Рівні вільної активності катепсину L мають максимальні значення на 6 добу постнатального розвитку у корі великих півкуль головного мозку, Варолієвім мості, середньому мозку і мозочку. На 12 добу в мозочку дослідних щурів зареєстровано найбільше підвищення (240%) вільної активності катепсину L в порівнянні з контролем. В інших структурах головного мозку активність катепсину L також була підвищеною до 18 доби життя. На 18 та 25 доби постнатального розвитку встановлено зниження вільної активності катепсину L до контрольного рівня. Опромінення батьків викликає зміни не тільки активності катепсину L, але й впливає на перерозподіл її в структурах головного мозку. У корі великих півкуль головного мозку, середньому мозку і Варолієвім мості неседиментована активність катепсину L в усі зазначені терміни постнатального розвитку зберігається підвищеною в порівнянні з контролем, за винятком 25 доби для Варолієвого мосту, коли неседиментована активність набуває контрольного рівня.
Встановлено, що залучення лізосом у відповідну реакцію організму нащадків на опромінення батьків має універсальний характер, широкий спектр специфічних і неспецифічних реакцій, які супроводжуються активацією катепсинів. Але цей процес у функціонально і морфологічно різних структурах головного мозку має свої особливості, які пов’язані з участю лізосом в адаптивно-відновних процесах клітин, тканин і організму в цілому, в порівнянні з інтактними тваринами. Аналізуючи динаміку мембранозв’язаної активності катепсину L головного мозку нащадків опромінених батьків, треба враховувати її абсолютні значення, які зазнають змін в залежності від структури мозку. Найбільші рівні мембранозв’язаної активності спостерігаються також на 6-ту добу постнатального розвитку в усіх структурах мозку дослідних щурят. На 12 добу життя підвищення активності визначили у Варолієвім мості, середньому мозку і корі великих півкуль в 2,5; 1,5 та 1,2 рази відповідно. На 18 та 25 добу мембранозв’язана активність катепсину L поступово знижується в усіх структурах, але контрольного рівня набуває лише у середньому мозку на 25 добу життя, а в інших структурах залишається підвищеною.
Таким чином, фракціоноване опромінення батьків спричиняє у нащадків неоднакову за ступенем вираженості активацію лізосом в залежності від того, хто з батьків був опромінений, і специфічно розгорнуту у часі в залежності від структури головного мозку. Визначені ефекти можуть бути зумовленими змінами реактивності ЦНС (Nakamura Y. et al., 1999). Функції лізосом знаходяться під гормональним контролем, і в залежності від гормональних змін в організмі відповідь лізосом може змінюватись в широкому діапазоні, починаючи з потайної лабіалізації мембран і закінчуючи пошкодженням (Горпиненко Н. и др., 1992; Пилинская М. и др., 1999). Генетичні ефекти малих доз радіації зумовлені не стільки пошкоджуючою дією випромінювань, скільки особливостями реалізації відповіді клітини на зовнішню дію, зокрема, зниженням активності систем репарації.
Вплив гемічної гіпоксії на активність катепсинів В, L, Н у структурах головного мозку щурів. Одним з наслідків радіаційного впливу на організм є розвиток гіпоксичного стану головного мозку. Відомо, що з усіх тканин організму нервова система найбільш чутлива до кисневої недостатності (Tsuch Y. et al., 1999; Hill I. et al., 1997). Поряд з модифікацією гемодинамічних показників, радіація сприяє розвитку гемічного гіпоксичного стану, зумовленого окисленням гемоглобіну (Hb) до метгемоглобіну (MetHb) (Маньковская И. и др., 1997). Особливо небезпечне гіпоксичне ушкодження для незрілого мозку. Киснева недостатність на ранніх стадіях розвитку порушує формування, диференціювання і дозрівання різних структур і метаболічних шляхів в нервовій тканині. Метою наступного експерименту було з’ясування внеску гемічної гіпоксії у розвиток ефекту як одноразового, так і фракціонованого опромінення у дозі 25 сГр. Гемічну гіпоксію моделювали нітритною метгемоглобінемією. Ступінь тяжкості метгемоглобінемії визначали за концентрацією метгемоглобіну (MetHb).
Встановлено, що одноразове радіаційне опромінення в порівнянні з фракціонованим спричиняє більший ефект (рис 7).
Рис.7. Вміст метгемоглобіну у крові щурів після тотального опромінення у дозі 25сГр (М±m, n=6)
Експериментально спричинений гіпоксичний стан під дією нітриту натрію викликає у дорослих самок гемічну гіпоксію середньої тяжкості за вмістом MetHb у крові до 28%. У нащадків першого покоління, які перенесли пренатальну гемічну гіпоксію, в динаміці раннього онтогенетичного розвитку (1, 6, 12 діб) встановлено легку гемічну гіпоксію.
При хронічній гемічній гіпоксії в результаті дії загальних патофізіологічних, патохімічних і специфічних механізмів відбуваються суттєві зміни активності і компартменталізації лізосомальних катепсинів В, L, Н у зв’язку з неоднаковою лабілізацією мембран в функціонально і морфологічно різних структурах головного мозку дорослих щурів, що, можливо, пов’язано з особливостями їх морфо-функціональної спеціалізації. Встановлено підвищення вільної і неседиментованої активності катепсинів В, L, Н і вибіркове підвищення мембранозв’язаної активності (рис. 8А). Слід зазначити, що неседиментована активність катепсину В при гемічній гіпоксії значно менша, ніж при одноразовому і фракціонованому опроміненні, але тенденція спрямованості змін має спільний характер. Аналізуючи дані стосовно вмісту нейроспецифічних білків NCAM і ГФКБ у структурах головного мозку дорослих щурів під впливом гемічної гіпоксії середньої тяжкості, варто відмітити, що найбільш виражені зміни концентрації NCAM спостерігали у смугастому тілі, корі великих півкуль і середньому мозку. Підвищення вмісту ГФКБ в усіх досліджуваних структурах мозку свідчить про підсилення астрогліальної реактивності – особливості мозку, що проявляється за різних патологій ЦНС (Дука Т. и др., 2000).
Рис. 8. Неседиментована активність катепсину В у головному мозку самок щурів (А) і нащадків (Б) в різні терміни дії гемічної гіпоксії (в % від контролю).
* - р<0,05 – порівняно з контролем.
