Таблиця 7 - Результати дозрівання, запліднення і дроблення in vitro ооцитів овець
Капацитацію розмороженої сперми барана породи саффолк польської селекції проводили упродовж 30 хв у розчині TALP (Parish J.J. et al, 1988), запліднення дозрілих in vitro ооцитів у середовищі ДМЕМ з додаванням 5,0 мкг/мл гепарину і 5 мМ /мл кофеїну (Fert-TALP) капацитованою спермою у концентрації 1 млн/мл упродовж 18 годин. Презумптивні зиготи переносили у модифіковане ДМЕМ для мітотичного дроблення і подальшого розвитку. Через 24 і 48 годин культивування стадію розвитку зигот визначали підрахунком в них кількості бластомерів: 14 зигот (63,6%) розпочали дроблення і через 48 годин знаходилися на ранніх стадіях розвитку з утворенням макро- і мікробластомерів, з них 13 зигот розвинулися до стадії 8-16-ти бластомерного ембріона, 1 зупинився на 4-6-бластомерній стадії.
Хірургічна трансплантація 3-х ранніх ембріонів одержаних in vitro вівці-реципієнту, яка раніше була використана як донор ооцитів при їх лапараскопічному одержанні, закінчилася на 171-й день народженням ягнички живою масою 5420 г за кличкою Діана. Різниця в тривалості пренатального періоду її розвитку у порівнянні з ягнятами - напівсібсами становила 21 день. Однак, це не вплинуло на живу масу Діани при народженні. Цей феномен можна пояснити збільшенням тривалості доімплантаційного розвитку ембріонів одержаних in vitro, оскільки після трансплантації реципієнту вони потребують додаткового часу для компенсації необхідної клітинної маси внаслідок певної кількості циклів мітотичного дроблення, що віддаляє імплантацію і таким чином, очевидно, збільшує загальний термін вагітності реципієнтів. Це опосередковано підтверджує попередні дані S.Iwasaki et al (1990), T.H.Thompson et al (1995), В.Е.Щербак (1997) про достовірно меншу питому масу ембріонів одержаних поза організмом.
ВИСНОВКИ
У дисертації теоретично узагальнено сучасне вирішення наукового завдання використання біотехнологічних методів, що сприяють одержанню нових даних щодо вивчення закономірностей та видових особливостей оо- і ембріогенезу тварин за умов розвитку in vivo і in vitro, дозволяють зберегти цінний ембріональний матеріал, підвищують потенціал плідності самиць. Експериментально вивчено механізми клітинної регуляції, які проявляються у компенсації ембріонами клітинних втрат, відновленні мітотичного дроблення, стимуляції процесів дозрівання ооцитів. Обґрунтована можливість створення in vitro таких умов, які були б максимально наближені до специфічного маткового середовища на ранніх стадіях ембріогенезу.
1. Застосований нами у норок метод визначення якості сперміїв за інтенсивністю їх дихання дозволяє внести корекцію в оцінку самців основного стада. Сперма активністю 7-9 балів знебарвлюється упродовж 15-20 хв, 5-6 балів – 25-30 хв, нижче 5 балів – через 40-45 хв.
2. Встановлено закономірності і видові особливості раннього ембріонального розвитку хутрових тварин, що полягає у наступному:
- початок латентного періоду ембріональної діапаузи у норок спостерігається на 8-й день після запліднення, а не на 9-й, як це вважалося раніше, що свідчить про прискорення темпів ембріонального дроблення і супроводжується змінами в характері зчеплення бластомерів реекспандованих бластоцист;
- біологічний годинник мітотичного дроблення ембріональних бластомерів у песців складає 16-20 годин. Згідно розробленої схеми, на 12-й день після осіменіння самиць песців можна очікувати формування ранньої 32-бластомерної морули, а на 14-й день – експандованої бластоцисти, що вносить елемент новизни у вивчення видових особливостей їх раннього ембріонального розвитку;
- існує суттєва різниця в темпах доімплантаційного розвитку норок і песців: для норок характерна ембріональна діапауза зі специфічними морфологічними ознаками в будові реекспандованої бластоцисти; ембріонам песців притаманний динамічний розвиток. На основі цього розроблена шкала морфологічної оцінки доімплантаційних ембріонів норок, яка дозволяє здійснити селекцію зародків за стадіями розвитку;
- висунуто і експериментально доведено концепцію внутрішніх причин ранньої ембріональної смертності хутрових тварин, яка базується на принципах біологічного “старіння” ооцитів норок і сперміїв песців.
