Библиотечный каталог авторефератов Украины

4. Культивування Hirschioporus laricinus на середовищах з

    молочною сироваткою.

Додавання молочної сироватки у середовище культивування викликає збiльшення швидкостi росту та продукування молокозсiдального ферменту (μmax), до того ж, чим бiльше сироватки у середовищi, тим вище μmax, отже скорочується час подвоєння показникiв (табл.2).

Таблиця 2                

Параметри, що характеризують динамiку змiни бiомаси та МЗА

8. laricinus пiд час культивування на середовищах з молочною

сироваткою.

Звертає на себе увагу i те, що додавання сироватки збiльшує тривалiсть експоненцiйної фази росту та бiосинтезу ферменту до 10-ти дiб, коли при ії вiдсутностi експоненцiйна фаза складає 5 дiб. Слiд вiдзначити, що пiд час додавання максимальної концентрації молочної сироватки у випадку з МЗА вiдбувається подовження лаг-перiоду.

Таким чином, змiнюючи кiлькiсть молочної сироватки у середовищi можна досягти прискорення як процесiв росту, так i продукування молокозсiдальних протеаз у H. laricinus та регулювати швидкiсть цих процесiв за власним бажанням.

З метою оптимiзації живильного середовища культивування H. laricinus, яке мiстить молочну сироватку i пмвне сусло, було проведено серiю модельних експериментiв згiдно з повним факторним експериментом 52 (ПФЕ 52). Для кожного експерименту на 5-ту та 10-ту добу культивування складалися рiвняння регресії, вiдповiдно яким за допомогою комп′ютерних програм будувалися поверхнi вiдгуку бiомаси та МЗА. ПФЕ 52 дозволив нам докладно дослiдити характер залежностi, визначити значення функції в будь-якiй точцi простору, обмеженого рiвнями факторiв.

Що стосується вдосконалення середовища, то для виключення ефектiв високого порядку та узагальнення отриманих даних нами було зменшено кiлькiсть рiвнiв факторiв вiдповiдно ПФЕ 32. В результатi експерименту отриманi данi, якi описуються рiвняннями регресії (1) i (2).

y = 48,983 - 1,051х1+3,548х2 - 4,026х12 - 7,86х22-3,269х1х2 + 3,138х1х22        (1)

у = 107,36 + 1,34х1 - 12,32х2 - 8,85х12 - 24,87х22 - 7,755х1х2                        (2)

Рiвняння (1) описує данi з МЗА, рiвняння (2) - данi з бiомаси, де х1 - кодованi значення концентрації пивного сусла, а х2 - кодованi значення концентрації молочної сироватки.

Характер залежностi МЗА i бiомаси вiд дослiджуванних факторiв подiбний. Мiнiмальнi значення функції зсунутi до краю, а плато оптимальних значень знаходиться у центрi поверхнi вiдгуку. Високi значення МЗА знаходяться в iнтервалi, де х1 ∈ [ -0,2 ; 0,5 ], а х2 ∈ [ -0,4 ; 0,5 ] (мал. 7). Що стосується бiомаси, то плато оптимуму обмежується значеннями х1 ∈ [ -0,2 ; 0,4 ] та x2 ∈ [-0,3 ; 0,5] .

Таким чином, високi значення МЗА i бiомаси були одержанi на середовищах, у яких спiввiдношення молочної сироватки i пивного сусла складає 1:1, до того ж кiлькiсть води, яка додається у середовище, також є важливою, тому що у випадку високих концентрацiй дослiджуваних факторiв значення МЗА та бiомаси зменшуються. Частка води повинна складати третю частину субстрату, отож, удосконалене середовище включає молочну сироватку, пивне сусло та воду в спiввiдношеннi 1:1:1. За результатами цих дослiджень Держпатентом Украiни прийнято рiшення про видачу патенту.