Згідно з метою роботи на наступному етапі ми досліджували зміни активності катепсинів В, L, Н в ЦНС нащадків щурів в динаміці онтогенетичного розвитку, які перенесли пренатальнo гемічну гіпоксію середньої тяжкості. Показано, що на ранніх етапах індивідуального розвитку відбуваються зміни у системі протеолізу, які виражаються у диференційованому підвищенні рівнів вільної і неседиментованої активності катепсину В у залежності від структури головного мозку і терміну постнатального розвитку. В корі великих півкуль гіпоксичного потомства відмічені коливання рівнів активності катепсину В: після підвищення активності на 63% та 66% на 1 та 6 доби постнатального періоду відповідно, відбувається зниження активності відносно контролю на 40% на 12 добу. Середній мозок потомства виявився більш чутливим до гіпоксичного впливу у порівнянні з дорослими тваринами. У Варолієвім мості відзначається збільшення вільної активності катепсину В як на 6, так і на 12 доби з максимальним значенням на 12 добу, яка складає 123% від контролю. На 1, 6 та 12 доби постнатального розвитку у корі великих півкуль дослідних нащадків неседиментована активність катепсину В підвищилась на 147%, 94% і 110% в порівнянні з контрольними даними відповідно (рис. 8Б). Аналогічні зміни даної форми активності катепсину В відмічались і в корі великих півкуль гіпоксичних самок з тією різницею, що у нащадків відсоток підвищення був більший. У Варолієвім мості, як і у мозочку нащадків гіпоксичних тварин вірогідне підвищення неседиментованої активності виявлено на 6 та 12 доби постнатального розвитку. У середньому мозку на 6 добу відзначалося підвищення активності ферменту на 92% відносно контролю, а на 12 добу даний показник знижується до контрольного рівня. Зміни мембранозв’язаної форми активності катепсину В під впливом пренатального гіпоксичного стану були виявлені в усіх досліджуваних структурах головного мозку нащадків в процесі раннього постнатального розвитку. У структурах головного мозку нащадків при адаптації до гемічної гіпоксії на передній план висувається підвищення вільної і неседиментованої активності лізосомальних катепсинів В, L, Н, а також за цих умов утворюються первинні лізосоми, що свідчить про підвищєння функціональної активності лізосом за рахунок вибіркової активації цистеїнових катепсинів з більш вираженим ефектом для нащадків в порівнянні з гіпоксичними самками.
Вплив малих доз радіації і гіпоксії на активність катепсинів у сироватці крові. Характерною рисою сироваткових протеіназ, яка відрізняє їх від тканинних є те, що вони просторово нероз’єднані і можуть взаємодіяти між собою. В нормі тканинні цистеїнові катепсини, як і нейроспецифічні білки ГФКБ, NCAM (Дука Т. и др., 2001), у сироватці крові визначаються в слідовій кількості, тому значне підвищення їхнього рівня у крові може свідчити про розвиток патологічного процесу (Кирпиченок Л. и др., 1997). Встановлення закономірностей та умов, за яких можлива елімінація цистеїнових катепсинів у кров, може бути корисною для розробки діагностики і прогнозування перебігу тканинних патологій, у тому числі й зумовлених дією радіації і гіпоксії. Дослідження впливу одноразового та фракціонованого тотального опромінення щурів на активність цистеїнових катепсинів В, L, Н у сироватці крові дозволяє оцінити радіобіологічний ефект опромінення і розбалансування системи протеолізу.
При фракціонованому опроміненні виявлені зміни активності катепсинів В, L, Н відрізнялися від одноразового опромінення як за рівнем активності, так і за характером динаміки (рис. 9).
Рис. 9. Активність катепсину В у сироватці крові щурів після одноразового (А) та фракціонованого (Б) опромінення за дози 25 сГр (в мкмоль р-НА/мг білка, М±m, n=6).* - р<0,05 – порівняно з контролем
Визначення активності катепсинів В, L, Н у сироватці крові опромінених щурів є інформативним методом оцінки пошкоджуючої дії радіації (зміни активності катепсинів В і L більш виражені в ранній післярадіаційний період, а активність катепсину Н набуває характерного підвищення на 5-ту і 7-му доби після опромінення) і дозволяє прогнозувати ранні функціональні пошкодження, а також ризик появи віддалених наслідків. У крові ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС під впливом малих доз іонізуючої радіації встановлені відповідні і довготривалі підвищення активності досліджуваних цистеїнових катепсинів.
Результати клініко-біохімічних обстежень осіб, що були опромінені внаслідок аварії на ЧАЕС, свідчать про поглиблення дисбалансу в системі ПОЛ-АОС у сироватці крові, а тривала інтенсифікація ПОЛ може бути суттєвим механізмом хронізації запальних процесів (табл. 1).
Таблиця 1
Параметри пероксидації та антиоксидантної активності в сироватці крові ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС, M ± m.
Підвищення рівнів МДА у сироватці крові обстежених на 68%, 100%, свідчать про інтенсифікацію вільнорадикальних процесів після опромінення на фоні зниження загальної антиоксидантної активності (ЗАОА) в порівнянні з контролем в 2,0 і 2,2 рази відповідно у ліквідаторів І та ІІ груп. При визначенні перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) встановлено зниження стійкості еритроцитарних оболонок на 15% і 17% відповідно до дії перекису водню, яке корелює зі ступенем накопичення токсичних гідроперекисей при різних дозах опромінення. Протеїназно-інгібіторний комплекс крові забезпечує захист тканин організму від розвитку деструктивних процесів при порушенні гомеостазу. Активність катепсину В достовірно підвищилась в 1,2 рази в сироватці крові обстежених (рис. 10). Збільшення активності катепсину L складало 48% в порівнянні з донорами.
Рис. 10. Активність катепсинів В і L (в % від контролю) в сироватці крові: 1- донорів (n=20); ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС: 2 - І групи (n=44); 3 – ІІ групи (n=39) (М±m).
* - р < 0,05 порівняно з контролем
Залежність між інтенсивністю ПОЛ та ступенем дисбалансу протеїназно-інгібіторної системи крові свідчить про компенсаторно-пристосовну реакцію молекулярно-клітинних систем організму у відповідь на дію радіації. Але, на нашу думку, цей стан тривалої “фізіологічної напруги” слід віднести до негативних ефектів малих доз, бо організм змушений переходити на нові режими функціонування. Визначена довготривала дискоординація в протеіназно-інгібіторній системі крові можлива в тому випадку, коли під дією іонізуючої радіації за доз 20-30 сГр відбуваються певні порушення на рівні геному, які не дозволяють адекватно корегувати процеси метаболізму.
Вплив рентгенівського опромінення, гіпоксії і відновленого глутатіону на активність катепсинів B, L, H при пухлинному рості. Найбільш ймовірним стохастичним ефектом іонізуючого опромінення є виникнення злоякісних новоутворень. У комплексі сучасних засобів лікування злоякісних пухлин променева терапія посідає одне з перших місць. Пошуки засобів ефективного поліпшення променевої терапії пухлин мають на меті подолання їх радіорезистентності, обумовленої існуванням фракції гіпоксичних клітин, і приводять до застосування методів, що вибірково модифікують реакцію пухлинної тканини на опромінення.
Нами встановлено, що наявність і розвиток саркоми 45 в організмі щурів спричиняє вплив на активність катепсинів головного мозку, селезінки, печінки та нирок. Активність катепсину В у селезінці щурів-пухлиноносіїв підвищується в 2,1 рази, катепсину L в 4,5 рази в головному мозку та в 1,6 і 1,3 рази в селезінці та нирках відповідно. Активність катепсину Н збільшується в головному мозку і нирках в 2,3 і 1,9 рази відповідно. Виникнення і розвиток пухлини саркоми 45 супроводжуються змінами ферментних систем як самих малігнізованих клітин, так і органів пухлиноносіїв.
