Регулювання окиснювальних процесів у тканинах рослин абсцизовою кислотою. Для того, щоб перевірити, чи АБК впливає на окисні процеси у клітинах рослин, ми дослідили дію відомого окиснювача діквату і етилену , а також відомого
Рис. 5. Гіпотетичний окисно-відновний механізм трансформації b-каротину та утворення АБК.
антиоксиданта аскорбінової кислоти на вміст ліпідів етіольованих паростків озимого жита, попередньо пророщених на середовищі із АБК і аскорбіновою кислотою (АК). Встановлено (табл. 3) [Курчій, 2001], що під впливом діквату і етилену вміст фосфатидилхоліну (ФХ) і фосфатидилінозитолу (ФІ) зменшувався. АБК послаблювала, але повністю не знімала, дію діквату і етилену на вміст цих ліпідів. Оскільки АК була менше ефективною у зменшенні рістгальмівної дії діквату, ніж АБК, ми не проводили подальших досліджень із цією кислотою.
Досліджено вплив АБК на відносний вміст жирних кислот сумарних ліпідів різних тканин етіольованих 72-годинних паростків озимого жита (табл. 4) [Курчій, 2001]. Найефективнішою була дія АБК в концентрації 1.10-7 М при внесенні в водне середовище вирощування етіольованих паростків і в 1.10-5 М для зелених паростків озимого жита. Більші концентрації АБК повністю не знімали рістінгібуючої дії діквату і етефону і, навіть, посилювала їх гальмівну дію. Одночасна обробка АБК з дікватом чи етефоном, як і обробка за 4, 6 і 12 год не зменшила рістінгібуючої дії цих регуляторів. Можливо, що для ефективної дії АБК як антиоксиданта потрібна її трансформація у інші форми, наприклад відновлення до 1',4'-діол АБК, яка як і антиоксидант гідрохінон має дві гідроксильні групи і відома як один із метаболітів АБК.
Нижче наведена схема, в якій дві ОН-групи при С1'- і С4'-атомах можуть бути активними, як антиокиснювачі, при віддачі двох атомів водню на нейтралізацію вільних радикалів (рис.6) [Курчій, 2000].
Таблиця 3 Вплив діквату і етефону на відносний вміст окремих класів фосфоліпідів (мкг, %) тканин етіольованих паростків озимого жита
Варіанти Ліпіди ФХ ФЕА ФГ ФІ ФК НІ
Контроль, Н2О 59,33±2,11 24,70±0,92 5,31±0,75 6,45±0,22 0,01±0,0 4,20±0,41
Дікват , 2,7.10-3 М 49,11±2,89 30,33±1,98 9,83±0,62 4,12±0,35 1,44±0,0 5,17±0,71
Етефон , 3,4.10-3 M 47,28±3,11 32,73±2,77 8,66±0,53 4,21±0,37 1,91±0,0 5,11±0,45
AБК, 2.10-7 М* + дікват, 2,7.10-3 М 54,31±2,78 26,44±1,87 7,22±0,76 5,72±0,42 1,51±0,0 4,86±0,39
AБК, 2.10-7 М** + етефон, 3,4.10-3 М 54,27±3,21 26,77±1,98 8,43±0,77 5,56±0,40 1,48±0,0 4,56±0,29
* пророщування в розчині AБК (1.10-7 М) протягом 24 год. до обробки дікватом
** пророщування в розчині AБК (1.10-7 М) протягом 24 год. до обробки етефоном
Розвиток ланцюгових реакцій пероксидного окиснення ліпідів за нормального (оптимального) функціонування клітини регулюється речовинами протилежної дії - антиокиснювачами, котрі нейтралізують активні вільні радикали. Аналіз структури різних метаболітів АБК свідчить, що власне антиоксидантом може бути 1',4'-дигідрооксі-АБК (структура В, рис.6) [Kurchii, 1977]. Остання, віддаючи два атоми водню на нейтралізацію вільних радикалів, переходить у вільнорадикальну структуру C. Вільнорадикальні структури АБК можуть утворювати різні кон'югати. Кон'юговані сполуки неактивні (в першу чергу як антиокисданти), або малоактивні, часто внаслідок зниження їх переміщення в тканинах (клітинах).