5. Введення у середовище культивування Hirschioporus laricinus

    бiологiчних додаткiв

Введення високих концентрацiй екстрактiв росткiв картоплi скорочує стацiонарну фазу росту, про що свiдчить зниження бiомаси наприкiнцi перiоду культивування. Екстракт росткiв картоплi пiдвищує МЗА тiльки в експоненцiйнiй фазi росту (таб.3), при подальшому культивуваннi на всїх середовищах рiвень активностi ферменту не вiдрiзняється вiд рiвня МЗА контрольного глюкозо-пептонного середовища, але при максимальнiй концентрації экстракту значення МЗА нижче, нiж у контролi.

Таблиця 3                        

Вплив вмiсту екстракту росткiв картоплi на

молокозсiдальну активнiсть штама М-81 H. laricinus.

Додавання у середовище культивування соєвого брошна у концентрації 0,5% i 1,0% стимулює, як накопичення бiомаси, так i бiосинтез молокозсiдального ферменту.

Введення гiберелiну у середовище стимулює МЗА. При концентрації 4 мг/л активнiсть вища, нiж при 2,5 мг/л. Така ж залежнiсть спостерiгається i стосовно бiомаси. Додавання ауксину на раннїх стадiях культивування знижує МЗА, одночасно вiдбувається пригнiчення росту, але пiзнiше активнiсть ферменту рiзко збiльшується та досягає рiвня контрольного глюкозо-пептонного середовища, а значення бiомаси навiть перевищують значення iнших середовищ.

Таким чином, для пiдтримування високих значень МЗА H. laricinus виправдано введення у середовище культивування гiберелiна у кiлькостi 4 мг/л, яка збiльшує МЗА в 2-2,5 разiв.

Ауксин краще використовувати у концентрації 4 мг/л з метою збiльшення бiомаси пiд час тривалого культивування.

ВИСНОВКИ

На пiдставi дослiджень регуляції молокозсiдальних протеїназ штамiв Hirschioporus laricinus ( Karst ) Ryv. можна зробити такi висновки :