Для визначення біохімічного ефекту гіпоксирадіотерапії, при якому досягалася б більша променева ефективність, ми дослідили вплив тотального (6 Гр) і локального (на пухлину 12 Гр) рентгенівського випромінювання на активність катепсинів В, L, Н головного мозку, селезінки, печінки, нирок та пухлини за умов опромінення на повітрі і при застосуванні газогіпоксичної суміші, що містить 10% кисню і 90 % азоту (ГГС-10) у різні терміни після дії радіації. При комбінованій дії рентгенівського випромінювання і газової гіпоксичної суміші встановлена радіозахисна дія ГГС-10 на протеолітичну активність катепсинів селезінки. При тотальному опроміненні щурів на фоні вдихання ГГС-10 активність катепсину L на 4-ту і 9-ту доби, а катепсину В на 9-ту добу після опромінення наближається до контрольних значень. Нормалізація активності катепсинів В, L, Н має місце і після локального опромінення саркоми 45 на фоні гіпоксії. Локальне опромінення пухлини в дозі 12 Гр на фоні вдихання ГГС-10 спричиняє менш виражені коливання активності катепсинів у печінці в порівнянні з опроміненням на повітрі, що може свідчити про радіозахисний ефект газогіпоксичної суміші. Активність катепсину Н на 9-ту добу перевищує значення контрольних величин в 1,5 рази, а при опроміненні на повітрі – в 2 рази. Активність катепсину L через 4 доби в 1,5 рази менша, ніж при опроміненні на повітрі. Тотальне рентгенівське опромінення щурів-пухлиноносіїв на повітрі спричиняє зниження активності катепсину L у нирках в 2,2 і в 4,4 рази на 4 та 9 доби відповідно. Активність катепсину В вірогідно не змінюється, а катепсину Н знижується на 69% на 9-ту добу після опромінення.
Інтерес представляють дані про зміну активності катепсинів у злоякісній пухлині саркомі 45 після тотального і локального рентгенівського опромінення на повітрі і вдиханні ГГС-10. При комбінованій дії тотального опромінення і гіпоксії встановлено підвищення активності катепсину L у пухлині на 9 добу у 1,5 рази, а катепсину Н на 4 добу у 2 рази у порівнянні з контролем. Локальне опромінення пухлини на повітрі зумовлює підвищення активності катепсину L з більш вираженим ефектом на 4 добу. Застосування ГГС-10 не виявляє нормалізуючої дії на активність катепсинів L та Н в тканині пухлини, а достовірне підвищення рівня протеолітичної активності на 9 добу, можливо, і чинить згубну дію на пухлину (автоліз, розпад, падіння ваги пухлини). Таким чином, активність катепсинів В, L, Н інтактних щурів і щурів-пухлиноносіїв після впливу рентгенівського випромінювання суттєво змінюється в залежності від умов опромінення (тотальне, локальне) і терміну після дії радіації. Застосування ГГС-10 в процесі опромінення тварин чинить захисний ефект (нормалізація активності у тканинах селезінки, печінки і нирках), а в саркомі 45 щурів відмічається достовірне підвищення активності ферментів. Ця обставина може мати важливе значення при розробці оптимального режиму застосування існуючих випромінювань в практиці терапії злоякісних новоутворень.
Глутатіон – один з найважливіших ендогенних антиоксидантів, що забезпечує знешкодження вільних радикалів і перекисей і відіграє важливу роль у розвитку новоутворень (Dringen R., 2000). Радіопротекторна дія глутатіону може реалізуватись не тільки за рахунок безпосередніх реакцій з вільними радикалами та продуктами оксидантної модифікації макромолекул, але й на метаболічному рівні (Bump E. et al., 1990). Встановлено, що вміст глутатіону в доброякісних і злоякісних пухлинах значно нижчий в порівнянні з нормою. Ступінь зменшення різний в пухлинах з різним гістологічним діагнозом, але в усіх випадках він був більш виражений для GSН. Вміст GSН, виражений в % від його концентрації в нормальному мозку у менінгеомах був у межах 46-58 %, вміст окисленого глутатіону складав 72-97 %, у астроцитомах 15-60 % та 48–73 %, у гранулемі та олігодендроглеомі цей показник склав для GSН 5-6 %, а для GSSG 7–10 %. У пухлинах головного мозку рівень відновленого глутатіону значно нижчий за норму, підсилюється його вихід в кров, що призводить до зниження загальної оксидазної активності тканин, а це в свою чергу може сприяти розвитку гіпоксичних ракових клітин в організмі. Можливо, введення значних доз відновленого глутатіону гальмуватиме даний процес і запобігатиме розвитку пухлини. Ми дослідили вплив відновленого глутатіону in vivo на ріст пухлини щурів (саркома 45). Оцінку ефективності визначали за вагою пухлини. Встановлено, що внутрішньоочеревне введення відновленого глутатіону в дозі 150 мг/кг ваги тварини з 6 доби після трансплантації і до декапітації на 16 добу приводить до зниження ваги пухлини в порівнянні з контролем. При введенні на I добу після прищеплення вага складала 55% від контрольної, на 6 та 11 – 61% та 67% відповідно, тобто, чим раніше починали вводити глутатіон, тим ефективніше був його вплив на ріст пухлини. Внутрішньоочеревне введення відновленого глутатіону суттєво не впливає на активність катепсинів В, L, Н головного мозку, печінки, селезінки та нирок. Виникнення і розвиток пухлини супроводжується змінами протеолітичної активності як самої пухлини, так і тканин організму пухлиноносія.
Характеристика цистеїнових катепсинів В, L, Н нормального мозку і пухлин головного мозку. Встановлено, що у пухлинах головного мозку активність катепсину В вища, ніж у сірій речовині великих півкуль нормального мозку (рис.11). В менінгеомах активність в середньому в 1,6 рази вище за норму. Найбільший рівень активності визначено в ізоморфоклітинній гліобластомі і менінгеальній саркомі з IV ступенями злоякісності (в 4,7 та 5,5 разів перебільшує активність у нормальному мозку відповідно).
Рис. 11. Активність катепсину В у пухлинах головного мозку (в % від активності сірої речовини великих півкуль): К-сіра речовина великих півкуль; 1-2 – менінгеоми; 2- ендотеліома арахноідна; 4-астроцитома дедиференційована; 5–фіброзна менінгеома; 6-менінгеома дедиференційована; 7-менінгеома; 8-ізоморфоклітинна гліобластома; 9-менінгеальна саркома.
Оптимум рН в сірій речовині великих півкуль головного мозку дорівнює 6,0. Для менінгеоми та ізоморфоклітинної гліобластоми рН оптимум знаходиться при 4.0, а для менінгеальної саркоми - при рН 4.0; 5.0; 6.0. Концентрація іонів водню в середині і зовні клітини є фактором, який регулює спрямованість та інтенсивність внутріклітинних процесів. Під впливом кислого середовища в малігнізованих клітинах лізосоми транслокуються до поверхні клітини і секретують катепсин В (Keren Z. et al., 1988).