3. Комплексний гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок“ (ДП № 44006А. 7 А01К676/02.-авт. В.Ю.Шавкун, О.Б.Андрушко) у загальній дозі 24 ІО ГСЖК за розробленою схемою може бути застосований для стимуляції овуляції у норок, що сприяє спаровуванню самиць в кінці періоду гону, створює оптимальні умови в матці для розвитку ембріонів за рахунок збільшення кількості крипт, наповнення їх матковим секретом і призводить до імплантації зародків у неплідних самиць та народження 2,5 нащадків на гніздо.
4. Інтенсивність секреції специфічних білків репродуктивними органами норок знаходиться у прямому зв‘язку з кількістю ембріонів та стадією їх розвитку: на 5-8-й дні після запліднення білковий спектр яйцепроводів самиць насиченіший, ніж тканин матки; на 9-й – навпаки, що пов‘язано з функціональністю цього органа в латентний період ембріональної діапаузи. Одночасний розвиток значної кількості ембріонів з їх первинною диференціацією супроводжується в яйцепроводах присутністю групи низькомолекулярних білків (7-10 кДа та 16-24 кДа), що характерна для специфічних поліпепетидів та ростових факторів, які беруть участь в процесах ембріогенезу і володіють мітогенною дією. Початок латеного періоду у норок співпадає з наявністю специфічного білка з Мм 33-35 кДа. Кількість нейтральних ліпідів та холестерину у репродуктивних органах самиць норок на ранній стадії вагітності може визначати їх багатоплідність.
5. Ранні зародки норок володіють механізмом регуляції перерозподілу примордіальних зародкових клітин і здатні компенсувати свій розвиток in vivo після мікрохірургічного втручання і агрегації недиференційованих бластомерів синхронного і асинхронного (в межах 3-х мітотичних дроблень) розвитку з приживленням химерних ембріонів 16,7% і 37,5% відповідно.
6. Оптимальні параметри неушкоджуючого електростимулюючого впливу на химерні ембріони корів, що одержані мікроін‘єкцією групи бластомерів розморожених морул у нативні бластоцисти, знаходяться в межах 15-20 В з 2-4 - разовим імпульсом експозицією 100-150 мкс. За цих умов досягається внутрішньозональна адгезія мембран чужорідних бластомерів без їх теплового пошкодження з життєздатністю і приживленням химерних ембріонів у телиць-реципієнтів.
7. Застосування культур клітин ембріонального і маткового походження доцільно для підтримки розвитку поділених навпіл ембріонів корів, зокрема для збільшення кількості трансферабельних ембріонів 2-ої генерації або для одержання ембріональних клонів за рахунок бісекції попередньо культивованих in vitro половинок. Цей прийом забезпечує 18,8% приживлення чверток розморожених морул корів, що в перерахунку на половинку розмороженого ембріона становить 37,6%, а на цілий ембріон- 75,2%, значно підвищує ефективність методу трансплантації та забезпечує одержання ембріональних клонів і груп ідентичних тварин.
8. Мікроманіпуляції з ембріонами, довготривале культивування in vitro та взаємодія цих факторів в цілому дестабілізуюче впливають на життєздатність і подальший розвиток in vitro половинок розморожених морул. Проте, їх морфологічну якість можна підвищити культивуванням з епітеліальними клітинами маткового походження, що в 1,9 рази підвищує їх життєздатність упродовж 24 годин, у 3,3 рази через 48 годин і в 6 разів через 72 годин (27,3% половинок ембріонів лишаються морфологічно якісними).
9. Висока інтенсивність утворення і одночасного дозрівання декількох фолікулів у хутрових тварин забезпечується періодичною функціональною активністю яєчників. Ступінь фолікулярного дозрівання, розмір і морфологія ооцитів норок, песців і шиншил можуть бути тестом їх здатності до подальшого розвитку in vitro. Культивування у середовищі з додаванням ФСГ, естрадіолу -17β та преднізолону стимулює експансію клітин кумулюсу у 80-85% ооцитів і в окремих випадках сприяє розшаровуванню з‘єднань між клітинами променистого вінця і цитоплазматичною мембраною ооцита.
