Регресійний аналіз ЧАА за віком насіння показав, що й швидкість наростання хромосомної мінливості в клітинах промитого насіння також менша, ніж у непромитого насіння (табл. 7).
Таблиця 7
Динаміка частоти аберантних анафаз у Allium fistulosum L.
при старінні насіння 1994 р.
Примітки:
bЧАА – середня швидкість змін частоти аберантних анафаз %/міс;
R2 – коефіцієнт детермінації (показник внеску віку насіння як фактору в утворення хромосомних аберацій).
Чутливість клітин кореневої меристеми батуна до формальдегіду. Для визначення оптимально мутагенної концентрації формальдегіду (ФА) насіння 1990 р. (віком 18 – 19 міс.) пророщували у 0,04 %; 0,004 %; 0,0004 %; 0,00002 %; 0,00004 %; 0,00008 % розчинах, які готували з вихідного 40 % розчину ФА. Максимальну мутагену активність формальдегід виявив у концентрації 0,00004 %. ЧАА складала 26,99 ± 1,57 % при контролі 12,46 ± 1,36 % та 27,96 ± 1,45 % при контролі 22,72 ± 1,15 %; ПАК – 146 % при контролі 110 % та 132 % при контролі 115 %. Пошкодженість клітин була настільки значна, що ХА спостерігались не лише в анафазних, але і в метафазних клітинах. Часто спостерігались множинні аберації, неможливо було визначити тип та категорію аберацій (рис. 9).
Рис. 9. Хромосомні аберації в клітинах кореневої меристеми Allium fistulosum L. при пророщуванні насіння у формальдегіді (0,00004%): а – анафаза з двома фрагментами; б – анафаза з абераціями невизначеного типу й категорій.
Оскільки у насінні, промитому KMnO4, утворення ХА протягом наступного року відбувалось в межах 10-13%, виникло питання, як це позначиться на мутагенному ефекті формальдегіду, встановленому нами раніше? На рисунку 10 показано, що мутагенний вплив ФА на вихід ХА у варіанті з промитим насіння значно вираженіший (р < 0,01), ніж у варіанті з непромитим насінням, де ЧАА зросла статистично не значимо. На цей час насіння мало 27-28 міс.
Рис. 10. Вплив формальдегіду на утворення хромосомних аберацій в клітинах батуна непромитого (1) та промитого перманганатом калію (2,3,4) насіння. А – дистилят; В – формальдегід.
В клітинах насіння 1994 р. протягом 1–го року зберігання формальдегід не підвищував ЧАА. Статистично значимий мутагенний ефект ФА виявлено на 3-му році зберігання насіння (табл. 8).
Таблиця 8
Вплив формальдегіду (0,00004 %) на утворення хромосомних аберацій
у Allium fistulosum L. при старінні насіння урожаю 1994 року
Примітка:  = 3,84;  = 6,63
Таблиця 9
Вплив формальдегіду (0,00004 %) на утворення хромосомних аберацій
у Allium fistulosum L. при старінні насіння урожаю 1995 року
Примітка:  = 3,84;  = 6,63
Чутливість клітин до мутагенного впливу формальдегіду (0,00004 %) у насінні одного віку (19 міс.), але різних партій (1995-А, 1995-В, 1995-с), виявилась залежною від вікової динаміки мутабільності (табл. 9). Так, статистично значимий мутагенний ефект формальдегіду виявлено у варіанті з високою швидкістю вікових змін ЧАА – насіння партії 1995- В (рис. 3).
Чутливість клітин Allium fistulosum L. до впливу біологічно активних речовин. Цитогенетичний вплив БАР на клітини батуна вивчали на насінні 1990 року, промитому розчином KMnO4. На цей час насіння вже мало вік 30 – 32міс. В той час як по відношенню до мутагенного впливу формальдегіду рибофлавін виявив значну генопротекторну активність, на фоні спонтанного мутагенезу його вплив виявився мутагенним (табл. 10, 11).
Таблиця 10
Вплив рибофлавіну на спонтанне утворення хромосомних
аберацій у Allium fistulosum L.
