Таблиця 2. Вміст NAD та NADP у головному мозку і синаптосомах при паркінсонізмі (нмоль на 1 г сирої маси, M ± m, n = 6 – 8).
На фоні зниженого рівня нуклеотидів за умов патології, імовірно, що і рецепція нуклеотиду синаптичними мембранами могла б зазнавати змін. Як і припускалось, рецепція NAD синаптичними мембранами тварин, хворих на паркінсонізм, зменшувалась при цій патології на 29% (рис.10). Таке зниження рецепції NAD може бути результатом порушення функціонування рецепторних ділянок синаптичних мембран.
Рис. 10. Зв'язування [U-14C] NAD синаптичними мембранами головного мозку щурів: 1- контроль, 2 - паркінсонізм, 3 - паркінсонізм + NAm, 200 мг/кг,
паркінсонізм + пікамілон, 200 мг/кг.
Як показав аналіз зв’язування [U-14C]NAD синаптичними мембранами паркінсонічних щурів, у координатах Скетчарда спостерігалось зниження кількості місць зв’язування NAD, про що свідчить зменшення Bmax з 7,8 до 5,1 пмоль/мг білка, в той час як спорідненість до нуклеотиду не змінювалась, КД викокоспецифічної компоненти становила 0,34 мкМ (рис.11).
Рис. 11. Зв’язування [U-14C]NAD синаптичними мембранами в нормі та при паркінсонізмі (1) та його графічний аналіз за Скетчардом (2): 1-контроль; 2-паркінсонізм; 3-паркінсонізм +NAm.
Згідно з представленими на рис.11 даними стає очевидним, що відновлення рецепції нуклеотиду при введенні NАm та пікамілону відбувалося за рахунок збільшення кількості NAD-рецепторних ділянок синаптичних мембран, що дозволяло стверджувати, про можливість опосередкованої дії цих препаратів через NAD, який специфічно рецептується синаптичними мембранами.
Нами показано, що при паркінсонізмі поглинання [2-14С]серотоніну, [2-14С]дофаміну та [U-14C]ГАМК синаптосомами головного мозку щурів зазнає суттєвих змін (рис.12). При введенні NАm та пікамілону (200 мг/кг), NАm проявляв більш виражену коригуючу дію на поглинання серотоніну, в той час як пікамілон – на ГАМК.
Рис. 12. Поглинання
[2-14С]серотоніну, [2-14С]дофаміну та [U-14C] ГАМК синаптосомами кори головного мозку щурів:
1 - контроль; 2,5,8 – паркінсонізм;
3,6,9 – паркінсонізм + NAm;
4,7,10 - паркінсонізм + пікамілон.
Відомо, що процеси вивільнення медіаторів із нервових закінчень тісно пов’язані з процесами їх зворотнього поглинання. Вивчення процесів вивільнення досліджуваних медіаторів із попередньо навантажених ними синаптосом показало, що вивільнення всіх трьох медіаторів при цій патології зменшувалось, а введення NАm (200 мг/кг), а також внесення в середовище інкубації синаптосом NAD (10-6M) призводило до часткової нормалізації процесу вивільнення медіаторів, що може бути свідченням того, що вітамін РР діє через NAD-ЗБ.
На сьогодні мало відомо про роль NAD-глікогідролази, одного із основних ферментів деградації NAD, у функціонуванні нервової системи. Як видно з представлених у табл. 3 даних, при паркінсонізмі, NAD-глікогідролазна активність в синаптосомах головного мозку піддослідних тварин підвищена на 32 % порівняно з контролем.
Таблиця 3. NAD-глікогідролазна активність синаптосом головного мозку щурів (нмоль розщепленого NAD на 1 мг білка за 1 хв, n = 6)
Тобто, незважаючи на зменшення рівня субстрату в синаптосомах, який інтенсивно використовується в реакціях біологічного окислення, а також в інших процесах, спостерігалось зростання NAD-глікогідролазної активності (табл. 3).
Введення NAm, який є специфічним інгібітором NAD-глікогідролази, призводило до гальмування активності ферменту на 20% порівняно з паркінсонічними тваринами. Пікамілон, на відміну від нікотинаміду, не впливав на NAD-глікогідролазну активність.
Одержані дані дають змогу стверджувати, що зростання NAD-глікогідролазної активності синаптосом мозку можна вважати одним із патогенетичних факторів розвитку дисфункцій ЦНС при паркінсонізмі.
Таким чином, одержані дані свідчать про те, що коригуюча дія вітаміну РР та його похідних при паркінсонізмі опосередкована через NAD-ЗБ, що не виключає можливості їх дії і через інші біохімічні механізми, наприклад, дія пікамілону може бути опосередкована через ГАМК-ергічну систему.
Реалізація нейротропної дії вітаміну РР та його похідних за умов діабетичних полінейропатій.
Діабетична нейропатія є ускладненням цукрового діабету, патогенез якого на сьогодні вивчений ще недостатньо. Для того, щоб оцінити стан нікотинамідних динуклеотидів при ІЗЦД, був визначений рівень нікотинамідних динуклеотидів у мозку та сідничному нерві щурів, який при діабеті знижується. Введення експериментальним тваринам NAm та пікамілону призводило до відновлення їх рівня.