10. Додавання до культурального середовища ФСГ, естрадіолу-17в, преднізолону у малих дозах (0,2-0,6 мкг/мл) забезпечує одержання моношару епітеліальних клітин яйцепроводів і ендометрію та пов‘язано з активуванням ендокринного механізму регуляції клітинної проліферації. Ізольовані клітини епітелію яйцепроводів реагують на підвищення концентрації гормонів у середовищі збільшенням щільності клітинної популяції у 5 –5,5 разів з 2,0 - 2,5 млн. до 13,2 ± 0,57 (р<0,001); 14,02 ± 0,85 (p<0,01) та 12,41 ± 0,33 (p<0,001) млн. клітин в 1 мл, а клітини ендометрію - у 3 рази, з 1,8 – 1,9 млн. до 5,94 ± 0,52 (р<0,01) та 8,34 ± 0,37 млн. клітин в 1 мл. Підвищенння концентрації гормонів ФСГ до 12 мкг/мл, естрадіолу-17β - 4 мкг/мл, преднізолону - 0,6 мкг/мл веде до затримки процесів мітотичного дроблення клітин ендометрію.
11. Первинна культура фідерних клітин маткового походження стимулює процеси дозрівання in vitro ооцитів корів, а ооцит-кумулюсні комплекси можуть бути тест- системами функціональної активності фідерних культур. Ко-культивування з фідерними клітинами під впливом ФСГ, естрадіолу-17β і преднізолону підвищує кількість морфологічно якісних ооцитів корів до 83,3% (р<0,05) і 86,7% (р<0,001) на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів і 53,3% і 63,3% на моношарі клітин ендометрію.
12. Додавання до культурального середовища 20 мкг/мл інсуліну та 10 нг/мл епідермального ростового фактору прискорює процес вирощування фідерного клітинного субстрату і дозрівання ооцитів. Щільність клітинної популяції епітеліальних клітин яйцепроводів під дією інсуліну і ЕФР через 24 години збільшується у 2,8 рази, а після пере посіву - у 4,2 рази. Це дозволяє одержувати 86,7% морфологічно якісних ооцитів під дією інсуліну, 66,7% при культивуванні з ЕФР, а за умов сумісної дії чинників – 93,3%, проти 53,3% у контролі.
13. Застосування модифікованого “Середовища для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro” забезпечує дозрівання 86,7% ооцитів корів і 81,5% ооцитів овець.
14. Удосконалено технологію запліднення in vitro ооцитів овець, яка гарантує 63,6% дроблення запліднених яйцеклітин овець та одержання життєздатного молодняку.
ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ
1. Видані методичні рекомендації “Інтенсифікація хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів відтворення”, які можуть бути використані у науковій роботі і у практиці звірівництва та в навчальному процесі у ВУЗах.
2. Рекомендується одержувати ембріони норок доімплантаційних стадій для культивування і ембріобіотехнологічних досліджень до 8-го дня розвитку, оскільки в зародках старшого віку розпочинається період ембріональної діапаузи, а ембріони песців – на 12-14–й дні, коли ембріони досягають компактних стадій.
3. Використовувати комплексний гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок” для стимуляції овуляції у самиць норок з відсутністю природного гону шляхом 3-разової ін‘єкції його через 1 добу в загальній кількості 24 ІО ГСЖК, що також сприяє створенню оптимальних умов в матці для розвитку ембріонів, призводить до народження нащадків у неплідних норок.
4. Рекомендується з метою одержання ідентичних близнюків від високопродуктивних корів застосовувати метод проміжного культивування половинок ембріонів з наступним поділом їх на чвертки. Для стимуляції ембріонального розвитку розморожених ембріонів зі зменшеною клітинною масою обґрунтовано використання попередньо культивованих трофобластичних везикулів з 9-10-ти денних розморожених бластоцист у співвідношенні 4 трофобластичні фрагменти на 1 половинку ембріона або клітин ендометрію корів з розрахунку 100 мкл клітинної суспензії на 3-4 половинки в 1 мл культурального середовища.
5. Обґрунтовано використання фідерних моношарів епітеліальних клітин яйцепроводів у in vitro- та клон-технологіях для стимуляції процесів оогенезу і одержання трансферабельних ембріональних клонів тварин.