Запропонована нами схема виділення катепсину В дозволила за 5 етапів:
гомогенізація, висолювання сульфатом амонію (30-80 %), хроматографія на конканавалін А-сефарозі, іоннообмінна хроматографія на DEAE-сефадексі А-50, гель-фільтрація на сефадексі G-100 (75), очистити фермент із сірої речовини великих півкуль у 1012 разів, а з фіброзної менінгеоми - у 992 рази. Молекулярні маси катепсину В для норми склали 24500, а для пухлини – 21000. У сірій речовині встановлено найменше значення Vmax (методом Лайнуівера – Берка) 13,5 при найбільшій спорідненості катепсину В до екзогенного субстрату БАПА (Км=6,8⋅10-4М) в порівнянні з пухлинами. В гліобластомі Vmax дорівнювала 89 при найменшому значенні Км=1,2⋅10-4М. Катепсин В проявляє максимальну активність в присутності 2-МЕ та EDTO в усіх досліджуваних зразках мозку, причому найбільшу залежність від 2-МЕ спостерігали у злоякісній пухлині (гліобластомі) в порівнянні з контролем та іншими пухлинами.
Встановлено,що катепсин L найбільш чутливий до азоказеіну, обробленому 3М сечовиною, тому що, по-перше, під впливом сечовини азоказеін змінює свою конформацію, по-друге, сечовина швидко інактивує катепсини В і Н (Barrett A. et al., 1981). Катепсин L із сірої речовини великих півкуль головного мозку очистили у 1242 рази по відношенню до гомогенату. Катепсин L активується 2МЕ L-цистеїном, 2МЕ+ЕDТО, пригнічується ПХМБ на 47%, монойодоцтом на 41%, а інгібітори серинових протеіназ не впливають на активність ферменту. Активність катепсину L визначили у 31 зразку пухлин головного мозку. Встановлено, що оптимум pH катепсину L у мозку дорівнює 6,5, а в пухлині (менінгеомі) - 6,0. У пухлині збільшується Vmax і Km, що свідчить про підвищення протеолізу при зменшенні спорідненості ферменту до екзогенного субстрату азоказеіну, у порівнянні з нормою. Більш 80% обстежених пухлин характеризується підвищеним рівнем активності катепсину L. Встановлена позитивна кореляція між рівнем активності катепсину L і ступенем злоякісності для пухлин сполучнотканинного та епітеліального походження (табл. 2).
Таблиця 2
Активність катепсину L у пухлинах головного мозку людини в залежності від ступеня злоякісності і гістогенезу
Нами вперше встановлено, що для катепсину Н більш висока як ендо-, так і амінопептидазна активність визначається у корі великих півкуль в порівнянні з білою речовиною головного мозку. Залежність гідролізу Лей- 2НА від рН середовища має максимум при рН 6,0. Значення Км для катепсину Н із мозку людини дорівнює 5·10-5 М, а Vmax - 14 мкМ 2НА/мг білка. Отримані значення Км для катепсину Н із сірої речовини великих півкуль головного мозку свідчить про значну спорідненість досліджуваного ферменту до субстрату Лей-2НА. Вивчення чутливості катепсину Н до інгібіторів різних класів пептидаз показало, що фермент проявляє максимум активності в присутності тіолових сполук (2-МЕ, ДТТ та G-SH).
Застосована схема виділення катепсину Н дозволила очистити фермент із сірої речовини великих півкуль головного мозку у 1795 рази, а із пухлини (менінгеома фіброзна) у 2457 відповідно до активності в гомогенаті. Молекулярні маси катепсину Н складали відповідно 28000 та 25000. Наведені дані корелюють з результатами Sivaparvathi: молекулярна маса катепсину Н дорівнювала 27 і 25 кDа у нормальному мозку і пухлинних зразках (гліоми) відповідно (Sivaparvathi et al., 1995). При дослідженні рівнів активності катепсину Н у пухлинах головного мозку (астроцитоми, менінгеома, гліобластоми) встановлено, що всі ці гістологічні типи пухлин мають виражену амінопептидазну активність катепсину Н. Рівень активності катепсину Н у гліобластомах вищий, ніж у астроцитомах і менінгеома. Визначено, що Vmax для даного ферменту дорівнює 50 мкМ 2НА/мг білка у менінгеомі, що в 3,5 рази вище за Vmax для катепсину Н нормального мозку, а Км, згідно з графіком Міхаеліса-Ментен, дорівнює 3,9⋅10-5М, що в 1,3 рази менше, ніж у нормі.
Таким чином, особливого значення набувають дані про підвищення рівнів активності цистеїнових катепсинів В, L, Н у пухлинах мозку, які корелюють зі ступенем злоякісності, а також про збільшення швидкості ферментативних реакцій у пухлинах за рахунок зміни значень Км і зниження молекулярних мас ферментів у пухлинах.
ЗАКЛЮЧНА ЧАСТИНА
На основі порівняльного дослідження рівнів активності лізосомальних катепсинів В, L, Н і зміни їх компартменталізації у функціонально і морфологічно різних структурах головному мозку, сироватці крові дорослих щурів і нащадків першого покоління запропонована концепція радіаційного і гіпоксичного ураження лізосомально-вакуолярного апарату клітин нервової системи за низьких доз рентгенівського опромінення: - первинною радіаційною мішенню розглядаються мембрани лізосомально-вакуолярного апарату клітин як єдина структурно-функціональна система, для ініціації якої достатньо дуже малої (10 сГр) дози (рис 12);
- початкова ініціація ПОЛ в мембранах під дією малих доз мобілізує стрес-реалізуючі системи, активує АО-систему;
- біомембрани популяцій лізосом мають високу радіочутливість, яка поєднується зі значними компенсаторно-репаративними можливостями;
- під впливом радіації розвивається гемічна гіпоксія, яка підсилює активацію пероксидації ліпідів, які відіграють роль аутокаталізаторів;
- за дози 25 сГр потужність АО-системи недостатня для компенсації спричинених змін пошкодження мембранних структур лізосомально-вакуолярного апарату, і розвивається вторинна більш тривала активація ПОЛ, що виявляється в активації лізосомально-вакуолярного апарату клітин; підвищені
лабілізації мембран лізосом, активації новоутворення первинних лізосом, і можливим переходом системи протеолізу до нового режиму функціонування;
- в міру підвищення ПОЛ, АО-дефіциту більш лабілізуються мембрани лізосом, відбувається транслокація лізосом до ядра, вивільняються катепсини, які спричиняють і ініціюють зміни іншої радіаційної мішені – хроматину, ініціюючи перехід хроматину в новий стаціонарний стан ;
- активно розвиваються цитолітичні процеси в тканинах і лізосомальні цистеїнові катепсини потрапляють в кров;
- віддалені наслідки радіаційного пошкодження батьківського організму мають стохастичні ефекти, які проявляються у нащадків безпосередньо опромінених батьків.