Таблиця 4 Вплив діквату і етефону на відносний вміст жирних кислот (мол, %) сумарних ліпідів етіольованих паростків озимого жита
Варіанти Жирні кислоти 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 НІ
Контроль 0,4±0,0 17,6±0,4 1,7±0,2 1,4±0,2 4,2±0,3 12,5±0,8 60,0±1,2 2,4±0,0
Дікват , 2,7.10-3 М 0,5±0,0 19,5±0,6 0,8±0,2 6,0±0,5 11,4±0,7 17,9±0,8 42,3±2,3 1,6±0,1
Етефон , 3,4.10-3 M 0,5±0,0 18,9±0,5 0,9±0,3 5,5±0,6 10,4±0,9 16,1±0,9 40,0±1,9 1,7±0,1
AБК (2.10-7 М)* 0,4±0,0 17,1±0,5 1,2±0,3 2,2±0,4 5,1±0,3 14,4±0,9 58,3± 2,1 2,1±0,1
AБК, 2.10-7 М* +дікват, 2,7.10-3 М 0,4±0,0 18,2±0,4 1,3±0,3 1,8±0,4 4,8±0,2 14,5±0,7 56,2±2,2 2,2±0,2
AБК, 2.10-7 М** +етефон, 3,4.10-3 М 0,4±0,0 18,5±0,5 1,5±0,2 1,9±0,4 4,9±0,3 13,8±0,8 54,2±1,9 2,1±0,2
* пророщування в розчині AБК (1.10-7 М) протягом 24 год. до обробки дікватом
** пророщування в розчині AБК (1.10-7 М) протягом 24 год. до обробки етефоном
Рис. 6. Окисно-відновний шлях метаболізму АБК.
Таким чином, нейтралізуючи вільні радикали, АБК може попереджувати деструктивний вплив останніх, і тому її присутність в рослинах у високих концентраціях закономірна. Це є захисною реакцією рослин на збільшення рівня окиснювачів у клітинах. Водночас зменшення ендогенної концентрації АБК в тканинах, яке спостерігалось через 72 год можна пояснити як її руйнуванням в реакціях нейтралізації вільних радикалів, так і недостатнім синтезом de novo.
Біологічна роль етилену і механізми його синтезу у рослинах за дії стресових чинників
На початку 80-х років було встановлено, що для вираження біологічної дії етилену потрібні іони металів змінної валентності, зокрема іони Cu1+, а також асоційовані з мембранами гіпотетичні рецептори [Sisler, Yang, 1984; Smith, Hall1984]. Інтенсивні дослідження багатьох лабораторій протягом 20-ти останніх років принципових змін у механізми дії етилену не внесли: рецептори не ідентифіковані і залишаються гіпотетичними сполуками, роль міді не з'ясована. Ідентифіковані білки, які зв'язуються з міченим етиленом [Chang, 1999; Bleecker, 1999], котрі вважаються рецепторами. Проте, є деякі сумніви в тому, що виділені білки, які зв'язувалися з міченим етиленом і є рецепторами, а не наслідком метаболічних перетворень етилену: невідомо, коли відбувається зв'язування етилену з білками – до, чи після його дії на клітинні метаболіти.
При порівняльному дослідженні біологічної дії дейтерованого (С2D4) і протонованого (С2Н4) етилену на розтягнення зрізаних коренів гороху роботами Абелеса і Руса [Abeles, Ruth, 1972] і Бейера [Beyer, 1972] не було виявлено ізотопного ефекту цих речовин. Дослідники дійшли висновку, що біологічна дія етилену не пов'язана з розривом С-Н зв'язку. Оскільки різниці з міченим і неміченим етиленом не було виявлено в дослідах цих авторів, то це є свідченням відсутності звичайних іонних реакцій. Теоретично тут можливі два типи реакцій: відщеплення і приєднання. Оскільки енергія подвійного зв'язку більша, ніж одинарного, то при звичайних умовах (температури і тиску) окиснення етилену не відбувається [Fiser, Fiser, 1964]. В той же час олефіни досить легко можуть вступати в реакції приєднання вільних радикалів. Такі реакції відбуваються без енергії активації, або при дуже малій її величині [Ingold, 1969; Nonhebel, Walton, 1974], тобто енергія зв'язку не впливає на швидкість реакції. Якщо в середовищі різних молекул утворюються вільні радикали, то це призведе до утворення окиснених сполук. Із наявних біополімерів у клітині найбільш чутливими до окиснювачів є ліпіди (ненасичені жирні кислоти) [Pryor, 1976]. При пероксидному окисненні ліпідів (ПОЛ) в результаті їх фрагментації утворюється ряд високореакційних сполук, серед яких є пероксиди, альдегіди і діальдегіди [Pryor, 1976]. Тому в подальшому ми досліджували вплив етилену на активацію ПОЛ, стан окисненості яких визначали за вмістом МДА та гідропероксидних сполук.