6. Рекомендується використовувати ”Середовище для дозрівання ооцитів in vitro корів та овець” (ДП №52177А. - МКИ UA 7 А61D19/04. -№2002031913), яке забезпечує одержання ембріонів жуйних з метою інтенсивного відтворення поголів’я за технологією in vitro та відпрацювання окремих етапів клон-технологій.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Монографії
1. Буркат В.П., Влізло В.В., Кравців Р.Й., Шаловило С.Г., Мадіч А.В., Шаран М.М., Пасіцький М.Д., Гамота А.А., Мадісон Л.В., Мадісон В.В., Яремчук І.М., Дудчак В.О. Довідник з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби //Львів. –2004. –150с.
Брошури
2. Мадіч А.В. Інтенсифікація хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів відтворення. Методичні рекомендації //Інститут біології тварин, Львів. –2003. –30с.
Статті у наукових фахових виданнях
3. Мадіч А.В. Культивування та мікроманіпуляції з відтаяними ембріонами корів. //Тваринництво України. –1998. -№3. -С.12-13.
4. Мадіч А.В. Стимуляция раннего эмбрионального развития. //Молочное и мясное скотоводство. –1998. -№2. -С.21-23.
5. Мадич А.В. Применение эффекта электрошока для возобновления межклеточных соединений в химерных эмбрионах коров. //Зоотехния. –1998. -№7. -С.28-29.
6. Мадіч А.В. Доімплантаційний розвиток ранніх ембріонів норок. //Вісник Аграрної науки. –1999. -№1. -С.51-53.
7. Мадіч А.В. Цитологічна і морфологічна характеристика ембріонів норок. //Розведення і генетика тварин. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. –Київ: Аграрна наука. –1999. -№31. -С.147-148.
8. Мадіч А.В. Морфологічна якість фолікулярних та яйцепровідних ооцитів песця. //Науково-технічний бюлетень Інституту землеробства і біології тварин УААН: Серія “Фізіологія і біохімія”, Львів. –1999. -Вип.1 (3). -С.223-226.
9. Мадіч А.В. Особливості преімплантаційного ембріогенезу песців. // Розведення і генетика тварин. Міжвідомчий тематичний наук. збірник. – Київ: Аграрна наука. –2000. -№33. -С.70-76.
10. Madich A.V. Forming of embryo-uterine signal in mink at early embryogenesis. //Біологія тварин. –2002. –Т.4. -№1-2. –С.228-235.
11. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Ідентичні близнюки як додатковий фактор підвищення плодючості. //Тваринництво України.-1992. -№2. -С.24-26. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку).
12. Шаловило С.Г., Мадіч А.В., Бец М.Й., Шаран М.М. Біотехнологія відтворення у скотарстві. //Сільські обрії. –1997. - №10-12. – С.35 (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку).
13. Мадіч А. В., Саєнко І.М., Шаловило Л. Є. Розвиток половинок мишачих ембріонів отриманих поділом на мікроманіпуляторі та вручну. //Розведення і генетика тварин: Міжвідомчий тематичний наук. збірник. Київ: Аграрна наука. –1998. -№30. - С.116-119. (Дисертант розробив схему і провів ряд досліджень, узагальнив результати, оформив роботу до друку).
14. Мадіч А.В., Федько М.В. Отримання здорового молодняка норки при застосуванні деяких біотехнологічних прийомів. //Вісник Білоцерківського ДАУ, Біла Церква. -1998. –В.5. –Ч.2. -С.53-55. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів дослідження, підготував роботу до друку).
15. Мадіч А.В., Шаран М.М., Ігліцький І.І. Особливості хірургії у норок. //Ветеринарна медицина України. –1998. –№11-12. -С.40. (Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експерименту, підготував роботу до друку).
16. Шичкін В.П., Мадіч А.В. Застосування новітніх біотехнологій у тваринництві. //Сільські обрії. –1998. -№3. –С.23-24. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку).
17. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Перші результати трансплантації ембріонів норок в Україні. //Розведення і генетика тварин. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. – Київ: Аграрна наука. –1999. -№32. -С.149-150. (Дисертант теоретично обґрунтував схему досліду, провів морфологічні дослідження, узагальнив результати, оформив роботу до друку).
18. Мадіч А.В., Ігліцкий І.І., Шаловило С.Г., Шаловило Л.Є., Дєдова А.І. Експериментальні химери у норок. //Науковий вісник НАУ. Збірник наукових праць, Київ: Національний аграрний університет. - 1999. – Вип.16. – С.121-124. (Дисертант особисто провів експериментальні дослідження з агрегації ембріонів, підготував роботу до друку).
