной классификации бактериальных вирусов, является признаком порядка Caudovirales, семейства Siphoviridae. Соответственно морфологии головки девять изолятов отнесено к к морфотипу В1, четыре – к морфотипу В2, группе с2.
Белковый состав фагов представлен набором мажорных и минорных полипептидов. Значения молекулярных масс находились в пределах 21,5–87 кДа. Фаги группы с2, морфотипа В2 характеризовались четырьмя мажорными полипептидами молекулярных масс 72,5; 54; 43 и 29 кДа; у фага морфотипа В1 обнаружен один мажорный полипептид молекулярной массой 29 кДа.
С использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа установлено высокое серологическое сродство с2-подобных фагов; между изолятами морфотипов В1 и В2 общие антигенные детерминанты не обнаружены.
Исследована чувствительность фагов к физико-химическим факторам. Процесс термоинактивации фагов описан двухкомпонентными кривыми – во время первой фазы (I) наблюдали быстрое, а во время второй (II) – более медленное снижение инфекционности вирусов. Исследуемые изоляты отличались термоустойчивостью: константа инактивации наиболее чувствительного к температуре фага при 60°С для фракции I составляла 65,5Ч10-2Чмин-1, а наиболее устойчивого – 126,9Ч10-2Чмин-1 при 70°С. Показано, что в большей или меньшей степени вирусы могут “выживать” (сохранять инфекционность) при всех режимах пастеризации молока, используемых на производстве для получения кисломолочных продуктов. Полную инактивацию фагов гарантирует только режим пастеризации, принятый для приготовления производственной закваски.
На основании экспериментальных данных о потребности ионов Са2+ для репродукции большинства исследуемых фагов рассматривается возможность разработки и использования в маточном производстве декальцинированных сред с целью предупреждения вспышек фаголизиса на предприятиях отечественной молочной промышленности.
Показано, что бактериофаги способны сохранять инфекционность находясь в рассоле, применяемом для соления сычужных сыров. Поэтому рассол является одним из источников фаговой инфекции на производстве, на что следует обратить внимание на этапе проектирования завода и во время ротации заквасок.
Для проведения фагового мониторинга на предприятиях молочной промышленности в качестве тест-культур предложено использовать три штамма МКБ, которые обеспечивают самый высокий уровень репродукции исследуемых фагов и не содержат индуцибельных профагов.
Ключевые слова: фаги молочнокислых бактерий, литическая активность, термоинактивация, ингибирование репродукции фагов, источники фаговой инфекции.
SUMMARY
Shuhai M. А. Biological and physico-chemical properties of phages of lactic acid bacteria isolated during the manufacture of fermented dairy products. – Manuscript.
The dissertation on a scientific degree of the candidate of biological sciences on a speciality 03.00.06. – virology. Taras Shevchenko’ Kyiv National University, Kyiv, 2006.
The thesis examines biological properties of the phages active to meso- and thermophilic lactic acid bacteria (LAB) and widespread at the dairy plants of Ukraine. The negative influence of high-titre phages on quality and level of epidemiological security of the end product was researched. It was established that the problem of preventing mass phagolysis lies in the necessity of decreasing the phage titre in the end product to values below 106 PFU/ml.
For the first time in Ukraine cultures of the thermophilic streptococci were examined for their phage sensitivity and was shown the ability of phages to cross lyse cultures of mesophilic (Lactococcus lactis) and thermophilic (Streptococcus salivarius ssp. thermophilus) LAB.
The morphologico-structural organization of the phages and structure of phages proteins was studied. A high level of serological affinity of c2-like phages was established; common antigenic determinants between isolates of B1 and B2 morphotypes were not found.
Investigated was the sensitivity of phages to physico-chemical factors and stability of viruses during preservation in different conditions.
Key words: phages of lactic acid bacteria, phagolysis, thermo-inactivation, inhibition of phage reproduction, sources of phage infection.
| 