Ініціація пероксидного окиснення ліпідів клітинних мембран – можливий молекулярний механізм дії етилену. Отримані дані (табл. 5) [Курчій, 2001] свідчать, що вміст MДA і гідропероксидних сполук у етіольованих паростках (72-годинні колеоптилі з коренями) озимого жита збільшувався під впливом як етефону, так і діквату.
Таблиця 5 Вміст MДA і гідропероксидів в етіольованих паростках озимого жита після обробки етефоном і дікватом
Варіанти MДA мікромоль/г білка години 6 12 24 Гідроперокиди, J% . 10-3 години 6 12 24
Контроль, Н2О 29,1±1.8 27,3±2,2 28,2±1,5 5 12 17
Етефон, 3,4.10-3 М 31,2±1,4 33,2±1,6 37,3±1,8 18 27 34
Дікват, 2,7.10-3 М 30,9±1,6 34,1±1,7 36,7±2,2 16 25 31
Таким чином, як дікват, так і етилен спричиняли збільшення вмісту МДА і гідропероксидів у тканинах паростків озимого жита, що може свідчити про подібність біологічної дії обох речовин.
Оскільки механізм дії етилену тісно пов'язаний із механізмом його утворення [Abeles et al., 1992], то логічно, що певну інформацію про первинні механізми дії етилену і його біологічну роль могли б дати дані про молекулярні механізми його утворення. Принциповим тут є питання, який етилен переважає в клітині: утворений ферментативним, чи не ферментативними (альтернативними) шляхами, тобто, чи утворення етилену генетично детермінований, чи побічний процес метаболізму (деструкції) біополімерів клітини.
Синтез етилену за дії хімічних і фізичних чинників. Найбільш дослідженим шляхом утворення етилену є ферментативний із метіоніну (рис.7). Проте субклітинні місця його синтезу залишаються невідомими [Kende, 1993]. Більшість етилену, що утворюється в цитоплазмі, транспортується в вакуолярні компартменти у вигляді кислоти [Saftner, Baker1987] або її малоніл кон'югата [Bouzayen et al.,1989; Saftner1994]. Проте, чи оцінювана кількість виділеного етилену залежить від збільшення синтезу, зменшення розкладу, чи посилення транспорту залишається також невідомим.
В той же час збільшення виділення етилену під дією стресів [Abeles et al., 1992] вказує на можливість значного синтезу етилену не ферментативними шляхами. Літературні дані щодо механізмів синтезу етилену, узагальнені нами на рис.8 [Курчій, Яворська, 2001]. Гіпотетично етилен може утворюватися в різних реакціях: ферментативних, вільнорадикальних і в реакції розщеплення четвертинних амонієвих сполук за Гофманом. Таким чином, існує не менше 8 шляхів утворення етилену. При цьому одна частина (Y1) виділяється в навколишнє середовище із клітин, друга (Y2) – метаболізується або зв'язується з іншими біополімерами, а третя (Y3) - зберігається в компартментах клітини. Кількісні співвідношення між цими трьома частинами етилену невідомі.
Рис. 7. Механізм утворення етилену із метіоніну [McKeon et al., 1995].
Виходячи із того, що на виділення етилену різними тканинами впливає багато як фізичних, так і хімічних чинників, нами вивчено синтез етилену тканинами яблук (як модельний об'єкт тканини плодів яблук виділяли етилен у найбільших кількостях у порівнянні із іншими рослинами) із ключових його попередників АЦК і малоніл АЦК (МАЦК) під впливом різних БАР і за обезводнення.
Встановлено, що синтез етилену (рис.9) [Курчій, 2001] збільшувався під впливом діквату в концентрації 2,7. 10-3 М, тоді як в концентрації 2,7. 10-2 М - зменшувався. Під впливом діквату вміст АЦК зменшувався, а виділення етилену збільшувалося, досягаючи максимуму на 24 год експозиції (2,7. 10-3 М), тоді як під впливом АБК вміст обох сполук зменшувався. Аналогічні дані отримані нами і в дослідах з етіольованими паростками (72-годинні колеоптилі з коренями) озимого жита. Дікват в концентрації 2.10-3 M стимулював виділення етилену, тоді як концентрації 2.10-2 M інгібував цей процес. Таким чином, вміст МАЦК в клітинах знаходився в тісній кореляції із вмістом АЦК. Проте зв'язку між виділеним етиленом і вмістом МАЦК нами не встановлено. Можливо, що МАЦК може бути метаболітом випадкової кон'югації двох сполук.