Оскільки при ІЗЦД вміст нікотинамідних нуклеотидів знижувався, то не виключено, що за умов патології могла зазнавати змін і рецепція нуклеотиду синаптичними мембранами. Було виявлено порушення рецепції NAD при цій патології, яке коригувалось при введенні NAm та частково нормалізувалось при застосуванні нікотиноїл-ГАМК. Той факт, що рецепція нуклеотиду при діабеті зазнає змін, дозволив припустити, що процеси зворотнього поглинання та вивільнення також порушені. Як і припускалось, було показано, що процеси поглинання та вивільнення серотоніну, дофаміну та ГАМК при діабеті зазнавали суттєвих змін. Введення щурам NАm та пікамілону, а також інгібіторів альдозоредуктази призводило до корекції цих процесів.
Вивчаючи процеси нейротрансмісії, не можна не зупинитися на ролі іонів кальцію. Було показано, що при діабеті поглинання 45Са2+ синаптосомами кори головного мозку щурів відбувається спочатку досить інтенсивно як у контрольних тварин, так і у діабетичних, і на 20 хв виходить на насичення (рис.13).
Рис. 13. Поглинання 45Са2+ синаптосомами кори головного мозку щурів: 1 - контроль; 2 - діабет; 3 - діабет + NAm.
Збільшення поглинання 45Са2+ нервовими закінченнями при діабеті на 36% порівняно з показниками контролю, узгоджується зі зростанням вивільнення досліджуваних медіаторів. Введення діабетичним щурам нікотинаміду призводило до зниження поглинання 45Са2+, тобто до часткової нормалізації цього процесу (рис.13). Можна припустити, що механізм дії NAm полягає в його здатності модифікувати кальцій-залежні калієві канали, або ж він діє безпосередньо на кальцієві канали, чи на ті білки пресинаптичної мембрани, які контролюють злиття пухирців з пресинаптичною мембраною, особливо на такий білок, як синаптотагмін, що є ключовим Са2+ сенсором (Littleton J.T. et al., 1995). Одержані дані є вагомим доказом участі NAm у процесах передачі нервового імпульсу.
Добре відомо, що окисно-відновний стан нікотинамідних динуклеотидів є важливим фактором регуляції процесів обміну вуглеводів, ліпогенезу та енергетичного обміну. Тому було доцільним з’ясувати стан окислених і відновлених субстратів, які відображують редокс-стан нікотинамідних динуклеотидів.
Виявлено, що величини cпіввідношення вільних NAD/NADH та NADР/NADРH-пар, які розраховували за активністю відповідних дегідрогеназних систем головного мозку діабетичних щурів, знижувались у 3,5 і 2,2 раза, відповідно, що призводило до інтенсифікації глюконеогенезу при діабеті (табл.4).
Таблиця 4. Вміст метаболітів (мкмоль/г тканини) та редокс стан NAD(P)/ NAD(P)H-пар у головному мозку стрептозотоцин-діабетичних щурів, М ± m, n=7-10
Введення діабетичним щурам нікотинаміду, пікамілону та інгібіторів альдозоредуктази (AL-1576, сорбініл, унітіол) призводило до нормалізації окисно-відновного стану нікотинамідних динуклеотидів, але різною мірою, залежно від досліджуваної сполуки.
Аналогічну закономірність спостерігали при дослідженні редокс-стану нікотинамідних нуклеотидів у сідничному нерві.
Одержані дані дозволяють стверджувати, що, з одного боку, вітамін РР та його похідні модулюють процеси захвату та вивільнення деяких медіаторів у мозку діабетичних щурів, діючи через NAD-ЗБ, а з другого, - нормалізують редокс-стан вільних NAD(P)- пар як у мозку, так і в сідничному нерві, зміна котрого в бік відновленості призводить до активації поліолового шляху обміну глюкози. В результаті активації поліолового шляху обміну глюкози накопичується сорбітол. Це супроводжується порушенням осмотичних явищ, що призводить до ряду інших патологічних змін.
Нами показано, що вміст сорбітолу в головному мозку стрепозотоцин-діабетичних щурів значно збільшений, причому ступінь його накопичення варіює в різних відділах мозку.
Показано, що в мозку та сідничному нерві діабетичних тварин вміст сорбітолу збільшений у 3,1 та 10,7 раза порівняно з контролем (табл.5). Введення щурам нікотинаміду, пікамілону та інгібіторів альдозоредуктази створювало нову метаболічну ситуацію. Вона характеризувалась пригніченням
Таблиця 5. Вміст cорбітолу в головному мозку та сідничному нерві стрептозотоцин-діабетичних щурів, мкмоль/г тканини, М ± m, n=6-9
синтезу сорбітолу в альдозоредуктазній реакції та активацією перетворення його в сорбітолдегідрогеназній реакції, в результаті чого частково або повністю нормалізувався рівень сорбітолу в мозку та сідничному нерві.
