Рестрикційний аналіз ДНК фагів. Аналіз ДНК був проведений після обробки їх специфічними ендонуклеазами рестрикції Hind III, EcoR I, Ecor V (Serva). Порівнювали їх електрофореграми, та визначали кількість фрагментів, які утворилися при гідролізі ДНК.
В результаті досліджень було встановлено, що за характером електрофоретичної рухливості Hind III-фрагментів ДНК, фаги підгруп 223 та 7591 мали ідентичні профілі, утворюючи по 7 фрагментів, за виключенням фагу 223 10/1, що гідролізувався на 4 фрагменти (рис. 4).
1 2 3 4 5 6 м
Рис. 4. Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК після обробки ферментом Hind III: 1- 7591 9/1; 2- 223 10/1; 3 – 7591 11/1; 4 – 7591 14/1; 5- 223 14/1; 6 – 223 17/1; м – маркер молекулярної маси ДНК фагу λ, оброблених ферментами λ/ Hind III + EcoR V (кВ): 22000, 5100, 4500, 4300, 3500, 2000, 1900, 1400, 950, 830.
Аналізуючи характер розподілу фрагментів ДНК фагів групи 7325 ( 10/1, 1/1, 14/2, 17/1) оброблених ферментом Hind III, можна помітити деякі особливі характеристики для кожного із чотирьох ізолятів (рис.5а). Вони проявляються в тому, що поряд із 20 фрагментами ДНК фага 7325-10/1, які для даної групи є спільні, у ДНК фагу 7325- 14/2 відсутні п’ять фрагментів, у 7325- 17/1 відсутні чотири фрагмента, а п’ять фрагментів відрізняються за електрофоретичною рухливістю від фагу 7325 – 10/1.
Найбільш суттєві відмінності виявляли ДНК фагів групи 1025 при гідролізі ферментом Hind III. Для ДНК фагу 1025/6 виявлено лише 8 фрагментів, в той час як у 1025/к їх показано 14 (рис. 5б).
М 1 2 3 4 5 6 м
а б
Рис. 5. Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК фагів після обробки ферментом Hind III: м- маркер молекулярної маси ДНК фагу λ,оброблених ферментами λ/ Hind III + EcoR V (кВ): 22000, 5100, 4500, 4300, 3500, 2000, 1900, 1400, 950, 830; 1- 7325 10/1; 2- 7325- 1/1; 3-7325 14/2; 4- 7325 17/1; 5- 1025/6; 6- 1026/К.
1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 М
а б
Рис. 6. Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК фагів після обробки специфічною ендонуклеазою рестрикції a - EcoR I; б- EcoR V: 1-7591 9/1; 2- 223 10/1; 3- 7591 11/1; 4- 7591 14/1; 5-223 14/1; 6- 223 17/1; 7- 1025/6; 8- 1025/к; 9- 223 1/1; 10 – 7591 9/1; 11- 223 10/1; 12- 7591 11/1; 13- 7591 14/1; 14- 223 14/1; 15- 223 17/1; 16- 7325 10/1; 17- 7325 1/1; 18- 7325 14/2; 19- 7325 17/1; 20- 1025/6; 21- 1025/к; м - маркер молекулярної маси ДНК фагу λ, оброблених ферментами λ/ Hind III + EcoR V (кВ): 22000, 5100, 4500, 4300, 3500, 2000, 1900, 1400, 950, 830.
Після гідролізу ДНК групи фагів 223 ендонуклеазою EcoR I вона утворювали підгрупи, що мали як спільні (7591 -14/1, 223-14/1 – по чотири, 7591-9/1, 223-10/1по сім фрагментів), так і індивідуальні (7591- 11/1, 223-17/1 – по п’ять фрагментів, які відрізнялись за мол. масою) профілі розділення (рис. 6а).
За характером чутливості до EcoR V досліджувані ДНК фагів проявляли свої особливості. Зокрема, за картиною розділення фрагментів після обробки їх ендонуклеазою EcoR V виявляли однакову кількість фрагментів в ДНК фагів 7325 14/2 та 7325 17/1 - (20), 7325 10/1 мав найбільшу кількість фрагментів (22), а 7325 1/1 – не гідролізувався .
Гідроліз ДНК групи фагів 223 ферментом EcoR V, показав, що їх геноми мають по чотири гомологічні фрагменти.
Розщеплення ДНК фагів групи 1025 при гідролізі ферментом EcoR V не відбувалось (рис. 6б).
Виявляючи подібність в профілях розділення гідролізованих ДНК, за поліпептидним складом, так і за особливостями структури ДНК фаги можна розглядати як споріднені в середині кожної із груп. Дослідження серологічних властивостей вказаних груп за допомогою методу непрямого ІФА дозволило за показниками отичної густини Е492 оцінити ступінь подібності як в середині групи так і між групами. Це може бути пов’язано з наявністю дивергенції властивостей у фагів, або обмінів модулів їх геномів в певному ареалі поширення.
Визначення серологічних властивостей проводили з використанням мишачих полівалентних антисироваток до фагів 223 17/1, 7325 17/1, 1025/к.