19. Мадіч А.В., Шаловило С.Г. Соціальні проблеми ембріонального клонування. //Тваринництво України. -2000. -№ 3-4. –С.12-14. (Дисертант розробив концепцію, провів теоретичний аналіз досліджень, оформив роботу до друку).
20. Шичкін В.П., Мадіч А.В. Використання та можливості застосування гібридних клітин у репродуктивній біотехнології. //Вісник Полтавського державного сільськогосподарського інституту, Полтава. -2001.-№2-3. –С.10-11. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, підготував роботу до друку).
21. Мадіч А.В., Гевкан І.І., Чорненький Т.Я., Сливчук Ю.І., Шаловило Л.Є., Ільницька О.М. Використання методу in vitro запліднення ооцитів овець та перші практичні результати трансплантації зигот. //Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин, Львів. –2001. –Вип.1-2. –С.273-276. (Дисертант розробив схему і особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготовив роботу до друку).
22. Мадіч А., Сливчук Ю., Чорненький Т., Гевкан І., Шаран М., Муравський М. Вона називається Діана. Одержання життєздатного молодняку від хірургічної трансплантації отриманих in vitro ембріонів овець. //Тваринництво України. –2002. -№10. –С.12-14. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготував роботу до друку).
23. Мадіч А.В., Яремчук І.М. Життєздатність та компетенція до подальшого розвитку вітрифікованих ооцитів норок. //Вісник Сумського національного аграрного університету: Серія Тваринництво, Суми. –2002. –Вип.6. –С.426-430. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготував роботу до друку).
24. Андрушко О.Б., Мадіч А.В., Шаловило С.Г. Удосконалення методики капацитації сперміїв та запліднення яйцеклітин в умовах in vitro. //Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. –Львів. –2002. –Вип.4.–№1. –С.19-24. (Дисертант брав участь у підготовці і проведенні експерименту, оформленні роботи до друку).
25. Мадіч А.В., Андрушко О.Б., Шаловило С.Г., Гевкан І.І.. Розгоні І.І.. Шавкун В.Ю. Гормональна стимуляція репродуктивної функції у норок //Біологія тварин. –2003. –Т.5. -№1-2. –С.320-329. (Дисертант особисто планував і проводив дослідження, узагальнив результати, підготував роботу до друку).
26. Федорова С.В., Мадіч А.В. Вплив інсуліну та епідермального фактора росту на проліферацію культури фідерних клітин та дозрівання ооцитів корів in vitro //Науково- технічний бюлетень Інституту тваринництва, Харків. –2003. -№85. –С.123-126. (Дисертант розробив схему досліджень, визначав концентрацію клітин, провів статистичну обробку даних та узагальнення результатів).
27. Ігліцький І.І., Дудчак І.П., Надопта (Мадіч) А.В. Хірургічна пересадка ранніх ембріонів у норок //Сільський господар. –2003. -№5-6. –С.20. (Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експерименту, особисто виконав хірургічну трансплантацію ембріонів норок).
Патенти
28. Деклараційний патент на винахід 52177 А Україна, МКИ UA 7 А61D19/04. Середовище для дозрівання in vitro ооцитів корів та овець. І.І. Гевкан, А.В. Мадіч, Т.Я. Чорненький, І.І. Розгоні (Україна); Держ. Деп. Інтел. Власності. -№2002031913; Заявл. 07.03.02; Опубл. 16.12.02; Бюл. №12. –3с.
Статті у наукових журналах і збірниках
29. Мадіч А.В. Ооцит - кумулюсні комплекси корів як тест-системи функціональної активності фідерних клітин. //Вісник Львівського університету. Серія Біологічна. –2003. –Вип..32. –С.186-194.
30. Мадіч А.В. Додатковий метод визначення якості сперми самців норок. //Аграрна наука – виробництву. Науково-інформаційний бюлетень завершених наукових розробок. –Київ: Аграрна наука. –2001. –№1. –С.19.
31. Мадіч А.В., Ігліцький І.І., Гамота А.А. Метод загальної анестезії норок і песців. //Аграрна наука – виробництву. Науково-інформаційний бюлетень завершених наукових розробок. – Київ: Аграрна наука. -2001. -№-3. -С.21. (Дисертант брав участь у розробці методу, оформив роботу до друку).
