ВИСНОВКИ
Проведено скринінг рослин на вірусоносійство та виділено нові ізоляти ВТМ (Tobamovirus) в зоні Чернобильської АЕС та регіоні Шацького Національного парку з рослин подорожника Plantago major.
За спектром рослин-індикаторів показана відмінність ідентифікованих ізолятів, зокрема ізоляту ВТМш, виділеного з Шацького Національного Парку, у порівнянні зі штамом ВТМ U1 та ізолятом ВТМч.
У двох досліджуваних ізолятів ВТМ показана відсутність метионіну всередині пептидного ланцюгу їх капсидних білків. Таким чином дані ізоляти не відносяться до штамів ВТМ Cg, OB та Dahlemense, які містять метионін.
Встановлена серологічна подібність антигенних детермінант триптичних фрагментів ВТМч та типового штаму ВТМ, а також відмінність ВТМш у антигенних детермінантах від ВТМч та ВТМ U1.
Рестрикційий аналіз кДНК капсидних білків ізолятів показав відміність ізоляту ВТМш в сайті рестрикції рестриктази Tag1. Отже, отримані дані свідчать про подібність ізоляту ВТМч до типового штаму ВТМ та про відмінність ізоляту ВТМш від них, що корелює з даними біологічного тестування на рослина-індикаторах.
Отримано поліклональні діагностичні сироватки до всіх ізолятів ВТМ для створення діагностикумів на основі непрямого ІФА з використанням лужної фосфатази, що дозволить діагностувати ВТМ як в рослинному матеріалі, так і в грунті. Встановлено, що буфери лужного рН, а саме тріс-боратний, рН 8.5, та карбонатний, рН 9.6, можуть бути застосовані в діагностичних системах з метою ідентифікації цих та інших вірусів подібної морфології.
Вперше доведена можливість застосування атомно-силової мікроскопії для виявлення локалізації антитіл на поверхні ВТМ, що дає змогу отримувати нову інформацію про антигенну будову вірусів.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Polischuk V., Boyko A., Spaar D., Budzanivska I., Boubriak O. and Tyvonchuk T. Monitoring of some phytoviral infections in Ukraine // Arh. Phytopath. Pflanz. -1998. -V.31. -pp.459-464.
Тивончук Т.П., Поліщук В.П., Будзанівська І.Г., Бойко А.Л. Вивчення бур’янів як резервантів вірусних інфекцій в агроценозах // Вісник аграрної науки. -1998. -№2. -С.20-22.
Будзанівська І.Г., Поліщук В.П., Тивончук Т.П., Бойко А.Л. Зв’язок між наявністю антигенів фітовірусів в грунті, структурою грунтів та екологічним станом зовнішнього середовища //Вісник аграрної науки. -1998. -№9. -С. 61-63.
Тивончук Т.П., Поліщук В.П., Бойко А.Л. Вивчення штамового різноманіття вірусу тютюнової мозаїки на території України //Агроекологія та біотехнологія: Зб. наук. пр. -К: Вип. 2, 1998. -с.209-213.
Поліщук В.П., Ренгевич О.В., Бекетов Г.В., Тивончук Т.П., Бойко А.Л. Вивчення вірусу тютюнової мозаїки за допомогою атомно-силового мікроскопу //Биополимеры и клетка. -1999. -№ 5. -С.456-460.
Полищук В.П., Тывончук Т.П., Ренгевич Е.В., Бекетов Г.В., Будзанивская И.Г., Бойко А.Л. Использование метода атомно-силовой микроскопии для исследования морфологии и структурной организации вирусов //Микробиол. ж-л. -2000. -Т.62, №6. -С.40-43.
Тивончук Т.П., Шевченко О.В., Бойко А.Л., Поліщук В.П. Порівняльне вивчення молекулярних та серологічних властивостей двох ізолятів вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) та його типового штаму U1 //Бюлетень Ін-ту с/г мікробіології. -2000. -№7. -С. 34-36.
Polishcuk V., Demyanenko F., Budzanivskaya I., Smalius E., Tyvonchuk T. Identification of plant viruses in different agrocenoses of Ukraine and creation of computer database // International regional seminar “Environment protection: modern studies in ecology and microbiology”. Uzhgorod. Ukraine. -1997. -pp.204-208.