Утворення етилену за дії хімічних стресорів досліджено у різних видів рослин: листках озимого жита (однодольні), томатів і квасолі (дводольні), вирощених в польових умовах. Утворення етилену під дією діквату та гербіцидів тордону і гліфосату наведено в табл. 6 [Курчій, Яворська, 2001]. Виявлено, що всі досліджені рослини виділяли етилен і етан. Найбільшу кількість етилену виділяли листки томатів сорту Київський, найменшу - листки жита. В наступні 24 год, тобто з 25 по 48 год, етилен утворювався в незначній кількості. Невелике збільшення утворення етилену відмічено через 72 год. експозиції, тобто в період з 49 по 72 год. Неподрібнені листки ранньостиглого сорту томатів Київський в перші 24 год виділяли в 1,6 разів більше етилену, ніж пізньостиглого сорту Донецький.
Рис. 8. Гіпотетичні шляхи утворення етилену. Сумарна кількість утвореного етилену Е=Х1 + Х2 + Х3
+ Х4 + Х5 + Х6 + Х7 + Х8 .
Рис.9. Вміст АЦК та синтез етилену в тканинах плодів яблук. А – АЦК (вільна і зв'язана), Б –МАЦК, В – етилен. 1 – контроль (Н2), 2 - дікват, 2,7. 10-3 М, 3 - дікват, 2,7. 10-2 М. Замірювання проводили через 24 і 48 годин після подрібнення тканин на куски та обробки їх дікватом на протязі 20 хвилин. Вміст АЦК перед дослідом: 20,4±0,03.
Виявлена закономірність утворення етилену і етану. Так, при утворенні великої кількості етилену, утворювалася незначна кількість етану і навпаки. Через 48 год експозиції (з 25 по 48 год) утворення етану в листках збільшилося, а етилену різко знизилося (в більшості варіантів виявлено його слідові кількості). При цьому у подрібнених листках етану утворювалося більше, ніж у неподрібнених. Через 72 год (з 49 по 72 год) утворення етилену знову збільшувалося, а етану різко зменшувалося. В подрібнених листках усіх варіантів етилену утворювалося менше, ніж у неподрібнених, проте етану більше. Так, у подрібнених листках озимого жита, квасолі і томатів в перші 24 год утворювалося відповідно 55%, 70%, 58% і 85% від такої кількості етилену, утвореного цілими листками і відповідно більше етану: 246%, 175%, 240% і 184,5%.
Після обробки рослин гербіцидами дікватом, тордоном і гліфосатом за 5 годин перед зрізанням листків для дослідів, стимулювалося різке утворення етилену в перші 24 год, етану в цей перід утворювалася незначна кількість. Найбільша кількість етилену утворювалася у листках, оброблених тордоном, менша - гліфосатом і найменша - дікватом. Наприклад, тордон в перші 24 год експозиції стимулював утворення етилену в листках озимого жита, квасолі і томатів відповідно в 3,7, 1,5, 4,8 і 7,9 разів більше. Кількість етану становила 8%, 26%, 38% і 24% відповідно від кількості. в період з 25 по 48 год у листках, оброблених гербіцидами. Етилен і етан синтезувалися у менших кількостях в порівнянні з неподрібненими листками, обробленими водою (контроль). Збільшення синтезу етилену і етану в період з 49 по 72 год відмічено в листках озимого жита і томатів, оброблених гербіцидами.
Досліджено вміст АЦК як основного відомого попередника етилену (табл. 7) [Курчій, Яворська, 2001]. Максимальна кількість АЦК виявлена перед початком дослідів. Характерно, що у варіантах, оброблених дікватом, тордоном і гліфосатом, вміст АЦК перед початком дослідів був нижчим, ніж у контрольних необроблених, проте етилену виділялося більше. Так, наприклад, у варіантах із тордоном вміст АЦК в листках озимого жита, квасолі, томатів перед початком досліду становив 4%, 1%, 12% і 8% відповідно від такої кількості виділеної необробленими цілими листками. Оскільки вміст АЦК у листках рослин, оброблених регуляторами росту, був значно нижчим, ніж у контрольних, дійшли висновку, що за дії стресів кількість етилену утворювалася не тільки із АЦК, але також і із невідомих сполук.