Було виявлено, що при діабеті в сідничному нерві активність альдозоредуктази та сорбітолдегідрогенази змінювалась, а введення нікотинаміду та інгібітору альдозоредуктази AL-1576 призводило до часткової корекції активностей досліджуваних ферментів, що в свою чергу нормалізувало функціонування поліолового шляху обміну глюкози.
Як наслідок обумовленої надлишком сорбітолу гіперосмолярності відбувалася гідратація клітин з акумуляцією в них Nа+ та одночасною втратою К+, що в свою чергу могло змінювати активність Na+,K+-ATPази.
Показано, що при діабеті (1 місяць) активність Na+,K+-ATPази в синаптосомах, синаптичних мембранах, мікросомах головного мозку та сідничному нерві діабетичних щурів знижена, що узгоджується зі збільшенням вивільнення досліджуваних медіаторів, причому виразніше при більш тривалому діабеті (1,5 місяця). Введення інгібіторів альдозоредуктази AL-1576 та сорбінілу, а також пікамілону призводило до часткового відновлення її активності в досліджуваних фракціях.
ЗАКЛЮЧЕННЯ
Електрофізіологічні та біохімічні дослідження показали специфічну дію вітаміну РР та його похідних на передачу гальмівних та збуджуючих імпульсів нервово-м’язевих клітин шлунково-кишкового тракту та сечового міхура (Халмурадов и др., 1980; Романенко А.В., 1981), однак потребували подальших досліджень для виявлення більш конкретних механізмів, які відповідальні за нейротропну дію вітаміну РР та його похідних.
Результати проведених нами досліджень дозволили з’ясувати деякі конкретні механізми біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі. Вперше встановлено факт існування мембранної NAD-модуляторної системи, що приймає участь у передачі нервового імпульсу. Функція цієї системи - концентраційно-залежна модуляція нікотинамідаденіндинуклеотидом вивільнення та зворотнього поглинання серотоніну, дофаміну та ГАМК у нервових закінченнях. Виявлено, що NAD-зв’язуючі ділянки синаптичних мембран є гліколіпопротеїдними комплексами, в ліганд-рецепторний центр яких входять SH-групи. Були визначені оптимальні умови солюбілізації NAD-ЗБ, його виділення та очищення. Електрофоретично визначена у присутності ДСН молекулярна маса очищеного NAD-ЗБ становила близько 120 кД.
Показано, що NAD концентраційно-залежно знижує трансмембранний потенціал плазматичної мембрани нервових закінчень.
Одержані дані мають важливе значення в теоретичному аспекті, оскільки розкривають один із механізмів реалізації дії NAD у нервовій системі через NAD-ЗБ, який є функціональною складовою частиною синаптичних мембран нервових закінчень.
Відомо, що між різними медіаторами існують відносно складні функціональні взаємозв’язки (Shukla V.et al.,1988; Куценко С.А.и др.,1989). Для вивчення зв’язку NAD-модуляторної системи з серотонін-, дофамін- та ГАМК-ергічною медіаторними системами головного мозку щурів були проведені дослідження на деяких експериментальних моделях (РР-гіповітаміноз, хвороба Паркінсона, діабетична нейропатія). Показано, що коригуюча дія вітаміну РР та його похідних на серотонін-, дофамін- та ГАМК-ергічну медіаторні системи головного мозку, імовірно, здійснюється через NAD-ЗБ та через їх участь в метаболічних процесах, серед яких важливе місце належить окисно-відновним. Виявлено, що пресинаптична мембрана відіграє важливу роль у прояві модулюючої дії NAD.
Суттєве значення має встановлення того факту, що при РР-гіповітамінозі порушується функціонування серотонінергічної медіаторної системи, а саме: рецепція серотоніну синаптичними мембранами, його поглинання та вивільнення нервовими закінченнями, що залежить від рівня забезпеченості вітаміном РР. Так, на фоні зниженого рівня NAD у мозку щурів мало місце зменшення його специфічного зв’язування синаптичними мембранами, що в свою чергу призводило до послаблення модулюючої дії нуклеотиду на серотонінергічну медіаторну систему. Тобто, виявлений лікувальний ефект вітаміну РР полягав у відновленні рецепції NAD синаптичними мембранами, що нормалізувало функціонування серотонінергічної медіаторної системи.
Важливим моментом у дослідженнях було встановлення факту, що нікотинамід проявляв коригуючу дію на процес поглинання Са2+ нервовими закінченнями, імовірно, діючи на канальні структури. Підтвердженням цього є дані, що дезаміноване похідне NAD -NAАDP (нікотинат аденін динуклеотид фосфат), попередником синтезу якого може бути NAm, є особливим регулятором процесу вивільнення внутрішньоклітинного Са2+ через специфічні дотепер невідомі Са2+-канали (Chini E.N. et al., 1995).