Отримані результати дозволяють з’ясувати роль цистеїнових катепсинів у механізмах пухлинного росту і малігнізації та визначити відмінності фізико-хімічних властивостей катепсинів В, L, Н пухлин головного мозку. Ці дані набувають особливого значення для розробки шляхів підвищення ефективності променевої терапії, об’єктивної оцінки реакції тканин головного мозку на пухлинну трансформацію. Спираючись на результати досліджень і дані літератури можна запропонувати наступну концепцію участі лізосомальних цистеїнових катепсинів в оцінці ознак злоякісності пухлин, у процесах пухлинного росту та інвазії:
- малігнізація пухлин головного мозку супроводжується підвищенням рівнів активності катепсинів В, L, Н, які залежать від гістоструктури, гістогенезу та ступеня злоякісності пухлин;
- у пухлинах знижується антиоксидантна система, у тому числі і за рахунок значного зменшення концентрації відновленого глутатіону;
- до молекулярно-клітинних механізмів, які пояснюють підвищення показників рівнів активності лізосомальних цистеїнових катепсинів у пухлинах можна віднести зміни молекулярних мас, підвищення швидкості ферментативних реакцій за рахунок зміни спорідненості катепсинів до ендо- і екзогенних субстратів, зміщення оптимуму рН в більш кислу зону;
- закислення цитоплазми в пухлинній клітині спричиняє транслокацію лізосом з перинуклеарної зони до плазматичної мембрани, зміну форми лізосом з тубулярної до везикулярної і індукує вивільнення цистеїнових катепсинів В, L, Н із лізосом, і вони, таким чином, можуть приймати участь в процесах інвазії.
Викладені положення дозволяють визначити, що зміни на рівні мембран лізосомально-вакуолярного апарату клітин є однією з причин виникнення і розвитку патологій ЦНС, індукованих іонізуючою радіацією, гіпоксією та пухлинною інвазією.
ВИСНОВКИ
1. Іонізуюча радіація високої інтенсивності за доз 50, 100, 200Гр дозозалежно підвищує активність цистеїнових катепсинів B, L кори головного мозку щурів з більш вираженими змінами активності і компартменталізації за дози 200 Гр. Збільшення вільної і неседиментованої форм активності цистеїнових катепсинів зумовлені лабілізацією мембран лізосом у порівнянні з синтезом ферментів de novo. Резистентність мембран лізосом кори головного мозку до впливу радіації (200Гр) встановлена за наявності латентної активності при дії 0,1-0,2% тритону Х-100 на лізосомальну фракцію мозку опромінених щурів.
2. В діапазоні малих доз рентгенівського випромінювання (5-25 сГр) зміни активності катепсину L мають нелінійний ступінчастий характер. Стійке підвищення активності у клітинах кори головного мозку, мозочку, середнього мозку, гіпокампу, Варолієвого мосту і смугастого тіла відмічається за дози 25 сГр. У сироватці крові достовірне підвищення активності ферменту визначається за дози 10 сГр, а повторне стійке підвищення активності виявляється за дози 25 сГр, що відображає стан протеолізу за даним показником у тканинах опроміненого організму.
3. Одноразове і фракціоноване тотальне рентгенівське опромінення щурів за дози 25сГр викликають не однакові за механізмами відповіді лізосомального апарату клітин функціонально і морфологічно різних структур головного мозку:
-при одноразовому опроміненні виявляються зміни всіх форм активності катепсинів B, L, Н, які вибірково розгорнуті у часі з характерним підвищенням досліджуваних форм активності через 120-168 годин після опромінення; ступінь підвищення залежить від структури мозку і міцності зв’язку ферментів з лізосомами.
-при фракціонованому опроміненні підвищення рівнів активності катепсинів B, L, H визначається переважно в ранні строки після опромінення (1÷24 години), а в пізніші терміни відмічається тенденція зниження досліджуваних форм активності, а для мембранозв’язаної і нормалізація;
-фракціоноване опромінення спричиняє менший лабілізуючий вплив на мембрани лізосомально-вакуолярного апарату клітин мозку і менш виражені зміни активності катепсинів у сироватці крові.
4. Фракціоноване рентгенівське опромінення разом чи окремо самців або самок за дози 25 сГр індукує різні зміни рівнів активності катепсину L і перерозподіл їх у структурах головного мозку нащадків під час постнатального розвитку на користь неседиментованої активності з максимальним підвищенням на 6 добу. Найбільш виражені зміни неседиментованої і мембранозв’язаної форм активності катепсину L виявлені у корі головного мозку, мозочку, середньому мозку і Варолієвім мості нащадків за умов опромінення самки і самця. Найменші зміни визначалися у структурах головного мозку нащадків інтактного самця і опроміненої самки.
5.Рентгенівське опромінення за дози 25 сГр, як і хронічне введення нітриту натрію, спричиняє підвищення вмісту метгемоглобіну у крові щурів, що свідчить про розвиток гемічної гіпоксії. Максимальні рівні концентрації метгемоглобіну визначені через 120 годин після одноразового і фракціонованого опромінення.
6. Нітритна метгемоглобінемія середньої тяжкості спричиняє модифікацію метаболічної відповіді лізосомально-вакуолярного апарату клітин мозку у гіпоксичних самок, аналогічну до ефекту іонізуючої радіації за дози 25 сГр з менш вираженими змінами досліджуваних форм активності.
7. За умов пренатальної гемічної гіпоксії відбувається диференційоване підвищення рівнів вільної і неседиментованої активностей цистеїнових катепсинів в залежності від структури мозку нащадків і терміну постнатального розвитку внаслідок перерозподілу активності із мембранозв’язаної форми в розчинну. Підвищення активності катепсинів B, L, Н у сироватці крові нащадків більш виражене в порівнянні з дорослими щурами, з максимальним значенням на 1 добу життя. Таким чином, мозок, що розвивається, є більш чутливим і вразливішим до дії гемічної гіпоксії.
8. У пухлинах головного мозку зниження вмісту відновленого і окисленого глутатіону залежить від гістоструктури пухлини і ступеня злоякісності і сприяє розвитку гіпоксичного стану з більш вираженою залежністю для відновленого глутатіону.
9. Тотальне (6 Гр) і локальне опромінення саркоми 45 щурів (12 Гр) супроводжується розвитком типових для радіації зрушень активності катепсинів В, L, Н. Застосування ГГС-10 при тотальному і локальному опроміненні індукує різноспрямовані зміни активності катепсинів у пухлині і тканинах пухлиноносіїв і цим відтворює захисний ефект нормальних тканин, про що свідчить нормалізація активності ферментів в них при відсутності захисту пухлин, в яких активність катепсинів залишається підвищеною. Введення in vivo відновленого глутатіону (150 мг/кг) гальмує розвиток і ріст саркоми 45 щурів.
10. Рівні активності катепсинів В, L, Н у пухлинах головного мозку значно підвищені і залежать від гістоструктури, гістогенезу і ступеня злоякісності. Визначено, що у пухлинах відбувається збільшення Vmax , зміщення оптимуму рН в більш кислу зону; молекулярна маса ферментів нижче за норму, і відповідно змінюється Km . Відмінності в специфічності цистеїнових катепсинів В, L, Н мозкової тканини зумовлюють особливості їх біологічних функцій, які проявляються, зокрема в синергізмі їх функціонування, що підтверджується характером сумісної дії в деградації нейроспецифічних білків.
11. Підвищені рівні активності цистеїнових катепсинів у сироватці крові ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС на фоні встановленого розбалансування антиоксидантної системи крові (підвищеного рівня вільно-радикальних процесів, зниженої активності інгібіторів α1-АТ та α2-МГ) можуть бути застосовані як об’єктивні показники реакції організму на дію іонізуючої радіації.