Тези конференцій і симпозіумів
32. Мадіч А.В. Методичні підходи для одержання химерних ембріонів корів інєкційним способом. //”Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва”. Збірник матеріалів наук.-практ. конференції, Львів: ЛАВМ ім. С.З. Гжицького. –1997. -С. 521-523.
33. Мадіч А.В. Можливість застосування культури трофобластичних кластерів для підвищення життєздатності поділених морул. //“Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин”. Матеріали міжнародної наук.-вир. конференції; Київ, Асканія-Нова: УААН. –1997. -С.51-52.
34. Madich A. Chinchilla laniqer: aspiration of ripened preovulatory follicles and morphology of oocytes. //“Animal Sciences in the XXI century”. Proc. of 1-st Polish –Ukrainian Scientific Conference. –Poland, Krakow. –2001. –P.121-123.
35. Мадіч А.В., Саєнко І.М. Вивчення впливу мікрохірургії на цитоструктуру ранніх ембріоннів мишок. //“Біотехнологія в розведенні і відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин”. Матеріали наук.–практ. конф., Харків. –1993. -С.132-133.
36. Саенко И.Н., Мадич А.В. Сравнительная характеристика приспособлений для разделения ембрионов. //“Біотехнологія в розведенні і відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин”. Матеріали наук.–практ. конф, Харків.– 1993. -С.131.
37. Мадіч А.В., Саєнко І.М. Порівняльна характеристика техніки створення агрегаційних та інєкційних химер від ембріонів різних порід ВРХ. //“Біотехнологія в розведенні і відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин”. Матеріали наук.–практ. конференції, Харків. –1993. -С.134.
38. Саєнко І.М. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Порівняльна характеристика розвитку in vitro половинок мишачих ембріонів, одержаних різними методами бісекції. //”Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва”. Збірник матеріалів наук.-практ. конференції, Львів: ЛАВМ ім. С.З.Гжицького. –1997. -С.385-387.
39. Мадіч А.В. Саєнко І.М., Шаловило Л.Є. Оцінка розвитку поділених ембріонів корів з використанням культуральної системи in vitro. //“Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин”. Матеріали міжнародної наук.-вир. конференції; Київ, Асканія-Нова: УААН. –1997. -С.53-54.
40. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Визначення якості сперми самців норок за інтенсивністю її дихання. //”Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико –селекційних дослідженнях”. Збірник матеріалів 2-ї Міжнародної конференції, Одеса. –Київ: Аграрна наука. –1998. -С.118-119.
41. Мадич А.В., Гамота А.А. Использование кетамина и ксилазина в эмбриогенетических экспериментах на норках и песцах. //”Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин”. Збірник матеріалів 4-ої міжнародної наук. – практ. конференції, Київ. –1999. -С.70-74.
42. Madich A., Hevkan I., Chornenky T., Slyvchuk Yu. Effect of Various Hormonal Preparations on proliferation and Functional Activity of Feeder Cells. //“Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals And Their Target Enzymes”. Proc. of 4-th Parnas Conference –Poland: Wroclaw. – September, 2002. –P.65.
43. Мадіч А.В., Гевкан І.І.. Чорненький Т.Я., Сливчук Ю.І. Вплив фолікотропіна, естрадіола та преднізолона на проліферативний ріст та функціональну активність фідерних клітин. //Мат. міжн. конф. присвяч. пам‘яті проф. Шостаковської І.В. –Львів. –2002. –С.102.
АНОТАЦІЯ
Мадіч А.В. Ранній ембріональний розвиток тварин in vivo і in vitro та біотехнологічні фактори його регуляції.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20.- біотехнологія. – Білоцерківський державний аграрний університет, Біла Церква, 2004.