Budzanivskaya Irene, Polischuk Valery, Smalius Elena, Tyvonchuk Tatyana, Boyko Anatoly. Relationship between phytovirus availability in soil of Ukraine and ecological condition of agrocenosis // 16th World congress of soil science. Montpellier. France. 20-26 August 1998. -V.1. -p.204.
Tyvonchuk T.P., Budzanivskaya I.G., Ryzkova A.E A rod-shaped virus isolated from Elytrigia repens growing in the Chernobyl region // Abst. II International conference “Bioresourses and viruses”. Ukraine. 7-10 September 1998. -Kyiv. -1998. -p.219.
T.P.Tyvonchuk, V.P.Polischuk, I.G.Budzanivskaya, E.V.Rengevych. Atomic force microscopy as a modern method in studying of molecular and biological properties of viruses // Abst. Conference on genetics and molecular biology for young scientists. Ukraine. 20-22 April 2000. Lviv. -p.50.
T.P.Tyvonchuk, V.P. polischuk, A.L. Boyko, A.V. Shevchenko. A comparative study of molecular and biological properties of two isolates of tobacco mosaic virus (TMV) and its common strain U1 // 5th Congress of the European Foundation for plant pathology, Italy. 18-22 September 2000. Taormina-Giardini Naxos. -p.54.
Shevchenko T.P., Shevchenko O.V., Polischuk V.P., Viter S.S., Boyko A.L. Coat protein analysis of two isolates of tobacco mosaic virus tha differed in their host range // 6th International Symposium on Positive Strand RNA Viruses. France, Paris, 28 th May – 2d June, -p.1-04.
АНОТАЦІЇ
Шевченко Т.П. Біологічні та молекулярні особливості ізолятів вірусу тютюнової мозаїки (Tobamovirus), виділених з різних регіонів України.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія.- Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2001.
Дисертація присвячена дослідженню біологічних та молекулярних властивостей ізолятів ВТМ. Представлені результати порівняльного вивчення двох ізолятів ВТМ, які виділені з Plantago major Чернобильської зони – ВТМч та Шацького Національного парку – ВТМш і порівняння їх з типовим штамом ВТМ U1. Тестування на рослинах-індикаторах виявило відмінність ізоляту ВТМш від ВТМч та ВТМ U1 внаслідок відсутності симптомів на Nicotiana glutinosa та Nicotiana sylvestris.
При хімічному розщепленні капсидних білків ізолятів бромцианом показана відсутість метіоніну всередині пептидного ланцюгу, що свідчить про те, що дані ізоляти не відносяться до штамів ВТМ Cg, OB та Dahlemense.
Отримані специфічні сироватки до ізолятів, а також встановлена серологічна подібність антигенних детермінант триптичних фрагметів капсидних білків ВТМч та ВТМ U1, та відмінність у антигенних детермінантах між ВТМш та ВТМ U1. Рестрикційний аналіз кДНК капсидних білків ізолятів показав відміність в сайті рестрикції рестриктази Tag1 у ізоляту ВТМш. Отже, отримані дані свідчать про подібність ізоляту ВТМч до типового штаму ВТМ та відмінність ізоляту ВТМш від них.
У роботі представлені методичні підходи використання атомно-силової мікроскопії для дослідження антигенних властивостей вірусів. Вперше доведена можливість застосування атомно-силової мікроскопії для виявлення локалізації атитіл на поверхні вірусної частки ВТМ, що дає змогу отримувати нову інформацію про антигенну будову вірусів.
Ключові слова: вірус тютюнової мозаїки, ізоляти, капсидний білок, триптичні фрагменти, атомно-силова мікроскопія.
Шевченко Т.П. Биологические и молекулярные особенности изолятов вируса табачной мозаики (Tobamovirus), выделенных с различных регионов Украины.- Рукопись.
Диссертация на получение ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 – вирусология.- Киевский Национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2001.
Диссертация посвящена изучению биологических и молекулярных свойств изолятов ВТМ.
Представлены результаты сравнительного изучения двух изолятов ВТМ, выделенных из Plantago major Чернобыльской зоны – ВТМч, и Шацкого Национального парка – ВТМш, а также их сравнение с типичным штаммом ВТМ U1. Тестирование на растениях-индикаторах определило отличие изолята ВТМш от ВТМч и ВТМ U1 вследствие отсутствия симптомов на N. glutinosa и N. sylvestris.