Оскільки окисно-відновний стан нікотинамідних динуклеотидів (Великий М.М. ті ін., 1992) у нервовій системі досліджений недостатньо, ми вважали доцільним охарактиризувати значення вільних NAD(P)пар для мозку та сідничного нерва. Одержані дані продемонстрували, що зміна співвідношення NAD(Р)/NAD(Р)H-пар у бік відновленості, активація поліолового шляху обміну глюкози, що супроводжується накопиченням сорбітолу у мозку і сідничному нерві та зниження активності Na+,K+-ATPази в цих тканинах при діабеті є патогенетичними факторами, які призводять до розвитку діабетичної нейропатії. Введення нікотинаміду, пікамілону та інгібіторів альдозоредуктази, підвищуючи відношення NAD(Р)/NAD(Р)H-пар, створювало принципово нову метаболічну ситуацію, яка характеризувалась пригніченням функціонування поліолового шляху обміну глюкози, в результаті чого зменшувалось утворення сорбітолу та зростала активність Na+,K+-ATPази.
Отримані нами нові дані, а також дані літератури не розкривають всі біохімічні механізми, що зумовлюють специфічну дію вітаміну РР та його похідних у збудливих клітинах. Однак, аналіз результатів проведених нами досліджень свідчить про те, що їх дія здійснюється через NAD-ЗБ та участь в обміні речовин. Одержані дані лягли в основу формування уявлення про процеси, які відбуваються у нервових закінченнях під впливом вітаміну РР та його похідних, що сприяє розкриттю механізмів їх біологічної дії у нервовій системі.
Грунтуючись на результатах досліджень, а також враховуючи дані літератури, вперше була сформульована гіпотетична схема реалізації специфічної дії вітаміну РР та його похідних у функціонуванні нервової системи.
Ключове положення гіпотези полягає в тому, що в нервових закінченнях існує NAD-модуляторна система. До складу цієї системи відносимо, (звичайно, умовно) чотири структурно та функціонально взаємозв’язані частини. Перша - підтримує концентраційний і компартменталізаційний пул нікотинамідних нуклеотидів, який може поповнюватися за рахунок їх синтезу із NAm, NA або з триптофану, у синаптичних пухирцях і синаптосомах. Вона представлена ферментами обміну і системами транспорту NAD. Друга - NAD-ЗБ - інтегральний білок синаптичних мембран, що забезпечує специфічне зв’язування NAD і функціонує приймачем, перетворювачем і виконавцем дії сигналів, якими в даному випадку є локальні концентрації NAD біля внутрішньої та зовнішньої поверхні пресинаптичної мембрани. Конформаційні зміни NAD-ЗБ, та викликані ними ще маловідомі зміни пресинаптичної мембрани, модулюють роботу третьої та четвертої складових системи – вивільнення і зворотнього поглинання досліджуваних медіаторів. Оскільки, NAD може бути супутником медіаторів, то потрапивши у синаптичну щілину він діятиме також на зовнішні поверхні пре- і постсинаптичної мембрани. Імовірно, що в реалізації модуляторної дії вітаміну РР та його похідних на серотонін-, дофамін- та особливо на ГАМК-ергічну системи беруть участь бензодіазепінові рецептори, лігандом яких є NАm.
Можна вважати, що вивчення сукупного функціонування дослід-жуваних шляхів біологічної дії вітаміну РР та його похідних дозволило представити загальну картину регуляції метаболічних перетворень, які мають місце в нервовій системі в умовах in vivo, як при нормальних фізіологічних, так і при патологічних станах.
Встановлені різними авторами сприятливі терапевтичні ефекти NA, NAm та їх біологічно активної форми NAD при лікуванні епілепсії, шизофренії, енцефаломієліту та психозів різної етіології (Максимович Я.Б., 1981; Браславский В.Е. и др., 1982; Житнухин Ю.Л. и др., 1998), а також виявлена нами коригуюча дія досліджуваних сполук при лікуванні РР-гіповітамінозу, хвороби Паркінсона та діабетичної нейропатії, вірогідно, реалізуються через NAD-ЗБ, забезпечуючи механізми контролю за секрецією та поглинанням досліджуваних нейромедіаторів, а також через їх участь у метаболічних процесах.
Сукупність одержаних даних проливає світло на дотепер не з’ясовану послідовність молекулярних процесів, які відбуваються у клітинах нервової системи при вітамін РР-недостатності, розкриває нові аспекти механізмів біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі та ставить дуже важливе питання щодо універсальності модулюючої дії NAD у нервовій системі.
Таким чином, з’ясування деяких конкретних механізмів біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі показало їх важливу роль у регуляторних процесах у збудливих клітинах, що дасть змогу сконцентрувати подальші дослідження в найбільш перспективному напрямку.
ВИСНОВКИ
1. В зв’язку з відсутністю даних щодо механізмів біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі проведено дослідження, які дозволили встановити факт існування NAD-залежної модуляторної системи нервових закінчень, функція якої у передачі нервового імпульсу здійснюється через концентраційно-залежну модуляцію нікотинамідаденіндинуклеотидом вивільнення та зворотнього поглинання серотоніну, дофаміну та ГАМК.
2. Встановлено, що нікотинамідні динуклеотиди є природними компонентами синаптосом та синаптичних пухирців головного мозку щурів, виявлено наявність системи синтезу та розпаду NAD у нервових закінченнях.