12. Запропонована концепція розвитку індукованих іонізуючою радіацією в малій дозі і гіпоксією ушкоджень лізосомально-вакуолярного апарату клітин нервової тканини.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Березин В.А., Черная В.И., Рева А.Д., Смагина Л.Д. Очистка и некоторые свойства тиол-активируемых катепсинов из больших полушарий коры головного мозга и мозжечка быка // Укр. биохим. журн. – 1982. - Т. 54, №3. – С. 249-253.
Черная В.И., Рева А.Д. Активность катепсина Н в мозге и опухолях мозга человека // Укр. биохим. журн. – 1989. - Т. 61, №5. – С. 47-50.
Лихолат Е.А., Рева А.Д., Соколов И.И., Черная В.И. Влияние рентгеновского облучения и гипоксии на протеолитическую активность селезенки крыс в норме и при опухолевом росте // Радиобиология. – 1991. - Т. 31, №1. – С. 38-42.
Черная В.И., Соколов И.И., Рева А.Д. Цистеиновые катепсины в норме и при опухолевом росте //Вестник ДГУ. Биология. Экология.–1996.-Вып.2.– С. 31-40.
Черная В.И. Влияние ионизирующего облучения на активность катепсина В субклеточных фракциях мозга // Вестник ДГУ. Биология. Экология. –1997. - Вып. 3.– С. 62-68
Черная В.И. Участие лизосомальных ферментов в адаптивных изменениях метаболизма при лучевой патологии // Вестник ДГУ. Биология. Экология. – 1998. - Вып. 4. – С. 51-55.
Черная В.И. Катепсин L из мозга человека. Очистка и содержание в опухолях мозга // Укр. биохим. журн. – 1998. - Т.-70, №5. – С. 97-103.
Черная В.И., Пирожкова И.В., Шнейдер О.Г. Сочетанное воздействие ионизирующей радиации в малых дозах и свинца на активность катепсинов // Вестник ДГУ. Биология. Экология. – 1998. - Вып. 4. – С. 46-50.
Черная В.И. Изучение активности катепсина В в опухолях головного мозга человека // Доповіді НАН України. – 1999. - №2. – С. 172-176.
Lykholat E.A., Chornaya V.I. Parametres of peroxidation and proteolysis in the organizm of the liquidators of Chernobyl accident // Укр. биохим. журн. – 1999. - Т. 71, №3. – С. 82-85.
Чорна В.І. Динаміка зміни активності катепсину В під впливом іонізуючого опромінення // Вісник ДДУ. Біологія. Екологія. – 1999. - Вип. 6. – С. 42-45.
Чорна В.І., Педан Л.Ф., Зозуля Г.І. Структурно-функціональні зміни в лізосомально-вакулярному апараті мозку при хронічному емоційному стресі // Нейрофизиология/ Neurophysiology - 1999. –Т. 31, №4. – С. 351-352.
Чорна В.І. Активність та локалізація цистеїнових катепсинів мозку після дії іонізуючої радіації // Нейрофизиология/Neurophysiology – 1999. – Т. 31, №1. – С. 55-57.
Дука Т.И, Лещинская И.А, Черная В.И. Влияние гемической гипоксии средней тяжести на содержание NCAM и ГФКБ в развивающемся мозге и в мозге взрослых животных // Доповіді НАН України.- 2000. - №4. – С. 164-170.
Чорна В. І., Педан Л.Ф. Дослідження впливу хронічного та одноразового рентгенівського випромінювання в малих дозах на цистеїнові катепсини крові. // Вісник ДДУ. Біологія. Екологія. – 2000. - Вип. 7. – С. 237-242.
Лещинська І.О., Дука Т.І, Шаповалова М.С., Чорна В.І. Вміст нервовоспецифічних білків NCAM, ГФКБ та S100В у сироватці крові після одноразового опромінення у дозі 0,25 Гр // Укр. радіол. журн. – 2000. - Т. 8, вип. 2. - С. 164-167.
Чорна В. І. Динаміка зміни активності цистеїнового катепсину L мозку під впливом рентгенівського опромінення // Укр. радіол. журн.- 2000. -Т. 8, вип. 3. - С. 269-271.
Лещинская И.А., Дука Т.И, Черная В.И. Поведенческие реакции крыс и содержание нейроспецифических белков в их мозгу после однократного радиационного воздействия // Нейрофизиология/ Neurophysiology – 2000. – Т. 32, №1. – С. 22-28.
Чорна В.І. Дослідження радіаційно-індукованих змін активності та компартменталізації цистеїнового катепсину L мозку // Вісник Київського Університету. Біологія – 2001. - № 33. - С. 9-11.
Черная В. И. Влияние однократного и хронического облучения низкой интенсивности на активность катепсина L мозга крыс // Укр. біохім. журн. – 2001. - Т. 73, №2. – С. 48-52.
Чорна В.І. Динаміка активності катепсину L у структурах головного мозку щурів в початковий період постнатального розвитку // Нейрофизиология/ Neurophysiology – 2001. – Т. 33, №1. – С. 20-23.
Дука Т.И, Лещинская И.А., Черная В.И. Иммуноферменное определение нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM) глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) в сыворотке крови хронически облученных крыс в дозе 0.25 Гр // Вісник ДДУ. Біологія. Екологія. – 2001. - Вип. 8, Т. 2. – С. 6-9.
Чорна В.І. Зміни активності катепсину В у мозку щурів за умов гемічної гіпоксії // Нейрофизиология/ Neurophysiology – 2001. – Т. 33, №2. – С. 75-78.
Рева А.Д., Кузьменко Е.А., Черная В.И. Влияние глутатиона на активность катепсинов головного мозга // Ред. ж. “Нейрохимия”. – 1988. – Т. 4. – С. 636. Деп. в ВИНИТИ 14.11.88 г., №8086-В88.
Рева А.Д., Лихолат Е.А., Черная В.И. Содержание глутатиона и активность катепсина D в мозге и опухолях головного мозга человека / Деп. в ВИНИТИ 21.08.90 г., №4711-В90 // Аннот. в библиогр. указателе ВИНИТИ “Депонированные рукописи”, - 1990. – №2, б/о 32.
Черная В.И. Активность цистеиновых катепсинов В, Н в нормальном мозгу и опухолях мозга человека // Сб. ДГУ “Современные тенденции в развитии медицины и здравохранения”. – 1995. – С. 190-192.
Черная В.И. Клинико-патологические данные о роли цистеиновых протеиназ в канцерогенезе // Сб. ДГУ “Актуальные вопросы биологии и медицины”. – 1997. – С. 92-95.
Черная В.И. Участие лизосомальных ферментов белкового обмена в молекулярных механизмах адаптации к действию ионизирующего излучения // Сб. ДГУ “Регуляция в живых системах”. – 1998. – С. 142-144.
Черная В.И., Шнейдер О.Г., Педан Л.Ф. Лизосомальний аппарат в свете общего адаптационного синдрома // Сб. ДГУ “Регуляция в живых системах”. – 1998. – С. 145-147.
Березін В.О., Чорна В.І., Рева О.Д. Очистка та характеристика тіол-активованого катепсину з великих півкуль головного мозку та мозочку бика // IV Український біохімічний з'їзд. Тези доп. Частина 1. – Київ: Наукова думка, - 1982. – С. 175.