Утворення етилену листками томатів протягом вегетаційного періоду зазнавало значних змін. Кількість етилену у листках ранньостиглого сорту томатів Київський перевищувала таку ж пізньостиглого Донецький в 1,6 (через 24 год) і 7,7 разів (через 72 год), тоді як в період дозрівання плодів різниця була незначною. Виділення етану листками томатів сорту Донецький було інтенсивнішим, ніж Київським в фазу цвітіння і при дозріванні плодів.
Отже, нами встановлена закономірність утворення етилену ранньостиглими і пізньостиглими сортами томатів. Отримані дані свідчать, що не тільки різні види рослин продукують різну кількість етилену, але і сама рослина на різних стадіях продукує різну кількість етилену.
Аналогічна закономірність отримана нами і в дослідах з хвоєю ялини європейської або смереки (Picea abies [L.] Kersten) і ялини срібної (Abies alba Mill.). Ці рослини, синтезуючи етилен в значних кількостях, слугували нам модельним об'єктом. Хвої ялини європейської і срібної синтезували різну кількість етилену (табл.8) [Мусієнко, Курчій, 2001]. Максимальна кількість етилену виділялась з 25 по 48 год. У подрібненій хвої синтез етилену різко зменшувався. Утворення етилену супроводжувалася деструкцією хлорофілів. У рослин, оброблених гербіцидами, етилен утворювався протягом періоду вдвічі більшого (до 144-168 год), ніж у необроблених. Причина такого довготривалого виділення етилену, як і взагалі збільшення його синтезу під впливом досліджуваних БАР, залишається невідомою. Відповідь на це могли дати дані про вміст попередника етилену АЦК. Отримані дані свідчать, що вміст АЦК у хвої (табл. 9) [Мусієнко, Курчій, 2001] різко зменшувався через 24 год експозиції. У оброблених гербіцидами рослин до початку експозиції вміст АЦК був нижчим, ніж у контрольних і протягом експерименту знижувався. Таким чином, низький вміст АЦК (при різкому збільшенні виділення етилену) вказує на те, що етилен міг утворюватися також із інших, ніж АЦК, невідомих речовин, в тому числі холіну.
Таблиця 6 Утворення етилену листками озимого жита, квасолі і томатів (нмоль/г сирої речовини)
Варіанти Тривалість експозиції, год
0-24 25-48 49-72
С2Н4 С2Н6 С2Н4 С2Н6 С2Н4 С2Н6
Озиме жито
Контроль 9,2±0,3 27,4±1,3 1,4±0,0 112,3±7,1 3,3±0,2 9,1±0,4
Дікват, 1.10-3 M 15,6±0,7 1,8±0,0 сліди 112,4±7,2 3,2±0,1 34,4±1,9
Гліфосат 1.10-4 M 22,2±1,2 3,4±0,2 сліди 118,9±8,1 5,5±0,3 42,3±2,4
Тордон, 1.10-4 M 34,5±1,9 2,4±0,1 сліди 128,6±8,3 7,4±0,4 42,3±2,2
Квасоля
Контроль 23,3±1,1 33,4±2,1 1,1±0,0 119,3±7,0 2,3±0,1 13,2±1,4
Дікват, 1.10-3 M 34,3±1,9 9,4±0,5 сліди 93,5±4,6 9,3±0,4 11,2±0,7
Гліфосат 1.10-4 M 45,6±2,5 7,3±0,5 сліди 79,7±4,1 7,3±0,4 10,2±0,7
Тордон, 1.10-4 M 56,7±2,9 8,7±0,4 сліди 76,4±4,0 6,7±0,5 13,9±0,6
Томати сорт Київський
Контроль 88,1±5,2 21,5±0,7 1,5±0,0 160,6±9,2 1,3±0,0 5,8±0,3
Дікват, 1.10-3 M 205,1±12,2 10,2±0,5 сліди 124,7±6,9 сліди 17,6±0,9
Гліфосат 1.10-4 M 256,3±14,6 12,4±0,6 сліди 156,6±8,8 сліди 15,3±0,9
Тордон, 1.10-4 M 424,3±29,1 8,3±0,5 сліди 168,6±9,4 сліди 18,8±1,0