3. На синаптичних мембранах головного мозку щурів виявлені ділянки, які специфічно зв’язують NAD, Кд високоафінної компоненти становить 0,34 мкМ. Встановлено, що для специфічного зв’язування NAD з синаптичними мембранами необхідно збереження структурної цілісності молекули динуклеотиду.
4. Показано важливість збереження нативної структури плазматичних мембран нервових закінчень для специфічної рецепції NAD та виявлено, що NAD-зв’язуючі ділянки є гліколіпопротеїдними комплексами, в ліганд-рецепторний центр яких входять SH-групи.
5. Виявлено в синаптичних мембранах нервових закінчень NAD-зв’язуючий білок (NAD-ЗБ) та підібрані оптимальні умови для його виділення та очищення зі збереженням нативних властивостей. Визначено молекулярну масу NAD-ЗБ, яка становить близько 120 кД, та доведено, що він є білком-рецептором специфічним для NAD.
6. Встановлено, що пресинаптична мембрана нервових закінчень головного мозку щурів є одним із можливих місць модулюючої дії NAD на процеси вивільнення та зворотнього поглинання медіаторів.
7. Виявлено, що NAD, специфічно зв’язуючись синаптичними мембранами головного мозку, концентраційно-залежно знижує трансмембранний потенціал нейрональної мембрани, тобто проявляє деполяризуючу дію.
8. Встановлено, що при РР-гіповітамінозі у мозку тварин порушено функціонування серотонін- та ГАМК-ергічноі системи. При РР-гіповітамінозі відмічено зниження вмісту NAD та його специфічного зв’язування синаптичними мембранами, а також зниження вмісту серотоніну у мозку, рівня його специфічного зв’язування синаптичними мембранами, гальмування поглинання і вивільнення серотоніну синаптосомами. Вміст ГАМК при РР-гіповітамінозі у мозку щурів підвищувався тоді, коли поглинання ГАМК синаптосомами зменшувалось. Тривале введення NAm РР-гіповітамінозним тваринам нормалізувало вміст NAD, серотоніну та ГАМК у мозку, а також рецепцію серотоніну, поглинання серотоніну та ГАМК та вивільнення серотоніну. Показано, що часткове відновлення функціонування серотонін- та ГАМК-ергічної систем мозку при введенні NAm реалізується не прямим шляхом, а опосередковано через NAD-ЗБ. Обгрунтовано модулюючу роль вітаміну РР та його похідних, а також важливість NAD-рецепторної системи при різній забезпеченості організму вітаміном РР та його біоактивними похідними.
9. Встановлено, що коригуюча дія NAm та нікотиноїл-ГАМК при експериментальному паркінсонізмі, яка супроводжується, з одного боку, нормалізацією рівня NAD(Р) у мозку та синаптосомах, а з другого – нормалізацією функціонування NAD-ЗБ, через який коригуються процеси поглинання та вивільнення серотоніну, дофаміну та ГАМК, які зазнають суттєвих змін при цій патології. Виявлено важливу роль NAD-глікогідролази у патогенезі розвитку дисфункцій ЦНС при паркінсонізмі.
10. Показано коригуючу дію NAm та нікотиноїл-ГАМК на рівень NAD(Р) у мозку, рецепцію NAD синаптичними мембранами, функціонування серотонін-, дофамін- та ГАМК-ергічної медіаторних систем, поглинання Са2+ нервовими закінченнями та активність Na+,K+-ATP-ази у мозку та сідничному нерві за умов діабетичної нейропатії, що сприяє нормалізації дисфункцій нервової системи при цьому ускладненні діабету.
11. Проведені дослідження дозволили оцінити окисно-відновний стан NAD(P)/ NAD(P)H-пар цитозолю та функціонування поліолового шляху обміну глюкози за умов діабетичної нейропатії. Показано коригуючу дію NАm, нікотиноїл-ГАМК та інгібіторів альдозоредуктази (AL-1576, сорбінілу, унітіолу), які, з одного боку, модулюють процеси поглинання та вивільнення досліджуваних медіаторів у мозку діабетичних щурів in vivo, а з другого - нормалізують редокс-стан вільних NAD(P)/NAD(P)H-пар та поліоловий шлях обміну глюкози.
12. Проведені дослідження дозволили запропонувати гіпотезу щодо механізмів біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі, які реалізуються не тільки на рівні процесів, що здійснюють метаболічну регуляцію їх функціонування, але й через NAD-ЗБ мембран нервових закінчень.
Список опублікованих праць здобувача за темою дисертації
1. Кучмеровская Т.М., член-корреспондент НАН Украины Донченко Г.В.,
Шиманский И.А., Клименко А.П. Влияние никотинамидадениндинуклеотида на ионные каналы нервных окончаний головного мозга крыс // Доповіді Національної академії наук України. - 2000. - № 3. - С. 188-192.
2. Кучмеровская Т.М. Влияние никотинамидадениндинуклеотида на захват норадреналина и высвобождение серотонина синаптосомами головного мозга крыс // Нейрохимия. - 1999. – Т.16, № 3. - С. 211 -214.