Рева А.Д., Черная В.И., Кухаренко Р.И., Соколов И.И., Шаинская А.М., Максимова А.И. Ферменты катаболизма белков мозга // Проблемы современной биохимии и биотехнологии. 8 объединенный симпозиум биохимических обществ СССГ и ГДР. – Рига. - 1985. – С. 124.
Рева А.Д., Генгин М. Т., Березин В.А., Черная В.И., Шаинская А.М. и др. Протеиназы и пептидазы головного мозга // V Всесоюзный биохимический съезд. Тез. стендовых сообщений. – Т.2. – Москва: Наука, 1986. - С. 457.
Chornaya V.I., Sokolov I.I. The effect of X-ray irradiation and hypoxia on proteolitic activiti of the rat liver in the condition of tumor cancer grouth // 20 Meeting FEBS. – Budapest. – 1990. - P. 144.
Чорна В.І. Біохіміні та біофізичні кінетичні параметри катепсинів В,Н нормального мозку та пухлин мозку людини // І-й з'їзд Укр. біофізичного товариства (Матеріали з'їзду). – Київ. – 1994. – С. 253-254.
Chornaya V., Nedzvetsky V., Zhernossekov D., Sedykh A. Neurospecific proteins in the presentce of risk factors at children // 23-rd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies. – Basel – 1995. – P. 163.
Самофалова Е.Г., Снисарь И.А., Лихолат Е.А., Черная В.И., Седых А.И., Сапа Ю.С. К вопросу о состоянии имунной системы участников и детей ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС // Тези наук.-практичної конф. "Віддалені наслідки опромінення в імунній та гемопоетичній системах". – Київ. – 1996. – С. 45.
Stepchenko L., Chornaya V. Role of humic preparation in regulating protein metabolism of lastgrowing chicks // 10th International Peat Congress. – Bremen (Germany). – 1996. – P. 229.
Черная В.И. Протеиназы лизосом в процессе биохимической адаптации к действию ионизирующего излучения // ІІІ съезд по радиобиологическим исследованиям. – М.: Пущино, 1997. – Т. 1 - С. 167-168.
Сєдих А.І., Чорна В.І., Спіцина І.О., Дука Т.А., Тищенко В.А., Гайдук О.І. Визначення нейроантигенів NCAM та ГФКБ у крові новонароджених з перинатальними гіпоксичними пошкодженнями мозку // VII Укр. біохімічний з'їзд. Тези доп. Ч.ІІ. – Київ. – 1997. – С. 164-165.
Чорна В.І., Васьковський Д.М. Біохімічни та фізико-хімічні зміни цистеїнового катепсину L за різними патологіями // VII Укр. біохімічний з'їзд. Тези доп. Ч.ІІІ. – Київ. – 1997. – С. 97-98.
Черная В.И. Биохимические и физико-химические изменения цистеиновых катепсинов при канцерогенезе // 4 Міжнародна конференція "Франція та Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур", Дніпропетровськ (Україна).-1997.- Т.2.- С. 143-144.
Черная В.И. Влияние хронического рентгеновского облучения на активность цистеиновых катепсинов крови и их коррекция природными адаптогенами // Материалы Всероссийской конф. с междунар. участием "Проблемы противолучевой защиты". – Москва. – 1998. – С. 109.
Чорна В.І. Протеолітичні ферменти крові під впливом іонізуючої радіації, свинцю та їх комбінованої дії // Тези доп. ІІ з'їзду Укр. біофізичного товариства. – Харків. – 1998. – С. 240.
Лихолат Е.А., Черная В.И. Интенсивность ПОЛ и протеиназно-ингибиторной активности системы крови больных хроническим бронхитом, принимавших участие в ликвидации аварии на ЧАЭС // Материалы Всероссийской конф. с междуран. участием "Проблемы противолучевой защиты". – Москва. – 1998. – С. 134-135.
Thiornaya V.I. Le role de la proteiase dans les processes d'adaptation au stress // V-e Conference Internationale "France et Ukraine, Experience scientifique et pratique dansle contexte du dialogue des cultures nationales" – Дніпропетровськ (Україна). – 1998. – Т.3. – С. 85.
Лихолат О., Чорна В. Протеазна активность сироватки крові хворих на хронічний бронхіт в умовах екологічної напруги // VII конгрес світової федерації українських лікарських товариств. – Ужгород (Україна) // Укр. медичні вісті. – 1998. - Т.2, № 59-60. – С. 204-205.
Chornaya V. Purification and properties of a cathepsin B from human brain and tumors // 25 Silver Jubilee FEBS Meeting.–Copenhagen (Denmark).– 1998.– P. 138.
Leshchyns'ka I.A., Duka T.I., Chornaya V.I. The sexual difference of NCAM and GPAF levels in rat brain after irradiation of 0.25 Gy x-ray singly // 29th Annual Meeting . – Miami Beach, Fla (USA). – 1999 // Society for Neuroscience. - Vol. 25, Part 1. – P. 217.
Duka T. I., Leshchinska I. A., Chornaya V.I. The NCAM and GFAP of rats brain after hemic hypoxic injury // 29 Annual Meeting.- Miami Beach, Fla(USA).- 1999 // Society for Neuroscience. – Vol.-25, Part 1. – P. 570.
Chornaya V. Lysosomal cysteine proteinases and there endogenous inhibitors: the role in tumor malignancy // 17th ISN/13th ESN meeting, Berlin (Germany). – 1999. // J. Neurochemistry. – V. 73, Suppl. 1999. - P. 48.
АНОТАЦІЯ
Чорна В.І. Цистеїнові катепсини в умовах променевого ураження та злоякісного росту.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 – радіобіологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2001.
Дисертація присвячена вивченню механізмів функціонування лізосомально-вакуолярного апарату клітин ЦНС за умов дії надлетальних, малих доз іонізуючого випромінювання, гіпоксії та пухлинного процесу. Встановлено, що зміни активності, компартменталізації та фізико-хімічних властивостей лізосомальних цистеїнових катепсинів В,L,Н у функціонально і морфологічно різних структурах головного мозку, сироватці крові свідчать про характерні відмінності в системі протеолізу за дії радіації у дозах 50, 100, 200 Гр; одноразовому і фракціонованому опроміненні за дози 25 сГр. Визначено, що за умов дії малих доз радіації (5-25 сГр) з низькою потужністю проблема пошкодження мембран висувається на перший план. Тотальне рентгенівське опромінення за дози 25сГр індукує зміни поліпептидного складу розчинних і мембранозв’язаних білків головного мозку. Встановлена деградація нейроспецифічних білків очищеними цистеіновими катепсинами В,L,Н головного мозку. З’ясована роль гемічної гіпоксії у розвитку радіобіологічних ефектів ЦНС під впливом малих доз радіації статевозрілих щурів і щурів-нащадків у ранньому періоді постнатального розвитку. Вперше встановлено, що опромінення батьків спричиняє різний ступінь активації катепсинів у структурах головного мозку нащадків першого покоління в залежності від того, хто з батьків був опромінений і від терміну онтогенетичного розвитку. Променевий вплив, а також комбінована дія рентгенівського опромінення і гіпоксії спричиняють протилежну спрямованість змін активності катепсинів у пухлині і тканинах щурів-пухлиноносіів і визначають залежність цих змін від дози опромінення, режиму опромінення, стадії пухлинного росту і ефекту променевої деструкції пухлини. Розроблена схема індукованих радіацією, пухлинною інвазією та гіпоксією ушкоджень лізосомально-вакуолярного апарату клітин ЦНС за змінами рівнів різних форм активності катепсинів, їх фізико-хімічних властивостей.