Дисертацію присвячено питанням стимуляції раннього ембріонального розвитку тварин in vivo і in vitro та підвищення ефективності ембріобіотехнологічних методів для розуміння механізмів дозрівання, запліднення ооцитів, розвитку химерних ембріональних конструкцій і трансферабельних ембріонів тварин з групи бластомерів. Це наукове завдання вирішене шляхом теоретичного і практичного обґрунтування можливості створення in vitro таких умов, які були б максимально наближені до специфічного маткового середовища на ранніх стадіях ембріогенезу, і використання таких факторів, складників, середовищ, які здатні стимулювати ооцитарний і ембріональний розвиток. Розроблено і запропоновано морфологічну шкалу оцінки доімплантаційних ембріонів та спосіб гормональної корекції відтворної функції норок, досліджено закономірності і видові особливості ембріонального розвитку норок і песців. Удосконалено методи одержання химерних конструкцій з ембріонів синхронних і асинхронних стадій у норок із застосуванням електростимуляції агрегації мембран чужорідних бластомерів у корів. Удосконалений і дістав подальший розвиток метод мікроманіпуляцій для одержання чверток деконсервованих морул і нащадків після їх трансплантації. Розроблено і експериментально перевірено “Середовище для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro”, яке забезпечує одержання дозрілих, здатних до запліднення in vitro ооцитів тварин. Ефективність запропонованого середовища підтверджена одержанням ембріонів овець поза організмом та життєздатного приплоду від їх трансплантації.
Ключові слова: норки, песці, шиншили, корови, вівці, ооцити, ембріони, біотехнологічні методи, фідерні клітини, дозрівання in vitro.
АННОТАЦИЯ
Мадич А.В. Раннее эмбриональное развитие животных in vivo и in vitro и биотехнологические факторы его регуляции.- Рукопись.
Дисертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук за специальностью 03.00.20.- биотехнология. – Белоцерковский государственный аграрный университет, Белая Церковь, 2004.
Диссертация посвящена изучению вопросов стимуляции раннего эмбрионального развития животных in vivo и in vitro и повышению эффективности эмбриобиотехнологических методов для раскрытия механизмов дозревания, оплодотворения ооцитов, развития химерных эмбриональных конструкций и трансферабельных эмбрионов животных с группы бластомеров. Эта научная проблема решена благодаря теоретическому и практическому обоснованию возможности создания in vitro таких условий, которые были бы максимально приближены к специфической среде репродуктивных органов самок на ранних этапах эмбриогенеза и использования таких факторов, питательных сред и добавок, которые способны стимулировать ооцитарное и эмбриональное развитие.
Представлены новые данные о закономерностях и видовых особенностях доимплантационного развития пушных животных клеточного содержания, которые в связи з многоплодностью могут быть успешно использованы как модельные животные в различных биологических исследованиях. В частности установлено, что латентный период эмбриональной диапаузы у норок начинается на 8-й день после оплодотворения и сопровождается характерными изменениями в морфоструктуре реэкспандированных бластоцист, изучены механизмы первичной дифференциации бластомеров, разработана морфологическая шкала оценки эмбрионов норок доимплантационных стадий. Сформулирована и эспериментально доказана концепция внутренних причин ранней эмбриональной смертности пушных животных, которая основана на принципах биологического “старения” ооцитов норок и смермиев песцов.
Разработан способ гормональной коррекции овуляторной функции у норок комплексным гормонально-витаминным “Препаратом для стимуляции течки у свиноматок” в суммарной дозе 24 ИЕ ГСЖК по 3-дневной схеме, что позволяет увеличить число покрытых самок маточного стада и получить приплод от бесплодных норок в количестве 2,5 потомка на 1 гнездо. Установлено, что интенсивность секреции специфических белков репродуктивными органами норок находиться в прямой связи с количеством эмбрионов и стадией их развития. Одновременное развитие значительного числа эмбрионов и процесс их первичной дифференциации сопровождаются присутствием в яйцепроводах и матке низкомолекулярных белков с Мм в диапазоне 7-10 кДа и 16-24 кДа, начало латентного периода совпадает с наличием в них специфичного белка с Мм 33-35 кДа.