Томати сорт Донецький
Контроль 53,3±2,4 27,4±1,4 2,1±0,0 168,5±9,2 3,3±0,1 10,3±0,2
Дікват, 1.10-3 M 240,5±13,3 8,2±0,7 сліди 143,6±8,2 сліди 26,6±14,2
Гліфосат 1.10-4 M 330,5±20,3 9,7±0,5 сліди 129,9±6,6 сліди 19,4±1,1
Тордон, 1.10-4 M 430,4±22,7 6,7±0,8 сліди 138,2±6,8 сліди 17,6±0,9
Таблиця 7 Вміст АЦК в листках озимого жита, квасолі і томатів
Варіанти АЦК вільна i зв'язана (нмоль/ г . сирої речовини )
Тривалість експозиції, год
0 0-24 25-48
Озиме жито
Контроль 4,2±0,21 1,1±0,06 0,6±0,04
Дікват, 1.10-3 M 0,5±0,03 0,3±0,00 0,2±0,00
Гліфосат 1.10-4 M 0,2±0,02 0,2±0,00 0,1±0,00
Тордон, 1.10-4 M 0,2±0,01 0,2±0,00 0,1±0,00
Квасоля
Контроль 5,6±0,32 1,4±0,08 0,7±,0,06
Дікват, 1.10-3 M 0,2±0,05 0,2±0,00 0,1±0,00
Тордон, 1.10-4 M 0,1±0,04 0,1±0,00 0,1±0,00
Гліфосат 1.10-4 M 0,1±0,02 0,2±0,00 0,1±0,00
Томати сорту Київський
Контроль 7,3±0,05 1,7±0,01 1,5±0,01
Дікват, 1.10-3 M 1,1±0,01 0,7±0,04 0,4±0,03
Тордон, 1.10-4 M 0,7±0,04 0,6±0,04 0,3±0,03
Гліфосат 1.10-4 M 0,9±0,02 0,2±0,02 0,1±0,00
Томати сорту Донецький
Контроль 8,4±0,05 1,6±0,09 1,4±0,08
Дікват, 1.10-3 M 1,2±0,07 0,5±0,04 0,2±0,02
Тордон, 1.10-4 M 0,7±0,04 0,6±0,03 0,2±0,01
Гліфосат 1.10-4 M 0,7±0,02 0,2±0,01 0,1±0,02
Отже, в стресових умовах при зниженні активності ферментів [Schuppler et al., 1998], нами встановлено активацію синтезу етилену. Одним із джерел утворення етилену могло бути пероксидне окиснення ліпідів клітин. Процеси інтенсивності ПОЛ тісно пов'язані із ліпідним і жирнокислотним складом мембранних структур [Pryor, 1976]. Визначення окремих класів ліпідів до і після виділення етилену тканинами яблук і етіольованими паростками озимого жита показало, що найбільших змін зазнавали ФХ і ФІ, відносний вміст яких зменшувався. Такі зміни можуть призводити до порушення біохімічного складу мембран клітин.
Ліпіди і жирні кислоти, виділені із тканин, так і окремо із ізольованих мембран, відрізнялися за своїм складом, що може свідчити про значні порушення у мембранах при їх ізоляції і екстракції. Визначення жирних кислот ліпідів проведено також на паростках озимого жита [Курчій, 2001]. Внаслідок зневоднення паростків озимого жита і тканин плодів яблук відбулося зменшення кількості ненасичених жирних кислот, таких як лінолева, ліноленова і гексадецинова при одночасному збільшенні вмісту насичених пальмітинової і стеаринової кислот. Таким чином, порушення структури мембран, супроводжувалося активацією окиснювальних процесів, а також утворення етилену у рослинах. В той же час механізми активації утворення етилену за дії стресорів залишалися невідомими.
Таблиця 8
Синтез етилену хвоєю ялини європейської під впливом тордону
Варіанти Етилен (нмоль/г сирої речовини )
Час експозиції, год*
0-24 25-48 49-72 73-96
С2Н4 С2Н6 С2Н4 С2Н6 С2Н4 С2Н6 С2Н4 С2Н6
Ялина європейська
Контроль 31,1±1,7 8±0,5 94,2±6,1 сліди 150,5±7,8 15,6±0,8 38,6±3,1 41,7±1,8
Тордон, 1.10-4 M 45,3±2,3 13,3±0,7 167,4±9,1 8,4±0,4 225,8±13,4 24,5±0,9 54,4±1,9 376,4±19,3
*години після поміщення хвої у флакони для акумуляції етилену.