Ключові слова: ЦНС, цистеїнові катепсини, іонізуюче випромінювання, гіпоксія, пухлинний процес.
АННОТАЦИЯ
Черная В.И. Цистеиновые катепсины в условиях лучевого поражения и злокачественного роста.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.01 – радиобиология. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2001.
Диссертация посвящена изучению механизмов функционирования лизосомально-вакуолярного аппарата клеток ЦНС при условиях действия надлетальних, малых доз ионизирующих излучений, гипоксии и опухолевого процесса. Установлено, что изменения активности, компартментализации и физико-химических свойств лизосомальных цистеиновых катепсинов В,L,Н в функционально и морфологически различных структурах головного мозга, сыворотке крови свидетельствуют о характерных отличиях в системе протеолиза при действии радиации в дозах 50, 100, 200 Гр, а также однократного и фракционированного облучения в дозе 25 сГр.
Система протеолиза в головном мозге крыс, после облучения в дозе 25 сГр во все исследуемые сроки дестабилизирована и имеет тенденцию к активации. Выявлены особенности действия однократного и фракционированного рентгеновского излучения, которые проявляются в дифференцированной и избирательной чувствительности цистеиновых катепсинов в функционально и морфологически различных структурах головного мозга, неодинаковой способностью к суммации и восстановлению радиационно-индуцируемых повреждений. При действии малых доз радиации (5-25 сГр) с низкой интенсивностью на первый план выдвигается проблема повреждения мембран. Установлена зависимость "доза-эффект" для лизосомальных цистеиновых катепсинов, которая имеет нелинейный характер в коре головного мозга, мозжечке, среднем мозге, гиппокампе, варолиевом мосту и полосатом теле. Достоверное повышение уровня активности катепсинов в сыворотке крови свидетельствует о развитии цитолитических процессов в тканях обученных животных в дозе 25сГр. Согласно концепции первичного активирующего действия малых доз ионизирующих излучений, изменения активности исследуемых катепсинов, которые наблюдаются в коре больших полушарий и мозжечке, имеют порог при 10 сГр, а состояние повышенного протеолиза в клетках головного мозга отмечается при дозе 25 сГр. Степень повреждения лизосомально-вакуолярного аппарата клеток прослеживается за повышением уровня свободной активности лизосомальных катепсинов, перераспределением их из связанной формы в неседиментированную, а также выходом высвобожденных протеиназ в кровь.
Установлены повышенные уровни активности катепсинов B,L,H в сыворотке крови ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС на фоне разбалансирования антиоксидантной системы крови.
Тотальное рентгеновское облучение крыс в дозе 25 сГр индуцирует изменения полипептидного состава растворимых и мембраносвязанных белков головного мозга. Качественный характер выявленных изменений зависит от условий облучения и срока после радиационного воздействия. Установлена деградация нейроспецифических белков высоко очищенными эндогенными цистеиновыми катепсинами В,L,Н.
Выяснена роль гемической гипоксии в развитии радиобиологических эффектов ЦНС у половозрелых крыс и крыс-потомков в раннем периоде постнатального развития. Нитритная метгемоглобинэмия средней степени тяжести вызывает изменения лизосомально-вакуолярного аппарата клеток мозга аналогичные эффекту рентгеновских излучений, но с менее выраженными сдвигами активности. Впервые установлено, что облучение родителей вызывает разную степень активации катепсинов в структурах головного мозга потомков первого поколения в зависимости от того, кто из родителей был облучен, и от срока онтогенетического развития.
При опухолевом росте определен закономерный характер изменений уровней активности катепсинов. Показано, что наличие и рост опухоли (саркома 45 крыс) оказывает влияние на активность цистеиновых катепсинов головного мозга, селезенки, печени, почек крыс-опухоленосителей. Облучение, а также комбинированное действие рентгеновского излучения и гипоксической гипоксии вызывают противоположную направленность изменений уровней активности катепсинов в опухоли и тканях опухоленосителей. Установлена зависимость этих изменений от дозы облучения, режима облучения, стадии опухолевого процесса и эффекта лучевой деструкции опухоли. Показано, что уровни активности катепсинов в опухолях головного мозга значительно повышены и зависят от гистоструктуры, гистогенеза и степени злокачественности. В опухолях мозга наблюдаются изменения сродства исследуемых катепсинов к эндо-и экзогенным субстратам, повышение скорости ферментативных реакций, изменение молекулярных масс и физико-химических характеристик.
Разработана схема индуцированных радиацией, опухолевой инвазией и гипоксией повреждений лизосомально-вакуолярного аппарата клеток ЦНС по изменению соотношений уровней исследуемых форм активности цистеиновых катепсинов, их физико-химических свойств.
Ключевые слова: ЦНС, цистеиновые катепсины, ионизирующее излучение, гипоксия, опухолевый процесс.
SUMMARY
Chornaya V.I. Cysteine cathepsins in conditions of irradiation injury and malignant growth.- Manuscript.
Thesis for a doctor's degree by speciality 03.00.01 - radiobiology. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2001.
The dissertation is devoted to investigation of the role of lysosomal-vacuolar system of cells in CNS under effects of the high, low doses of ionising radiation, hypoxia and tumoral process. It was established, that the changes of activity, localisation and physicochemical properties of lysosomal cysteine cathepsins B,L,Н in various brain regions and in blood serum testify to characteristic differences in a system of proteolysis under effect of the total 50, 100, 200 Gy and under total single and fractional irradiation by 0,25 Gy dose. Is determined, that effect of the low dose irradiation (0,05-0,25 Gy) connected with membrane damage. The damage degree of the lysosomes membranes coincident with as alteration of free and unsedimentation activity of cathepsins and release of cathepsins to blood. The total x-ray irradiation by 0.25 Gy lead to changes of the polypeptide composition soluble and a membrane of a brain protein. It was established degradation of neurospecific protein by cysteine cathepsins B,L,Н. It was established the dependence of cathepsins activity in pups brain of irradiation degree of male or female (and male and female).
Irradiation and effect of x-ray irradiation and the hypoxia lead to opposite changes of cathepsins activity in a tumor and tissues of that rats. These alteration is depend on changes of a radiation dose and condition, of tumor growth stage and effect of x-ray destruction of tumors. It was developed the shema of interaction of effects by irradiation, tumor invasion and hypoxia due to different form of cathepsins activity and there physicochemical properties.
Key words: CNS, cysteine cathepsins, ionising irradiation, hypoxia, tumor process.
Підписано до друку 20.06.2001р.
Обсяг 1,9 друк. арк. Формат 60 90/16
Тираж 100 прим. Папір офсетний. Зам.№ 1559
_____________________________________
Друкарня Дніпропетровського національного університету
49050, м. Дніпропетровськ, вул. Казакова, 46
| 