Примітка:  = 3,84;  = 6,63
Таблиця 11
Вплив рибофлавіну на рівень індукованих формальдегідом (0,00004 %)
хромосомних аберацій у Allium fistulosum L.
Примітки:
Ср/Сф – відношення молярних концентрацій рибофлавіну й формальдегіду (число молекул рибофлавіну, що припадає на одну молекулу формальдегіду в розчині);
 = 3,84;  = 6,63
Дані щодо впливу тимогену на спонтанне утворення ХА в клітинах кореневої меристеми наведено в таблиці 12. Як видно, за виключенням 2-х варіантів, всі досліджувані концентрації тимогену виявились мутагенними. При цьому, в діапазоні досліджуваних концентрацій зв'язок між концентрацією тимогену та ефектом тимогену не спостерігається.
Щодо індукованого формальдегідом утворення ХА тимоген виявився генопротектором, знижуючи ЧАА до спонтанних значень. У варіантах з концентрацією тимогену 0,001 та 1000 мкг/мл рівень ХА виявився нижчим від спонтанного (табл. 13).
Чутливість клітин молодого насіння Allium fistulosum L. до впливу рибофлавіну й тимогену досліджували на насінні партії 1995-В (табл. 14). Вік насіння становив 4 місяці. Використовували концентрації рибофлавіну й тимогену, які були ефективні на старому насінні.
Таблиця 12
Вплив тимогену на спонтанне утворення хромосомних аберацій
у Allium fistulosum L.
Примітка:  = 3,84;  = 6,63
Таблиця 13
Вплив тимогену на утворення індукованих формальдегідом
хромосомних аберацій у Allium fistulosum L.
Примітка:  = 3,84;  = 6,63
Таблиця 14
Чутливість клітин кореневої меристеми молодого насіння Allium fistulosum L.
(4 міс.) до впливу біологічно активних речовин
Примітка:  = 3,84;  = 6,63
Як видно з даних таблиці 14, рибофлавін та тимоген не індукують утворення хромосомних аберацій в клітинах молодого насіння.
Обговорення. У насінні при зберіганні утворюються метаболіти з мутагенною активністю – аутомутагени, здатні пошкоджувати хромосомний матеріал (Дубинин, Щербаков, 1964). Отже, мутаційний процес прискорюється як за рахунок накопичення аутомутагенів, які індукують мутування при проростанні насіння, так і за рахунок накопичення потенційних змін при зберіганні насіння. Неоднакова ймовірність реалізації потенційних змін в мутації створює картину хвильової кінетики мутаційного процесу (Дубинин, 1978). Серед факторів, які впливають на рівень спонтанного мутування клітин у насінні, - кліматично-погодні умови, за яких воно формується й достигає (Лазаренко, Безруков, 1998); умови зберігання, вік та умови пророщування насіння (Орлова, 1972; Лазаренко и др., 1995, 1996, 1997). Чим більш мутабільним є об'єкт, тим більш ймовірна нерівномірність наростання хромосомної нестабільності при старінні та при дії сторонніх факторів, сумарна дія яких звичайно не є стабільною. Очевидно, саме цим пояснюється той факт, що при меншій швидкості наростання показника ЧАА амплітуда коливань також менша, як це показано на трьох різних партіях насіння одного року врожаю. Значення коефіцієнту регресії ЧАА за віком насіння ( bЧАА), що відповідає середній швидкості наростання ЧАА (%/міс) в міру старіння насіння, можна розглядати як цитогенетичну характеристику вікової динаміки мутабільності. Хоча в літературі мутабільність з такої точки зору не розглядалась, наші дані показують зв'язок між швидкістю вікової динаміки спонтанної мутабільності та чутливістю клітин до пошкоджуючих впливів. Так, при високому значенні b ( b1995-В= 0,84) клітини молодого насіння вже чутливі до мутагенного впливу формальдегіду. В той час як при середньому та низькому значенні b ( b1995-А= 0,46; b1995-С= 0,22; b1994(3) = 0,46) в клітинах насіння такого ж віку мутагенний ефект формальдегіду не спостерігався.