3. Кучмеровська Т.М. Діабетична нейропатія (огляд літератури та результати власних досліджень) // Ендокринологія. - 1999. – Т.4, № 2. - С. 159-167.
4. Кучмеровская Т.М., Столяров З.Е., член-кор. НАНУ Донченко Г.В., Шиманський И.А., Клименко А.П. Захват и высвобождение [2-14C]серотонина синаптосомами головного мозга крыс с экспериментальным диабетом: эффект ингибитора протеинкиназы С и экстракта из пищевого растения // Доповіді Національної академії наук України. - 1999. - № 5. - С. 173-177.
5. Чичковська Г.В., член-кор НАНУ Донченко Г.В., Пархоменко Ю.М., Кучмеровська Т.М. Метаболічні порушення у щурів під впливом морфіну //Доповіді Національної академії наук України. – 2000. –№ 1. - С. 169-172.
6. Кучмеровская Т.М. Роль серотонинергической медиаторной системы в реализации нейротропной функции витамина РР // Нейрохимия. - 1998. – Т.15, вып. 2. - С. 153-158.
7. Кучмеровська Т.М. Нейротропна дія нікотинаміду та нікотиноїл-γ-аміномасляної кислоти у головному мозку при експериментальному паркінсонізмі щурів // Укр. біохім. журн. - 1998. – Т.70, № 6. - С. 126-131.
8. Кучмеровская Т.М. Влияние никотинамидадениндинуклеотида на трансмембранный потенциал плазматической мембраны синаптосом коры головного мозга крыс // Доповіді Нац. акад. наук України. - 1998. - № 3. - С. 158-162.
9. Кучмеровская Т.М., Пархомец П.К., Донченко Г.В., Обросова И.Г., Клименко А.П., Пакирбаева Л.В., Ефимов А.С. Коррекция диабетических нейропатий с помощью ингибиторов альдозоредуктазы и пикамилона // Вопр. мед. химии. - 1998. – Т.44, вып. 6. - С. 559-564.
10. Кучмеровская Т.М. Влияние никотинамида и никотиноил-ГАМК на захват и высвобождение серотонина и ГАМК синаптосомами головного мозга диабетических крыс // Нейрохимия. - 1998. – Т.15, № 2. - С. 159-164.
11. Кучмеровская Т.М. Функциональные звенья нервной системы при экспериментальном диабете // Ендокринологія. - 1997. – Т.2, № 1. - С. 48-55.
12. Кучмеровская Т.М., Донченко Г.В., Клименко А.П., Чичковская Г.В., Пакирбаева Л.В., Козицкий З.Я., Ефимов А.С. Роль ингибиторов альдозоредуктазы в развитии периферических нейропатий при экспериментальном диабете // Укр. биохим. журн. - 1997. – Т.70, № 3, С. 77-82.
13. Obrosova I.G., Kuchmerovskaya T.M., Parkhomets P.K., Klimenko A.P., Yefimov A.S., Donchenko G.V. Effect of AL-01576 on brain neurotransmission in STZ-diabetic and galactose - fed rats // Elsevier Science B.V. Ed.: N. Hotta, D.A. Greene, I.D. Ward, A.A.F. Sima, A.I.M. Boulton, ed., 1995. - P. 249-256.
14. Донченко Г.В., Кучмеровская Т.М., Пархомец П.К., Обросова И.Г., Клименко А.П., Ефимов А.С. Влияние никотинамида на захват и высвобождение серотонина и ГАМК синаптосомами коры головного мозга крыс с диабетом, вызванным воздействием стрептозотоцина // Укр. биохим. журн. - 1995. – Т.67, № 1. - С. 105-111.
15. Пархомец П.К. , Кучмеровская Т.М., Донченко Г.В., Чичковская Г.В., Клименко А.П. Роль никотиновой кислоты и ее производных при нарушениях функции нервной системы // Укр. биохим. журн. - 1995. – Т.67, № 4. - С. 3-11.
16. Обросова И.Г., Кучмеровская Т.М., акад. НАНУ Ефимов А.С., Пархомец П.К., член-кор. НАНУ Донченко Г.В. Редокс состояние никотинамидадениндинуклеотидов и содержание сорбитола в мозге крыс со стрептозотоциновым диабетом: действие ингибитора альдозоредуктазы // Доповіді АН України. - 1994. - № 7. - С. 143-146.
17. Obrosova I.G., Kuchmerovskaya T.M., Parkhomets P.K., Klimenko A.P., Yefimov A.S. Serotonin and GABA uptake and release by brain cortex synaptosomes of streptozotocin-diabetic and galactosemic rats: effect of aldose reductase // Diabetologia Croatica. - 1994. – V.23. - P. 63-70.
18. Кучмеровская Т.М., Клименко А.П., Пархомец П.К., Донченко Г.В. Влияние NAD на захват и высвобождение некоторых медиаторов синаптическими везикулами головного мозга крыс // Укр. биохим. журн. - 1993. – Т.65, № 3. - С. 66-70.