Як видно із рис.7, для всіх досліджуваних фагів характерна наявність спільних антигенних детермінант. Висока ступінь спорідненості показана для фагів у межах груп. Виявлена серологічна спорідненість досліджуваних фагів оцінювалась як висока між групами 223, 7325. При цьому хотілось би відмітити, що віріони групи фагів 223 мають короткі відростки, групи фагів 7325 - довгі, а їх чутливі бактерії відносяться до різних родів.
Отже, встановлено високу ступінь спорідненості фагів в межах груп та наявність спільних антигенних детермінант між групами.
Таким чином, показано, що фаги виділені із агроценозів, мають характерні властивості, які дозволяють їх об’єднати в межах груп.
- Проведені дослідження вказують, що групи фагів мають індивідуальні характеристики.
- Виявляючи подібні біологічні властивості, високу серологічну спорідненість в межах груп, наявність спільних антигенних детермінант між групами, поліпептидного складу, особливостей структури ДНК, що вивчено з використанням ендонуклеаз рестрикції фаги можуть мати спільне походження в межах груп.
Висновки:
1. Обстежено посіви цукрового буряку Київської, Вінницької і Чернігівської областей на наявність фагів фітопатогенних бактерій та проведено їх виділення. Встановлена біологічна активність та ефективність репродукції 31 ізоляту фагів до 13 штамів бактеріальних культур. Показано, що в результаті пасирування 23% виділених фагів втратили літичну активність.
2. Досліджена динаміка чисельності фагів на протязі 14 місяців до тринадцяти штамів бактеріальних культур (родів Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia). Встановлено максимальні титри фагів, що виявляли в січні (зимове зберігання коренів) та червні - липні (інтенсивний ріст рослин). Серед виділених, значну питому вагу становили фаги активні до X. axonopodis pv. beticola (туберкульоз цукрового буряку).
3. Вивчено морфолого - структурну організацію 13 фагів. Серед яких, дев’ять мали ізометричні головки (42,6±1 – 50±1 нм) і короткі хвостові відростки (1,8±0,2 – 10±0,5 нм) та відносились до родини Podoviridae, порядку Caudovirales. Інші чотири мали ізометричні головки (67±2 – 72,5±2 нм) і довгі нескоротливі відростки (119±2 – 131,6±2 нм) та відносились до родини Siphoviridae, порядку Caudovirales.
4. Проведено порівняльний аналіз білкового складу фагів, який представлений набором мінорних та мажорних поліпептидів. Визначено число поліпептидів для кожного із ізолятів, та їх молекулярні маси. Значення молекулярних мас знаходились в межах 13-160 кДа, а число поліпептидів становило від 14 до 23. За поліпептидним складом в межах груп виявлена подібність.
5. Вперше проведено вивчення серологічної спорідненості ізолятів фагів в гомо- та гетерологічній системах та встановлено високу ступінь спорідненості фагів в межах груп та наявність спільних антигенних детермінант між групами.
6. Встановлено, що геноми досліджуваних фагів представлені двонитковими ДНК, які за чутливістю до дії специфічних ендонуклеаз (EcoR I, EcoR V, Hind III ) мали індивідуальні особливості.
7. На основі аналізу поліпептидного складу, чутливості нуклеїнових кислот до специфічних ендонуклеаз, числа фрагментів після їх гідролізу, характеру електрофоретичної рухливості, результатів ІФА, можна судити про наявність ділянок спільної гомології в геномах вивчених фагів, що виділені із агроценозів України.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Ромашев С.А., Коломейцева Л.А., Андрійчук О.М. Вивчення властивостей фагів Xanthomonas аxonopodis pv. beticola, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Pseudomonas syringae pv. tabaci з метою встановлення впливу екологічних факторів на їх популяції. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 1999. - №29. – С.54 –57.
2. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Ромашев С.А., Коломейцева Л.А., Андрійчук О.М. Виявлення природних популяцій фагів фітопатогенних бактерій Xanthomonas аxonopodis pv. beticola, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Pseudomonas syringae pv. tabaci в агроценозах України. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 2000. - №31. – С.61 –62.
3. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Ромашев С.А., Андрійчук О.М. Дослідження популяцій фагів фітопатогенних бактерій. // Вісник аграрної науки – 2001. - №8. – С.51 –53.
4. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Аналіз популяцій фагів Xanthomonas, Pseudomonas виділених із агроценозів України. // Мат. III Міжнар. конф. “Біоресурси та віруси”. – Київ. – 2001. – с. 4.
5. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Екологічні та біологічні аспекти дослідження фагів фітопатогенних бактерій. // Мат. III Міжнар. конф. “Біоресурси та віруси”. – Київ. – 2001. – с. 19.
6. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Екологічні та біологічні аспекти дослідження фагів фітопатогенних бактерій. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 2001. - №35. – С.11 –13.
7. Єфименко Т.В., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Семчук Л.І. Швидке та ефективне виділення ДНК, чутливих до специфічних ендонуклеаз, із фагів Pseudomonas та Xanthomonas. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 2001. - №35. – С.13 –16.
8. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Виявлення в агроценозах фагів фітопатогенних бактерій Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia та Bacillus. // Агроекологічний журнал. – 2002. - №3. – с. 24 – 26.
9. Семчук Л.І., Ігнатенко Т.А., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. До питання про адаптацію та виживання фагів в природі. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 2002. - №38. – С.54 –56.
10. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І. Екологічні аспекти циркуляції фагів фітопатогенних бактерій у біоценозах // Мат. Міжнар. конф. “Антропогенно - змінене середовище України: ризики для здоров’я населення та екологічних систем”. – 2003. – Київ, с. 28 -32.
11. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І. Екологічні аспекти циркуляції фагів фітопатогенних бактерій у біоценозах. БІОТА. Ризики “Антропогенно- змінене середовище України: ризики для здоров’я населення та екологічних систем”. Спеціальний випуск журналу „Екологічний вісник”. 2003. – Київ, c. 498 – 504.
АНОТАЦІЇ
Андрійчук О.М. Біологічна характеристика фагів фітопатогенних бактерій виділених із агроценозів України. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю - 03.00.06 – вірусологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.
Дисертація присвячена дослідженню біологічних властивостей ізолятів фагів, що мають різних чутливих хазяїв і поширені в агроценозах України. Досліджено динаміку чисельності конкуруючих бактеріофагів в природному агроценозі. Отримані результати, вперше демонструють динаміку декількох популяцій фагів антагоністичних до різних бактерій, які спільно зустрічаються в оточуючому середовищі.
В складі білків фагів виявлено загальні антигенні детермінанти. Досліджено їх поліпептидний склад.
Встановлено, що геноми фагів представлені двонитковою ДНК, яка характеризується відсутністю фрагментованості в структурі .
У роботі представлені методичні підходи по виділенню ДНК, який дозволяє швидко та ефективно із отриманих ізолятів виділяти нуклеїнові кислоти одночасно для великої чисельності проб без застосування фенолу.
Створено лабораторну колекцію ізолятів фагів (понад 400 зразків), виділених із агроценозів.
Ключові слова: вірулентні та помірні бактеріофаги, ізоляти, сезонна динаміка, віріони, ДНК.
Андрийчук Е.Н. Биологическая характеристика фагов фитопатогенных бактерий выделенных из агроценозов Украины. – Рукопис.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 – вирусология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченка, Киев, 2003.
Диссертация посвящена изучению биологических свойств изолятов фагов, которые имеют разных чувствительных хозяев и распространены в агроценозах Украины. Исследовано динамику численности конкурирующих бактериофагов в агроценозе. Полученные результаты, впервые демонстрируют динамику нескольких популяций фагов - антагонистов к различным бактериям, которые совместно встречаются в окружающей среде.
Изучено морфолого - структурную организацию 13 фагов. Из которых, девять имели изометрические головки (42,6±1 – 50±1 нм) и короткие хвостовые отростки (1,8±0,2 – 10±0,5 нм) и были отнесены к семейству Podoviridaе. Четыре других имели изометрические головки (67±2 – 72,5±2 нм) длинные несокращающиеся отростки (119±2 нм – 131,6±2 нм) и были отнесены к семейству Siphoviridae.
В составе белков фагов выявлено общие антигенные детерминанты. Исследован их полипептидный состав.
Установлено, что геномы фагов представлены двуспиральной ДНК, которая характеризуется отсутствием фрагментованости в структуре.
В роботе представлены методические подходы по выделению ДНК, которые позволяют быстро и эффективно выделять нуклеиновые кислоты из изолятов одновременно для большого количества проб без использования фенола.
Впервые проведено изучение серологического родства изолятов фагов с помощью метода непрямого ИФА в гомо- та гетерологической системах та установлено высокую степень родства фагов в середине групп и наличие общих антигенных детерминант между группами.
Создана лабораторная коллекция изолятов фагов (более 400 образцов), выделенных из агроценозов.
Ключевые слова: вирулентные и умеренные бактериофаги, изоляты, сезонная динамика, вирионы, ДНК.
Andriychuk E.N. Biological characteristic of the phytopatogenic bacteria' phages isolated from the Ukrainian agrocenoses - Manuscript.
The dissertation for the competition of a scientific degree of candidate of biological sciences (PhD) by speciality 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko National University of Kyiv. Kyiv, 2003.
The dissertation is devoted to studying the biological properties of isolates which has different sensitive hosts and are distributed in agrocenoses of Ukraine. The dynamics of bacteriophage's number competing in agrocenose was investigated. The received results, for the first time show dynamics of several phages populations - antagonists to various bacteria which in common meet in an environment.
In a structure of phages proteins it is revealed the general antigenic determinants. Its polypeptides structure was investigated.
It is established, that genomes of phages is submitted by two-stranded DNA which is characterized by the absence of а fragmentation in structure.
In the work the methodical approaches on DNA' allocation which allow quickly and effectively discharge nucleic acids from isolates simultaneously for a plenty of tests without using of phenol are submitted.
The laboratory collection of phage's isolates (more than 400 samples) from agrocenoses is created.
Key words: virulent and temperate bacteriophage, seasonal dynamic, isolates, virion, DNA.
| 