При химическом расщеплении капсидных белков изолятов бромцианом показано отсутствие метионина внутри полипептидной цепи, что свидетельствует о том, что данные изоляты не относятся к штаммам ВТМ Cg, OB и Dahlemense.
Были получены специфичные сыворотки к изолятам и установлено серологическое подобие антигенных детерминант триптических фрагментов капсидных белков ВТМч и ВТМ U1, а также отличие антигенных детерминант ВТМш и ВТМ U1. Рестрикционный анализ кДНК капсидных белков изолятов показал отличие в сайте рестрикции рестриктазы Tag1 в случае изолята ВТМш. Итак, полученные данные свидетельствуют про подобие изолята ВТМч и типичного штамма ВТМ U1, и про отличие изолята ВТМш от них.
В работе представлены методические подходы использования атомно-силового микроскопа (Atomic Force Microscope – AFM) для изучения антигенных свойств вирусов. Впервые доказана возможность использования атомно-силовой микроскопии для локализации антител на поверхности вирусной частички ВТМ, что дает возможность получать новую информацию про антигенную структуру вирусов.
Ключевые слова: вирус табачной мозаики, изоляты, капсидный белок, триптические фрагменты, атомно-силовая микроскопия.
Shevchenko T.P. Biological and molecular properties of tobacco mosaic virus isolates (Tobamovirus) extracted from different regions of Ukraine.-Manuscript.
The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 – virology. Taras Shevchenko’ Kyiv National University, Kyiv, 2001.
The thesis is dedicated to studying of biological and molecular properties of tobacco mosaic virus isolates. Partial isolates’ characteristics included biological test using indicator plants, electronic microscopy, electrophoresis of coat proteins and nucleic acids, HPLC, ELISA, atomic force microscopy (AFM), etc.
Here are represented results of comparative study of two TMV isolates taken from Plantago major plants from Chornobyl region – TMVch, and from Shatsky National park – TMVsh, and also their matching with the typical TMV strain U1. The biological test using indicator plants (Chenopodium amaranticolor, Nicotiana glutinosa, N. debneyi, N. tabacum cv. trapeson, N. tabacum cv. Samsun, N. sylvestris and others) showed the distinction of TMVsh from the other viruses by absence of symptoms on N. glutinosa і N. sylvestris.
A single amino acid change in the coat protein may be the only difference detected between strains causing different disease. Chemical digestion of isolates’ coat proteins with BrCn demonstrated absence of methionine during the polypeptide chains confirming thus, that these isolates do not belong to following TMV strains: Cg, OB and Dahlemense.
Specific polyclonal antiserums to isolates have been received in order to create diagnosticums based on indirect ELISA with alkaline phosphatase for TMV diagnostics in plant material and soil as well. It was definitely shown, that only alkaline coating buffers (tris-borate, pH 8.5, and carbonate, pH 9.6) may be adequately used in indirect ELISA for identification of TMV and other viruses similar in morphology. Serological similarity of antigenic determinants of coat proteins’ tryptic fragments of TMVch and TMV U1 have been stated as well as their distinction in case of TMVsh and TMV U1. Serological difference of TMVsh from the other isolate and typical strain U1 has been also shown in homo- and heterological systems in cross-reactive ELISA, and ELISA based on antigen inhibition. Results of immunoelectroblotting of CPs’ tryptic fragments using polyclonal antiserums demonstrated the difference of TMVsh from TMVch and U1 strain. Restriction analysis of cDNAs corresponded to genes of isolates’ coat proteins showed a difference in Tag1 restrictase restriction site for TMVsh isolate. Thus, obtained data support similarity of TMVch isolate and typical TMV strain U1, and distinction of TMVsh from them both, respectively. Thus, difference in symptom development on host plants is confirmed by difference in structure and antigenic properties of coat proteins of these isolates.
Methodic approaches for using atomic force microscopy (AFM) in studying viruses’ antigenic properties are decribed in the work. Opportunity of AFM using for antibodies’ localization on the surface of TMV particle is shown for the first time, that gives a new powerful tool to obtain information on virus antigenic structure.
Key words: tobacco mosaic virus, isolates, coat protein, tryptic fragments, atomic force microscope.
| 