Таблиця 9 Вміст АЦК у хвої ялини європейської під впливом тордону
АЦК вільна i зв'язана (нмоль / г сирої речовини)
Час експозиції, год*
0 24 48
Ялина європейська
Контроль 1,23±0,07 0,82±0,05 0,24±0,01
Тордон, 1.10-4 M 0,37±0,02 0,13±0,00 0,01±0,00
*години після поміщення хвої у флакони для акумуляції етилену
Похідні холіну – продуценти етилену. Як зазначено вище найбільше чутливими до дії стресів виявилися холіновмісні ліпіди. За структурною будовою холін містить четвертинний атом азоту. Згідно з правилом Гофмана (Hofmann A.W.) , сполуки, які містять четвертинний атом азоту можуть розкладатися з утворенням олефінів [Cope, 1960]:
Холіновмісні ліпіди мембран можуть розкладатися з утворенням холіну [Овчинников, 1987]. У живих системах холін також представлений у формі ацетилхоліну. Ендогенний регулятор росту живих організмів ацетилхолін (ACh) являється сполукою з четвертинним атомом азоту, теоретично здатною при розкладі утворювати етилен. Досліджено виділення етилену in vitro різними похідними холіну в залежності від величини рН і природи буферного розчину.
В першій серії експериментів вивчили розклад ACh.HCl і ACh.HJ, холіну.HCl і CCC в 0.1 M Tris-HCl буферах (pH 6.0, 7.35, 8.3 і 9.8) і NH4OH (5 M). Тільки невелика кількість етилену була виявлена у флаконах, котрі містили Tris-HCl буфери (табл.10) [Kurchii, Kurchii, 2000]. Максимальна кількість етилену при розкладі цих сполук у лужному середовищі виявлена у флаконах із NH4OH. Отже виділення етилену з ACh і холіну.HCl у Tris- HCl буферах було незначним. В той же час виділення етилену з ACh і холіну у MOPS і фосфатному буферах було вищим, ніж у Tris- HCl буферах.
В іншій серії дослідів розклад цих речовин нами досліджено у водних розчинах окиснювачів перекису водню (0.01 M) і реагенті Фентона (0,2 г/л Fe2+ + 0,2% H2O2). Всі досліджувані сполуки виділяли етилен, максимальну кількість якого зафіксовано у флаконах з ACh.HJ. Утворення метану і етилену з ACh.HCl і ACh.HJ у розчинах перекису водню і реактиву Фентона виявлено через 1 хв. В той же час з холіну за цих умов етилен виділявся у слідових кількостях.
Досліджена можливість розкладу ACh під дією вільних радикалів. При УФ-опроміненні водних розчинів ацетилхоліну утворювався метан, етилен і ацетилен. Значне утворення метану виявлено також при розкладі ACh у флаконах із перекисом водню і реагентом Фентона. Причому із збільшенням концентрації перекису водню і реактиву Фентона кількість виділеного метану збільшувалася. Взявши до уваги дані наших попередніх дослідів, можливий механізм розкладу ACh і його біологічної активації приводимо на рис.10 [Kurchii, Kurchii, 2000].
Як відмічено вище, дікват і етилен спричиняли значні зміни у складі ліпідів і жирних кислот тканин паростків озимого жита, а також активували ПОЛ, що підтверджується збільшенням вмісту МДА і гідропероксидних сполук. В свою чергу, активація процесів ПОЛ, зменшення кількості ненасичених і збільшення насичених жирних кислот може мати негативний вплив на функціонування мембран в цілому і призводити до різних патологій [Pryor, 1976].
За хімічними властивостями етилен є досить інертною сполукою, але він може легко вступати в реакції приєднання вільних радикалів, котрі різко збільшують його реакційну здатність. Із ідентифікованих метаболітів етилену оксид етилену кількісно переважає інші метаболіти [Abeles et al., 1992 ] і його реакційна здатність значно вища за етилен [Fiser, Fiser, 1964]. Враховуючи як високу реакційну здатність оксиду етилену, так і його долю серед метаболітів, ми вважаємо, що він може бути основним хімічно активним метаболітом етилену.
Експериментально встановлено окиснення етилену з утворенням оксирану ферментативним шляхом [Abeles et al., 1992]. Ми запропонували і не ферментативні шляхи окиснення етилену в стресових умовах, коли в клітинах різко зменшується вміст НАДФН і гальмується активність ферментів, в тому числі монооксигеназ. На фоні різкого зменшення кількості відновлювальних агентів і активності ферментів, посилення деструктивних процесів зумовлюється не ферментативним окисненням речовин клітини, в тому числі і оксидом етилену. Утворення оксиду етилену може відбуватись при взаємодії з пероксидними радикалами, атомарним киснем, гідропероксидом з утворенням оксирана і трансгліколю [Курчий, 1990].