19. Кучмеровская Т.М., Обросова И.Г., Пархомец П.К., акад. Ефимов А.С., Бабичева Е.И., Клименко А.П., Донченко Г.В. Захват и высвобождение серотонина синаптосомами головного мозга крыс со стрептозотоциновым диабетом // Доклады Академии Наук Украины. - 1993. - № 2. - С. 154-157.
20. Чичковская Г.В., Пархомец П.К., Кучмеровская Т.М., Халмурадов А.Г., Донченко Г.В., Рожанская О.П. Функционально-метаболические изменения в мозге при различной обеспеченности организма крыс витамином РР // Вопросы мед. xимии. - 1991. – Т.37, № 4. - С. 63-65.
21. Халмурадов А.Г., Кучмеровская Т.М., Пархомец П.К. Действие НАД на высвобождение дофамина и серотонина из синаптосом головного мозга крыс // Нейрохимия. - 1987. – Т.6, № 4. - С. 495-502.
22. Халмурадов А.Г., Кучмеровская Т.М, Клименко А.П., Арутюнян А.В., Мовсесян Н.О. Влияние аналогов НАД на его связывание синаптическими мембранами коры больших полушарий головного мозга крыс // Нейрохимия. - 1987. – Т.6, № 1. - C. 133-138.
23. Кучмеровская Т.М., Пархомец П.К., Чичковская Г.В., Халмурадов А.Г., Рожанская О.П. О природе участков синаптических мембран коры головного мозга, связывающих никотинамидадениндинуклеотид // Нейрохимия. - 1985. – Т.4. - № 4. С. 373-378.
24. Кучмеровская Т.М., Чичковская Г.В., Пархомец П.К., Халмурадов А.Г. Никотинамидные нуклеотиды как компоненты синаптосом головного мозга крыс // Доклады АН УССР. - 1984. - серия "Б". - № 3. - С. 71-74.
25. Халмурадов А.Г., Пархомец П.К., Кучмеровская Т.М., Чичковская Г.В. Особенности связывания никотинамидадениндинуклеотида синаптическими мембранами головного мозга крыс // Биохимия. - 1983. – Т.48, вып. 8. - С. 1287-1292.
26. Великий Н.Н., Кучмеровская Т.М., Пархомец П.К. Окислительно-восстановительное состояние свободных никотинамидных коферментов и синтез ФЭП в печени крыс и морских свинок // Укр. биохим. журн. - 1981. – Т.53, № 1. - С. 60-66.
27. Великий Н.Н., Пархомец П.К, Симонова Н.Я., Кучмеровская Т.М., Могилевич С.Е., Чичковская Г.В., Халмурадов А.Г. Гипогликемический эффект никотинамида при аллоксановом диабете у крыс // Проблемы эндокринологии. - 1978. – Т.24. - С. 83-87.
28. Donchenko G.V., Kuchmerovskaya T.M., Fomenko A.I., Klimenko A.P., Stepanenko C.P. The mechanisms of nicotinamide action // J. Neurochemistry. - 1998. – V.71, Suppl. 1. - S24, D.
29. Kuchmerovskaya T.M., Donchenko G.V., Obrosova I.G., Efimov A.S., Klimenko A.P. Effect of nicotinoil-GABA on brain metabolic state and neurotransmission in streptozotocin-induced diabetes // Diabetologia, 1997. - V. 40, Suppl.1, A 239, 939.
30. Kuchmerovskaya T.M., Donchenko G.V., Klimenko A.P., Yefimov A.S. Role of calcium in brain neurotransmission in streptozotocin-induced diabetes // Diabetologia.- 1996. - 39, Suppl. 1. - P. 50.
31. Kuchmerovskaya T.M., Parkhomets P.K., Klimenko A.P., Donchenko G.V. Effect of nicotinamide on brain neurotransmission at Parkinson's desease // “Patient education 2000”, International Congress on Treatment of Chronic Deseases. – Geneva (Swizerland).- 1994. - Р.263.
32. Klimenko A., Kuchmerovskaya T., Parkchomets P., Donchenko G. Solubilization and purification of NAD+-binding receptor protein // 4th IBRO World Congress of Neuroscience. – Kyoto (Japan).- 1995. – P.А4.55.
33. Kuchmerovskaya T.M., Donchenko G. V., Shimansky I. A Diabetes-induced impairment dependent of serotoninergic transmission is mediated by cyclic nucleoptide and/or protein kinase C-involved mechanisms // Neurodiab IX Diabetic Neuropathy Study Group of the EASD.- Maastricht (The Netherlands).- 1999. - P.41-42.
Кучмеровська Т.М. Біологічна дія вітаміну РР та його похідних у нервовій системі. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04-біохімія, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, Київ, 1999.