Впервые в Украине получен молодняк от трансплантации интактных и химерных эмбрионов норок, агрегированных с зародышей синхронных и асинхронных стадий (приживляемость 16,7% и 37,5% соответственно); установлены параметры электростимуляции внутризональной адгезии мембран чужеродных бластомеров в химерных эмбрионах коров, получены телята-мозаики. Усовершенствован и получил дальнейшее развитие метод микроманипуляций, рекомендуемый для получения эмбрионов 2-й генерации с половинок розмороженных морул коров, которые способны к воссозданию морфоструктуры и развитию in vivo после повторной микрохирургической бисекции на четвертинки благодаря ко-культивированию их с фидерными клетками эмбрионального (трофобласт) и маткового (ендометрий) происхождения. Этот прийом позволяет 27,3% половинкам деконсервированых эмбрионов коров оставаться жизнеспособными в культуре на протяжении 72 часов, обеспечивает 18,8% имплантации четвертинок и получение груп идентичных животных. Разработаны научно-обоснованные подходы к регуляции интесивности роста фидерных клеточных культур, которые связаны с активированием эндокринного механизма клеточной пролиферации. Это дало возможность получить клеточные популяции эпителия яйцепроводов коров, которые способны увеличивать свой пролиферативный рост в 5-5,5 раза от 2,0 - 2,5 млн. до 13,2±0,57 (р<0,001); 14,02 ±0,85 (p<0,01) и 12,41 ± 0,33 (p<0,001) млн. /мл; а клеток эндометрия в 3 раза от 1,8 – 1,9 млн. до 5,94±0,52 (р<0,01) и 8,34±0,37 млн. /мл. Установлено, что первичная культура фидерных клеток маткового происхождения стимулирует процеси дозревання in vitro ооцитов коров, которые в свою очередь могут быть тест-системами функциональной активности фидерных культур. Ко-культивирование ОКК коров с фидерными клетками под действием ФСГ, эстрадиола-17β и преднизолона повышает морфологическое качество и количество способных к оплодотворению ооцитов. В присутствии преднизолона, в концентрации 0,2-0,6 мкг/мл, 83,3% (р<0,05) и 86,7% (р<0,001) ооцитов на моношаре эпителиальных клеток яйцепроводов, а так же 53,3% и 63,3% ооцитов на моношаре клеток эндометрия коров приобретают закрытую сферу лучистого венца и отличаются высоким уровнем экспандации кумулюса за счет чего достигается их дозревание in vitro.
Разработана и експериментально проверена эффективная “Среда для дозревания ооцитов коров и овец in vitro ”, которая обеспечивает получение морфологически качественных, дозревших ооцитов, способных к оплодотворению и развитию в эмбрионы трансферабельных стадий. Научная новизна подтверджена решением о выдаче декларационного патента 52177А. Впервые в Украине получены эмбрионы овец от дозревания и оплодотворения ооцитов in vitro и здоровый приплод от трансплантации таких эмбрионов. Разработаные способы высокоэффективны и доступны для использования в селекции животных.
Ключевые слова: норки, песцы, шиншиллы, коровы, овцы, ооциты, эмбрионы, биотехнологические методы, фидерные клетки, дозревание in vitro.
ANNOTATION
Madich A.V. Early embryo development in vivo also in vitro and biotechnological factors for its regulation. – Manuscript. Thesis for a scientific degree the doctor of agricultural sciences to speciality 03.00.20. – biotechnology. – Bilotserkivskiy State Agricultural University, Bila Tserkva, 2004.
Thesis is devoted to the inssues of the stimulation for early embryo development in vivo also in vitro and to increase of the efficient embryo biotechnological methods for realizing of oocytes maturation and fertilization mechanisms, the development of chimeric embryo constructions and blastomeric groups to transferable embryos. The scientific problem decided by theoretic and practice basis about creation such conditions that will be maximum approach to specific uterum environment and elaboration the factors, ingredients, mediums that promote to stimulation of the oo- and embryogenesis. There was working out and proposed the morphological scale for evaluation preimplantation embryos and method of hormonal correct reproductive function in mink, was researching the regularities and species peculiarities embryo development in mink and polar fox. It had been improved the method for production of chimeric embryos from synchronic and asyncronic zygotes in mink and with electrostimulation in bovine. It had been improved and received further progress the method of micromanipulation for production quarters from thaw outed morulae and calves after their transfer. Worked and experimental examinated of medium for maturation oocytes bovine and sheep in vitro guarantees the receipt of maturated oocytes with ability to further fertilization in vitro. The effective of the medium was acknowledged by receipt of sheep embryos in vitro and viable offspring.
Key words: mink, polar fox, chinchilla, cows, sheep, oocytes, embryos, biotechnological methods, feeder cells, in vitro maturation.
__________________________________________________________________
Підписано до друку 15.03.2004 р. Формат 60х90/16.
Ум. друк. арк. 2,0. Обл.-вид. арк. 2,0.
Тираж 100. Зам.405.
Друк ПП “Нові перспективи”
Львів-2004
| 