Таблиця 10 Виділення етилену in vitro з ацетилхоліну і різних етиленпродуцентів
Етилен, нг/л
ACh . HCl ACh . HJ Холін . HCl CCC
Tris-HCl , 0.1 M, pH 6,0 1±0,02 41±2,2 Сліди 1±0,01
7,3 2±0,03 65±4,2 Сліди 2±0,02
8,3 1±0,01 35±1,9 Сліди 3±0,03
9,8 1±0,03 26±2,2 Сліди 4±0,04
H2O2, 0.01 M 43±1,8 158±11,3 3±0,02 9±0,5
NH4OH, 5 M 18±0,9 87±6,4 21±0,8 8±0,3
Реагент Фентона 14±0,7 114±9,8 3±0,03 6±0,7
Фосфатний буфер, pH 6,0 Сліди 61±3,4 Сліди 3±0,02
7,35 Сліди 77±3,6 Сліди 6±0,4
8,0 2±0,02 88±3,8 Сліди 9±0,8
MOPS буфер, pH 6,0 2±0,02 52±2,6 Сліди 3±0,01
7,35 4±0,03 67±2,8 Сліди 8±0,05
8,3 6±0,04 75±3,7 Сліди 10±0,7
NaCl (0,9%) 14±0,7 62±3,9 12±0,6 Сліди
KCl (0,9%) Сліди 35±1,4 Сліди Сліди
CaCl2 (0.9%) Сліди 46±2,8 Сліди Сліди
Рис. 10. Розклад ACh з виділенням етилену і можливий вільнорадикальний механізм його активації і дії.
У зв'язку з високою реакційною здатністю, оксид етилену може зв'язуватися з молекулами клітини, утворюючи кон'югати. Тому зменшення виділення етилену тканинами (після досягнення максимального значення) під дією як фізичних, так і хімічних чинників, на нашу думку, може бути також наслідком його окиснення і зв'язування з речовинами клітини, можливо без зниження його утворення.
Молекулярний механізм дії етилену точно невідомий, хоча багато первинних реакцій уже добре вивчені [Abeles et al., 1992; Bleecker, 1999; Chang, Shockey, 1999]. Базуючись на даних наших експериментів і літературних даних дійшли висновку, що біологічна дія етилену може бути зумовлена утворенням in vivo вільних радикалів при взаємодії із низькомолекулярними алкоксильними, пероксильними або гідроксильними радикалами.
Маючи малі молекулярну масу і стеричні розміри, етилен може вільно переміщуватися по клітині. Проходячи через мембрану, він може легко переходити у вільнорадикальний стан уже в самій її ліпідній фазі, яка містить гідропероксиди ліпідів. Вільні радикали етилену - високореакційні частинки, котрі і запускають ланцюг ферментативно неконтрольованих окисно-відновних реакцій спочатку в ліпідах мембран, а потім і в цитоплазмі.
Таким чином, утворення етилену за дії хімічних чинників може бути наслідком розкладу ряду біогенних сполук при активації окиснювальних процесів. Тому механізми утворення етилену за дії стресів і його біологічна дія не є пов'язані між собою біохімічні процеси. В той же час активування процесів окиснення тканин, може бути автокаталітичним процесом збільшення синтезу етилену.
механізми взаємодії ЕТИЛЕНУ І АБСЦИЗОВОЇ КИСЛОТИ
В процесі метаболізації етилен окиснюється до окису етилену в присутності НАДФН [Smith and Hall, 1984]. Окис етилену високореакційна сполука, здатна взаємодіяти з такими біополімерами клітини як ДНК і білки [Bono et al., 1999]. Високореакційні сполуки можуть також утворюватися в результаті реакції приєднання ендогенних метаболічних вільних радикалів до етилену (рис. 11) [Курчий, Койдан, 1985; Kurchii, 2001].
Вільнорадикальні реакції у клітині не обмежуються тільки окисненням ДНК і білків, а поширюються також на ліпіди, в тому числі і ліпідами мембран. В загальному вигляді первинний механізм дії біорегуляторів представлено на рис.12 [Kurchii, Klochenko, 1998].
|