1. Усi вивченi штами М-81, А-031, А-032 i Р-323 H. laricinus мають здатнiсть продукувати позаклiтиннi кислi протеїнази з високою молокозсiдальною активнiстю. Найбiльш активним є штам А-032. Шляхом використання рiзних фiзiологiчних факторiв можливе змiнювання значень молокозсiдальної активностi та досягнення ії високого рiвня у будь-якого iз штамiв H. laricinus.
2. Змiнювання температурного режиму культивування у межах вiд 280С до 320С не вiдбивається на характерi синтезу молокозсiдальних протеїназ та ростi H. laricinus. Цей температурний режим є оптимальним для культивування продуценту. З метою збiльшення виходу фермента доцiльно перед його видiленням пiддавати охолодженню до низьких плюсових температур ( 2-50С ) протягом двох годин, а також нагрiвання у межах 40-45 0С пртягом двох годин, до того ж нагрiвання має перевагу.
3. Штами H. laricinus здатнi регулювати рН середовища, пiд час їх вирощування на середовищах з цукрами. Активнiсть молокозсiдальної протеїнази пiд час культивування H. laricinus на глюкозо-пептонному середовищi контролюється двома iоногенними групами. рН 3,5 одиниць є оптимальною для утворення молокозсiдальних ферментiв штамами H. laricinus. Для цих штамiв оптимальнi значення кислотностi для накопичення бiомаси (рН 5,0) та синтезу фермента (рН 3,5) не збiгаються, що свiдчить про можливiсть використання комбiнованого режиму культивування : спочатку пiдтримувати кислотнiсть, яка сприяє росту грибiв, а пiсля цього ферментації.
4. Пiдбором джерел вуглецевого живлення можна регулювати спiввiдношення процесiв росту та змiни молокозсiдальної активностi штамiв H. laricinus як у бiк прискорення синтезу молокозсiдального ферменту, так i у бiк швидкостi росту. Використовуючи середовища з комбiнованим джерелом вуглецю, можна, коли необхiдно, синхронiзувати процеси росту i бiосинтезу. Максимальнi швидкостi росту та бiосинтезу виявляються на перших стадiях розвитку культур. Глюкоза, крохмаль, iнулiн, сахароза та мальтоза добре використуються штамами для синтезу молокозсiдального фермента. Доцiльно використовувати пiдвищення концентрації цукрiв у 2 рази у порiвняннi зi стандартним глюкозо-пептонним середовищем, що збiльшує вихiд молокозсiдального ферменту в 5 разiв та пiдвищує його активнiсть.
5. H. laricinus здатний використовувати для росту мiцелiю усi дослiдженнi джерела азоту, але нiтрат калiю та натрiю, а також ацетат амонiю цiлком iнгiбують синтез молокозсiдального фермента. На середовищах з амiнокислотами, NH4NO3, CH4NO2, (NH4)2SO4 рiвень МЗА нижчий, нiж на середовищi з пептоном у 5-27 разiв. Для активного синтезу молокозсiдальних протеїназ H. laricinus необхiдна наявнiсть у середовищi культивування бiлкового азоту.
6. Пiдвищена кiлькiсть екстракту росткiв картоплi у живильному середовищi iнгiбує як ростовi процеси, так i синтез фермента. Екстракт росткiв картоплi стимулює МЗА тiльки на перших eтапах росту культури.Соєве борошно у концентрації 0,5-1,0% прискорює рiст та збiльшує МЗА H. laricinus. Додавання гiберелiну у середовище у кiлькостi 4 мг/л збiльшує активнiсть молокозсiдального фермента в 2-2,5 разiв. Внесення ауксину в середовище культивування у кiлькостi 4 мг/л дозволяє отримати бiльш високий вихiд бiомаси продуценту.
7. Введення молочної сироватки у середовище культивування викликає пiдвищення швидкостi росту та продукування молокозсiдального ферменту, а також збiльшення тривалостi експоненцiйної фази росту продуценту.
8. Використання методiв математичного планування дозволило докладно вивчити характер залежностi МЗА i росту Н. Laricinus вiд концентрації молочної сироватки та пивного сусла. Розрахованi функції дають змогу прогнозувати поведiнку продуценту в будь-якiй точцi простору, який обмежений рiвнями факторiв.
9. Вiк посiвного мiцелiю не вiдбивається на рiвнi МЗА Н.laricinus.

Головнi публикації за темою дисертації :