Дисертацію присвячено дослідженню механізмів біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі. Виявлено факт існування специфічного зв'язування NAD “мембранною системою”, яка представлена NAD-зв'язуючим білком. Показано, що в ЦНС вітамін РР та NAD здійснюють модулюючу дію на процеси вивільнення та зворотнього поглинання серотоніну, дофаміну та ГАМК на моделях патологій нервової системи (РР-гіповітаміноз, хвороба Паркінсона, діабетична нейропатія). Встановлено наявність нікотинамідних динуклеотидів у синаптичних пухирцях та синаптосомах, а також системи синтезу та розпаду NAD у нервових закінченнях “пуринергічних відділів” головного мозку. Доведено важливу роль синаптичних пухирців нервових закінчень у прояві пресинаптичної модуляторної дії NAD. Знайдено, що NAD концентраційно-залежно впливає на трансмембранний потенціал плазматичної мембрани нервових закінчень. Коригуюча дія вітаміну РР та його похідних, імовірно, здійснюється через NAD-зв'язуючий білок та через їх участь в окисно-відновних та інших метаболічних процесах. Запропоновано гіпотезу щодо механізмів реалізації біологічної дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі.
Ключові слова: нікотинамід, NAD, NAD-зв'язуючий білок, синаптосоми, зв’язування, вивільнення, поглинання, серотонін, дофамін, ГАМК, РР-гіповітаміноз, хвороба Паркінсона, діабетична нейропатія.
Кучмеровская Т.М. Биологическое действие витамина РР и его производных в нервной системе. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04-биохимия, Институт биохимии им.А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 1999.
Диссертация посвящена изучению механизмов биологического действия витамина РР и его производных в нервной системе. Обнаружен факт существования, а также изучена роль мембранной системы специфического связывания NAD. Установлено наличие никотинамидных динуклеотидов, а также системы синтеза и распада NAD в синаптических везикулах и синаптосомах “пуринергических отделов” головного мозга крыс. Показано, что NAD-связывающие участки синаптических мембран являются гликолипопротеидными комплексами, в рецепторном центре которых содержатся SH-группы. Подобраны оптимальные условия для солюбилизации NAD-связывающего белка без потери его естественных свойств (0,5 % луброл РХ). Разработаны методические подходы для выделения и очистки NAD-связывающего белка и электрофоретически в присутствии додецилсульфата натрия определена молекулярная масса, которая составила около 120 кД. Обоснована роль NAD-связывающего белка, который является функциональной составной частью мембран нервных окончаний в процессах передачи нервного импульса. Установлено, что пресинаптическая мембрана нервных окончаний является одним из возможных мест модулирующего действия NAD на процессы высвобождения и обратного захвата медиаторов. Показано, что в ЦНС витамин РР и NAD осуществляют модулирующее действие на процессы высвобождения и обратного захвата серотонина, дофамина и ГАМК на моделях патологий нервной системы (РР-гиповитаминоз, болезнь Паркинсона, диабетическая нейропатия). Обнаружено, что уровень никотинамидных динуклеотидов в мозге, рецепция NAD синаптическими мембранами, а также функционирование серотонин-, дофамин- и ГАМК-ергической медиаторных систем нарушены при всех исследуемых патологических состояниях. Выявлено, что NAD концентрационно-зависимо влияет на трансмембранный потенциал плазматической мембраны нервных окончаний. Показана важная роль NAD-гликогидролазы в патогенезе болезни Паркинсона. Коррегирующее действие витамина РР и его производных в нервной системе, возможно, осуществляется через NAD-связывающий белок, а также путем участия их в окислительно-восстановительных и других метаболических процессах, таких как полиоловый путь обмена глюкозы, Na+,K+-насос.
Предложено гипотезу механизмов реализации биологического действия витамина РР и его производных в нервной системе.
Ключевые слова: никотинамид, NAD, NAD-связывающий белок, синаптосомы, связывание, высвобождение, захват, серотонин, дофамин, ГАМК, РР-гиповитаминоз, болезнь Паркинсона, диабетическая нейропатия.
Kuchmerovskaya T.M. Biological асtion of vitamin PP and its derivatives in nervous system. – Manuscript.
Thesis for doctor's degree by speciality 03.00.04 – biochemistry. A.V.Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 1999.
The dissertation is devoted to investigate the mechanisms of biological action of vitamine PP and its derivatives in nervous system. It was established the leading role of synaptic membrane NAD-binding protein in modulating the processes of serotonin, dopamine and GABA release and uptake in normal brain functioning and under several nervous diseases investigated (PP-hypovitaminosis; Parkinson’s disease; diabetic neuropathy). Nicotinamide adenine dinucleotides and systems of their synthesis and cleavage were shown to be present in synaptic vesicules and synaptosomes of rat brain “purinergic areas”. Involvement of synaptic vesicules of nerve endings in realization of NAD presynaptic modulating effects was determined. Examination of NAD action on plasma membrane potential of rat brain synaptosomes showed its concentration-dependent inhibition influence. We concluded that vitamine PP and NAD protection against brain dysfunctions was probably mediated through NAD-binding protein, free cytosolic NAD(P)/NAD(P)H ratios and other inner metabolic events. It was proposed a hypothesis to explain how the biological action’s mechanisms of vitamine PP and its derivatives is realized in nervous system.
Key words: nicotinamide, NAD, NAD-binding protein, synaptosomes, binding, release, uptake, serotonin, dopamine, GABA, PP-hypovitaminosis, Parkinson’s disease, diabetic neuropathy.
| 