Для A.fistulosum L. локалізація аутомутагенів з певністю не була встановлена (Дубинин, Щербаокв, 1964; Орлова, 1972). Той факт, що у насінні 1990 р., промитому на 27-ому місяці зберігання, антимутагенний ефект перманганату калію виявився негайно, свідчить про те, що аутомутагени вже були присутні у насіннєвій шкірці. У насінні 1994 р. ефект промивки 1,5-місячного та 9-місячного насіння виявився лише на 18-ому місяці зберігання. Отже, до певного віку насіння аутомутагени на поверхні насіннєвої шкірки відсутні. Відсутність подальшого (після 18 місяців) наростання мутагенезу у промитому насінні, на відміну від такого у непромитому, вказує на видалення з насіннєвої шкірки речовин, які на час промивки та протягом певного часу не мали мутагенної активності. Тому це, скоріше, ще не аутомутагени, а "проаутомутагени", які лише згодом, через метаболічні перетворення, набувають мутагенної активності. Очевидно перманганат калію, як сильний окисник, видаляє частину речовин-проаутомутагенів (окислюючи їх до речовин, розчинних у воді), внаслідок чого концентрація утворюваних при старінні насіння аутомутагенів весь час (у всякому разі, протягом досліджуваного періоду) залишається нижчою від такої в непромитому насінні.
Генопротекторний вплив рибофлавіну й тимогену може частково зумовлюватись дезмутагенним ефектом. Однак мутагенний вплив цих речовин на фоні спонтанного мутагенезу свідчить про наявність інших, внутрішніх механізмів. Формальдегід, як і рибофлавін та тимоген, очевидно, не являються прямими мутагенами в клітинах A. fistulosum L., а діють через продукти взаємодії з метаболітами. Труднощі щодо оцінки механізмів дії будь-якого фактора полягають у складності та різноманітності умов його дії, неможливості передбачити всі елементи комплексу, у складі якого діє досліджуваний фактор, та фізіологічність його концентрацій ( Ауэрбах, 1978; Алекперов, 1984; Порошенко, 1995). Відсутність мутагенного впливу формальдегіду та біологічно активних речовин на клітини молодого насіння можна пояснити тим що метаболіти, з якими вони реагують в клітинах молодого насіння, хімічно відрізняються від метаболітів старого насіння. Крім того, процеси репарації в молодому насінні також відбуваються на більш високому рівні, про що свідчить наявність негативної кореляції між віком насіння та утворенням мостів.
ВИСНОВКИ
- В генетично однорідному насінні A. fistulosum L. різних партій вікова динаміка спонтанної мутабільності відбувається з різною швидкістю та має характер нерівномірно наростаючих коливань.
- У насіннєвій шкірці молодого насіння A. fistulosum L. містяться речовини, видалення яких приводить до гальмування розвитку мутаційного процесу при старінні насіння на 10-19%, і які протягом першого року старіння насіння не відіграють особливої ролі у віковому прискоренні мутаційного процесу, а залучаються до нього пізніше.
- Чутливість клітин кореневої меристеми батуна до впливу біологічно активних речовин (рибофлавіну й тимогену) залежить від умов їх дії, а саме: від їх концентрації, віку насіння та наявності мутагенного впливу формальдегіду.
ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
- Лазаренко Л.М., Безруков В.Ф., Храпунов С.Н. Лук батун (Allium fistulosum L.) как тест-система для оценки антимутагенности // Цитология и генетика. - 1995. – Т.29, №4. – С. 66-70.
- Лазаренко Л.М., Безруков В.Ф., Храпунов С.М. Вплив формальдегіду на рівень хромосомних аберацій у цибулі батун (Allium fistulosum L.) // Вісник Київського університету. - 1996. - Випуск 26. - С. 96-101.
- Лазаренко Л.М., Безруков В.Ф., Храпунов С.Н. Влияние рибофлавина на уровень хромосомных аберраций у лука батуна (Allium fistulosum L.) // Цитология и генетика. - 1997. – Т.31, №1. – С. 3-6.