1. Никитина О. А. Влияние рН среды на накопление молокосвертывающего фермента штаммами Hirschioporus laricinus // Мiкробiологiчний журнал. - 1998. - №4.- С. 43-48.
2. Никитина О.А. Влияние фитогормонов на молокосвертывающую активность и рост Hirschioporus laricinus. // Весник Донецкого университета. - 1998. - №1. - С.141-144.
3. Никитина О.А. Влияние рН на кинетику синтеза молокосвертывающих ферментов штаммов Hirschioporus laricinus // Вестник проблем биологии и медицины. - Полтава-Харьков, 1998. - №11. - С. 18-25.
4. Никитина О.А., Бойко М. И., Негруцкий С.Ф. Роль источников азота для культивирования штамма А-031 Hirschioporus laricinus // Вестник проблем биологии и медицины. - Полтава-Харьков, 1998. - №11. - С. 26-33.
5. Пат. 96031179. Україна. МПК 5 С 12 N 1/38. Живильне середовище для вирощування штаму М-81 Hirschioporus laricinus - продуценту молокозвертаючого ферменту / Бойко М. I., Негруцький С. Ф., Федотов О. В., Нiкiтiна О. О. ( Україна ).- 1 с. Заявл. 27.03.96; Опубл. 06.02.97. - 2 с.
6. Пат. 97073489. Україна. МПК С 12 N 1/38, 9/14. Живильне середовище для росту штаму М-81 Hirschioporus laricinus - продуценту молокозсiдального ферменту / Нiкiтiна О. О., Бойко М. I., Негруцький С. Ф. ( Україна ). - 1 с. Заявл. 2.07.97; Опубл. 10.06.98. - 2 с.
7. Борисенко О. А. (Никитина), Негруцкий С. Ф., Бойко М. И. Влияние различных доз молочной сыворотки на рост и продуцирование молокосвертывающего фермента Hirschioporus laricinus // Устойчивость растений к стрессовым явлениям. ДонДУ; Донецк,1995. - С.168-173. Деп. в ГНТБ 18.12.95, №21 - Ук 96.
8. Никитина О. А. Динамика, кинетика роста и синтеза молокосвертывающего фермента Hirschioporus laricinus // Мат. I Международной конференции: Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологочески активных соединений и пищевых продуктов. - Донецк, 1997. - С.34-37.
9. Никитина О.А. Влияние режимов стерилизации на молокосвертывающую активность Hirschioporus laricinus // Мат. Х съезда Украинского ботанического общества. - Полтава,1997. - С. 98.
10. Никитина О. А. Аминокислоты, как источник азота для культвирования Hirschioporus laricinus - продуцента молокосвертывающего фермента // Мат. вуз. научн. конф. профессорско-преподавательского состава по итогам научноисследовательской работы. - Донецк: ДонГУ, 1997. - С.79-82.
11. Никитина О. А. Влияние критических температур на выход молокосвертывающего фермента у Hirschioporus laricinus // Тез. докл VI Конф. молодых ученых: Актуальние проблемы физиологии растенийи генетики. - Киев, 1996. - С.122-124.

Нiкiтiна О.О. Регуляцiя активностi екзопротеїназ молокозсiдальної дії штамiв Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. - Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.04 - бiохiмiя. - Київський унiверситет iменi Тараса Шевченка, Київ, 1999.

Дисертацiя присвячена дослiдженню впливу рiзних фiзiологiчних факторiв: температури та способу культивування, кислотностi середовища, вуглецевого та азотного живлення, а також бiологiчних додаткiв на молокозсiдальну активнiсть та накопичення бiомаси штамами Hirschioporus laricinus М-81, А-031, А-032 i Р-323 - продуцентами молокозсiдальних протеїназ. В дисертації дослiджено понад 120 живильних середовищ. Вивчено динамiку та кiнетику синтезу молокозсiдальних протеїназ на цих середовищах. Шляхом пiдбору концентрацiй цукрiв досягнуто збiльшення виходу молокозсiдального фермента в 5 разiв. Дослiджено характер залежностi молокозсiдальної активноcтi та росту гриба вiд концентрації молочної сироватки та пивного сусла - дешевих та доступних складових живильного середовища, завдяки чому було пiдiбрано оптимальне середовище культивування. Дано рекомендації щодо промислового культивування штамiв H. laricinus. За основними результатами працi одержано патент на винахiд та двi прiоритетнi довiдки.

Ключовi слова: сичужнi ферменти, складовi середовища, оптимiзацiя, по-

верхня вiдгуку, молокозсiдальна активнiсть

Никитина О. А. Регуляция активности экзопротеиназ молокосвертывающего действия штаммов Hirschioporus laricinus ( Karst. ) Ryv. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 04 - биохимия. - Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1999.