- Лазаренко Л.М., Демідов С.В. Вплив тимогену на утворення хромосомних аберацій у цибулі батун (Allium fistulosum L.) // Вісник Київського університету. – 1998. – Випуск 27. – С. 42 – 45.
- Лазаренко Л.М., Безруков В.Ф. Аналіз хромосомної нестабільності в клітинах кореневої меристеми Allium fistulosum L // В кн.: "Наукові читання, присвячені 100-річчю відкриття подвійного запліднення у покритонасінних рослин професором університету Святого Володимира С.Г. Навашиним". – Київ, 1998. – С. 29 – 33.
- Лазаренко Л.М., Безруков В.Ф., Храпунов С.М. Зміни рівня хромосомних аберацій у цибулі батуна, пов'язані зі старінням насіння // Міжнародний симпозіум "Біологічні механізми старіння". – Харків. – 1996. – С. 88.
- Лазаренко Л.М., Безруков В.Ф Вікові особливості мутагенезу в клітинах кореневої меристеми Allium fistulosum L .// ІІІ Международный симпозиум "Биологические механизмы старения". – Харьков. – 1998. – С. 79.
Лазаренко Л.М. Цитогенетична оцінка мутабільності Allium fistulosum L. (Liliacea, Magnoliophyta) при старінні насіння. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія. Київський університет імені Тараса Шевченка, Київ, 1999.
Дисертацію присвячено цитогенетичним особливостям вікової динаміки мутабільності кореневої меристеми Allium fistulosum L . Досліджено зміни цитогенетичних показників при старінні насіння різних партій та під впливом формальдегіду, рибофлавіну й тимогену. Показано. що швидкість вікової динаміки мутабільності клітин, яка дорівнює коефіцієнту регресії частоти аберантних анафаз за віком, у насінні різних партій – різна і визначає чутливість клітин до пошкоджуючого впливу формальдегіду та високих концентрацій біологічно активних речовин. При високій швидкості вікові зміни частоти аберантних анафаз у A. fistulosum L. мають характер нерівномірно наростаючих коливань. Досліджено динаміку частоти аберантних анафаз при старінні насіння A. fistulosum L. , обробленого перманганатом калію. Встановлено наявність у насіннєвій шкірці речовин, які до певного часу не являються аутомутагенами, а набувають мутагенної активності згодом, при старінні насіння. Встановлені особливості слід враховувати при використанні A. fistulosum L. як тест-об'єкту.
Ключові слова: мутабільність, вікова динаміка, клітини кореневої меристеми, Allium fistulosum L., аберації хромосом , формальдегід, рибофлавін, тимоген.
Лазаренко Л.М. Цитогенетическая оценка мутабильности Allium fistulosum L. (Liliacea, Magnoliophyta) при старении семян. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.09 – гистология, цитология, эмбриология. Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1999.
Диссертация посвящена цитогенетическим особенностям возрастной динамики мутабильности клеток корневой меристемы Allium fistulosum L. Исследованы изменения цитогенетических показателей мутабильности при старении семян в течение длительного времени и под влиянием формальдегида, рибофлавина и тимогена.
Проведен сравнительный анализ возрастной динамики спонтанной мутабильности в генетически однородных семенах разных партий: полученных в одних и тех же географических условиях в разные годы (1994 и 1995) и в семенах, полученных в одном году (1995) в разных географических условиях. Установлено, что скорость мутационного процесса в клетках генетически однородных семян разных партий – различна. Возрастная динамика мутабильности имеет характер неравномерно нарастающих колебаний, что особенно заметно при высокой скорости нарастания частоты аберрантных анафаз. Средняя скорость мутационного процесса по частоте аберрантных анафаз равна коэффициенту регрессии b ЧАА по возрасту семян. Предложена классификация скорости нарастания мутабильности клеток по частоте аберрантных анафаз, согласно которой низкая скорость – при b = 0 – 0,3; средняя при b = 0,3 – 0,7; высокая скорость – при b = 0,7 –1,0 и выше (по абсолютной величине).
Проведен сравнительный анализ возрастной динамики мутабильности клеток по частоте аберрантных анафаз в семенах, обработанных и необработанных перманганатом калия (0,05%). В семенах 1990 г., обработанных на 27-м месяце хранения, антимутагенный эффект обнаружен немедленно, что может свидетельствовать о наличии в семенной кожуре на момент промывки веществ с мутагенной активностью (аутомутагенов). В семенах другой партии (1994 г.), обработанных в 1.5 и на 9-ом месяце хранения, антимутагенный эффект обнаружился на 18-том месяце хранения семян. Похоже, до определенного возраста семян аутомутагены на поверхности семенной кожуры отсутствуют, поскольку частота аберрантных анафаз промытых перманганатом калия семенах не отличается от таковой в непромытых на протяжении некоторого времени. Или же удаленные вещества на время промывки, а также в течение некоторого времени не имели мутагенной активности, следовательно, не были еще аутомутагенами. И лишь со временем, по мере метаболических преобразований, эти вещества – "проаутомутагены", приобретают мутагенную активность, превращаясь в аутомутагены.
Установлено, что скорость возрастных изменений спонтанной мутабильности определяет чувствительность клеток корневой меристемы Allium fistulosum L. к повреждающим воздействиям. Так, при высоких значениях коэффициента регрессии b (b1990= 0,72; b1994=0,63; b1995-B=0,84) клетки даже молодых семян чувствительны к мутагенному влиянию формальдегида (0,00004 %). В то время как при низкой и средней скорости нарастания частоты аберратных анафаз (b1995-А= 0,46; b1995-С=0,22 та b1994(3)=0,25) мутагенный эффект формальдегида не наблюдался.
Изучение влияния биологически активных веществ на образование хромосомных аберраций показало, что чувствительность клеток корневой меристемы A. fistulosum L. к воздействию рибофлавина и тимогена зависит от условий их действия, а именно: от концентрации упомянутых веществ, от возраста семян, а также от наличия мутагенного влияния формальдегида. Так, на фоне спонтанного мутагенеза высокие концентрации рибофлавина и тимогена оказывали мутагенный эффект, статистически достоверно индуцируя образование хромосомных аберраций в меристемных клетках немолодых семян. Клетки молодых семян A. fistulosum L. оказались нечувствительными к концентрациям рибофлавина и тимогена, эффективным по отношению к клеткам старых семян. При наличии мутагенного влияния формальдегида (0,00004 %) изученные биологически активные вещества оказали генопротекторное воздействие на клетки корневой меристемы немолодых семян.
Установленные особенности возрастной динамики цитогенетических показателей мутабильности клеток корневой меристемы A. fistulosum L. необходимо учитывать при использовании батуна в качестве тест-объекта.
Ключевые слова: мутабильность, возрастная динамика, клетки корневой меристемы, Allium fistulosum L., аберрации хромосом, формальдегид, рибофлавин, тимоген.
Lazarenko L.M. Cytogenetical evaluation of mutability of Allium fistulosum L. (Liliacea, Magnoliophyta) during aging of seeds. - Manuscript.
Thesis for a candidate’s degree in biology by speciality 14.03.09 - histology, cytology, embryology. - Taras Shevchenko Kyiv University, Kyiv, 1999.
The object of our study was the age-related dinamics of spontaneous mutability of meristemal cells in seeds of welsh onion (Allium fistulosum L.). We studied dependence of spontaneous level of chromosomal aberrations in cells of welsh onion on conditions and term of keeping of seeds. Spontaneous and formaldehyde induced level of mutagenesis, influence of riboflavin and timogen on spontaneous and formaldehyde induced frequency of aberration’s anaphases in meristemal cells was studied.
Our research have shown different age-related dynamics of mutability of cells in seeds of different origine. Age-related dinamics of spontaneous mutability of cells of A. fistulosum L. increases with. A sensitiveness of cells to the damaging influences is dependent on the speed of age-related dinamics of spontaneous mutability.
Key words: mutability, age-related dynamics, meristemal cells, Allium fistulosum L., chromosomal aberrations, formaldehyde, riboflavin, timogen.
|