Диссертация посвящена вопросам исследования влияния различных физиологических и биохимических факторов: температуры и способа культивирования, кислотности среды, углеродного и азотного питания, а также биологических добавок на молокосвертывающую активность и накопление биомассы штаммами Hirschioporus laricinus М-81, А-031, А-032 и Р-323 . H. laricinus - новый перспективный продуцент молокосвертывающих протеиназ, которые могут использоваться в производстве сыров как заменители сычужного фермента. Получение ценных грибных метаболитов связано с оптимизацией условий культивирования в условиях искусственных культур и является одной из основных задач, требующих решения. В работе исследовано более 120 питательных сред. Изучена динамика и кинетика синтеза молокосвертывающих протеиназ на этих средах. Выяснено, что штаммы H. laricinus способны регулировать рН среды культивирования, оптимальные значения кислотности для накопления биомассы и продуцирования молокосвертывающего фермента не совпадают. Изменение температуры в пределах от 280С до 320С не сказывается на характере синтеза молокосвертывающего фермента и росте H.laricinus. Сравнительное изучение ферментативной активности продуцента в условия глубинного и поверхостного культивирования показывает, что в разные сроки культивирования перемешивание по-разному сказывается на молокосвертывающей активности, при комнатной температуре лучше использовать культивирование глубинным способом. Исследования роли различных углеводов показали, что подбором источника углеродного питания штаммов H.laricinus можно регулировать сопряженность процессов роста и молокосвертывающей активности, как в сторону увеличения активности молокосвертывающего фермента так и в сторону увеличения скорости роста продуцента. Путем подбора концентраций сахаров достигнуто увеличение выхода молокосвертывающего фермента в 5 раз. При изучении роли источников азотного питания (NH4NO3, (NH2)2CO, (NH4)2SO4, CH3COONH4, NaNO3, KNO3, пептона и 10-ти аминокислот: DL-триптофан, DL-фенилаланин, DL-лизинмоногидрохлорид, DL-лейцин, DL-метионин, L-изолейцин, L-гистидингидрохлорид, DL-валин, L-аргинингидрохлорид, DL-треонин ) выяснено, что H. laricinus использует для роста мицелия все исследованные источники органического и неорганического азота, но для активного синтеза молокосвертивающих протеиназ необходимо наличие в среде культивирования белкового азота, который среди всех изученных веществ содержится только в пептоне. Введение молочной сыворотки в культуральную среду H. laricinus вызывает повышение скорости роста и продуцирования молокосвертывающего фермента, а также увеличение длительности экспоненциальной фазы роста. При использовании методов математического планирования детально изучен характер зависимости молокосвертывающей активности и биомассы продуцента от концентрации молочной сыворотки и пивного сусла - дешевых и доступных компонентов питательной среды. Вычисленные функции позволяют прогнозировать поведение продуцента в любой точке пространства, ограниченного уровнями факторов. Введение гиббереллина в среду культивирования H.laricinus стимулирует образование молокосвертывающего фермента. Добавление ауксина на ранних стадиях культивирования подавляет синтез молокосвертывающего фермента и биомассы. Даны рекомендации для промышленного культивирования штаммов H. laricinus. По результатам работы получен патент на изобретение и две приоритетные справки на изобретение.

Ключевые слова: сычужные ферменты, компоненты среды, оптимизация, поверхность отклика, молокосвертывающая активность

Nikitina O. A. Regulation of the activity of milk coagulating exoproteases of Hirschioporus laricinus ( Karst.) Ryv. cultures. - Manuscript.

The thesis of Candidate of sciences ( Biology) on speciality 03.00.04. - biochemistry. - Kyiv state University named after Taras Shevchenko, Kyiv, 1999.

The thesis is devoted to the problems of different physiological factors - temperature and means of cultivation, the acidity of the medium, carbon and nitrogen nutrition and also some biological additions - influencing milk coagulating activity and the accumulation of biomass by M-81, A-031, A-032 and P-323 Hirschioporus laricinus - the producents of milk coagulating proteases. There have been investigated more then 120 nutrition mediums in the present paper. The 5 times increasing of milk coagulating ferment′s output is achieved by means of sugars′ concentrations′ selection.

The character of dependence of milk coagulating activity and grows on milk serum′s and beer wort - cheap and easy-of-access components of nutrition medium is investigated in detail; on the basis of this the optimal cultivation medium was selected. Some recommendation concerning industrial cultivation of Hirschioporus laricinus cultures are given. As a result of the work carried out the invention patent and 2 priority certificates of invention are obtained.

Key words: rennet ferments, medium components, optimization, response surface, milk coagulating activity