Коваленко О. П. Порівняльне вивчення просторової структури тРНКSer і тРНКLeu із Thermus thermophilus і ділянок їхнього контакту з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2003.
Дисертаційна робота присвячена дослідженню просторової структури прокаріотичних тРНКSer і тРНКLeu у розчині, а також ділянок контакту цих тРНК з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами, що важливо для вивчення структурних основ функціонування тРНК ІІ класу. В результаті проведеної роботи визначено нуклеотидні послідовності тРНКSer(GCU), тРНКSer(GGA) і тРНКLeu(CAG) із T.thermophilus. Методами хімічної модифікації встановлено фосфатні залишки і азотисті основи, що беруть участь у формуванні просторової структури цих тРНК. Показано різну орієнтацію довгої варіабельної гілки стосовно "тіла" молекули, а також відмінності в організації корових триплетних взаємодій в тРНКSer і тРНКLeu. Методом хімічної модифікації визначено ділянки контакту тРНКSer і тРНКLeu з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами. Показано, що серил-тРНК синтетаза взаємодіє з тРНКSer боку варіабельної гілки, яка є основною ділянкою контакту. Лейцил-тРНК синтетаза взаємодіє з тРНКLeu з боку D-гілки та утворює контакти з фосфатами нуклеотидів-учасників корових триплетних взаємодій, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей в побудові корових частин тРНКSer і тРНКLeu для впізнавання лейцил-тРНК синтетазою.
Ключові слова: тРНКSer, тРНКLeu, просторова структура, довга варіабельна гілка, корові триплетні взаємодії, РНК-білкові взаємодії, методи хімічної модифікації.
АННОТАЦИЯ
Коваленко О.П. Сравнительное изучение пространственной структуры тРНКSer и тРНКLeu из Thermus thermophilus и участков их взаимодействия с гомологичными аминоацил-тРНК синтетазами. - Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2003.
В диссертационной работе проведено исследование элементов пространственной структуры прокариотических тРНКSer и тРНКLeu в растворе, а также определены участки взаимодействия этих тРНК с гомологичными аминоацил-тРНК синтетазами, что имеет важное значение для определения структурных основ функционирования тРНК с длинной вариабельной петлёй.
В результате проведенной работы методом быстрого гель-секвенирования были определены нуклеотидные последовательности изоакцепторных тРНКSer(GCU) и тРНКSer(GGA), а также тРНКLeu(CAG) из бактерии - экстремального термофила T.thermophilus. Установлено, что в изоакцепторных тРНКSer нуклеотидные последовательности акцепторного стебля, Т- и D- веток совпадают, а в последовательностях антикодоновой и вариабельной веток гомология незначительна. В тРНКSer D - петля имеет структуру α =1,в =3, а между вариабельным стеблем и нуклеотидом в положении 48 нет не спаренных нуклеотидных остатков. D - петля тРНКLeu имеет структуру б = 2, в = 2, а между вариабельным стеблем и нуклеотидом в положении 48 есть один неспаренный нуклеотидный остаток. Указанные особенности являются характерными для прокариотических тРНКSer и тРНКLeu и, как было показано ранее, играют важную роль при формировании пространственной структуры этих тРНК.
Методами химической модификации, с использованием в качестве модифицирующих агентов етилнитрозомочевины, диметилсульфата и диэтилпирокарбоната, была определена реакционная способность остатков фосфорной кислоты и азотистых оснований, входящих в состав тРНКSer(GCU) и тРНКSer(GGA). Анализ полученных результатов свидетельствует об одинаковой пространственной структуре изоакцепторных тРНКSer, не смотря на отличия в их нуклеотидных последовательностях. Полученная нами информация о реакционной способности фосфатных групп и азотистых оснований в тРНКSer T.thermophilus хорошо согласуется с данными рентгеноструктурного анализа о структуре тРНКSer T.thermophilus. На основании этого был сделан вывод об общем соответствии пространственной структуры тРНКSer в растворе и в кристалле.
Реакционную способность фосфатов и азотистых оснований в тРНКLeu T.thermophilus определяли теми же методами и в тех же условиях, что и в тРНКSer. Впервые показано, что в растворе тРНКLeu имеет каноническую L- форму. Длинная вариабельная ветвь экспонирована в раствор. Укладка Т - петли каноническая. В коре молекулы можно предположить наличие триплетных взаимодействий : (8-14)-21, (15 - 48) - 20а и 9 - (13 - 22). Два последних, по-видимому, являются характерной особенностью тРНК, имеющих длинную вариабельную ветвь.
Сравнение реакционной способности фосфатных груп в тРНКSer и тРНКLeu выявило, что наиболее существенные отличия характерны для фосфатов нуклеотидов, расположенных на стыках антикодонового и вариабельного (Р45), а также вариабельного и Т - стеблей (Р47q, Р49), что свидетельствует о разных способах взаимодействия длинной вариабельной ветви с "телом" молекулы в этих тРНК. Наиболее вероятное следствие этих отличий - разная ориентация вариабельных ветвей в тРНКSer и тРНКLeu.
При сравнении уровней модификации азотистых оснований было обнаружено, что основания нуклеотидов 15 и 21, входящие в состав триплетов (15-48)-20а и (8-14)-21, имеют разную реакционную способность в тРНКSer и тРНКLeu T.thermophilus. Это указывает на отличия в пространственной структуре коровых частей изучаемых тРНК.
Методом химической модификации етилнитрозомочевиной проведен сравнительный анализ участков взаимодействия тРНКSer и тРНКLeu с гомологичными аминоацил-тРНК синтетазами. Показано, что в обеих изоакцепторных тРНКSer участки контакта с гомологичным ферментом идентичны и локализованы преимущественно в вариабельном стебле, а также с 3' - стороны акцепторного стебля, Т - стебле и Т - петле. Расположение участков взаимодействия указывает на то, что серил-тРНК синтетаза подходит к тРНКSer со стороны вариабельной ветви. Полученные результаты хорошо совпадают с данными рентгеноструктурного анализа комплекса тРНКSer - серил-тРНК синтетаза из T.thermophilus. Найденные нами отличия в ориентации вариабельных ветвей в тРНКSer и тРНКLeu, по-видимому, имеют важное значение для предотвращения взаимодействия серил-тРНК синтетазы с тРНКLeu и ошибочного аминоацилирования последней серином.
Установлено, что тРНКLeu T.thermophilus контактирует с лейцил-тРНК синтетазой в области D - петли, D - стебля, с 3' -стороны антикодонового и 3' - стороны вариабельного стебля, т. е. фермент взаимодействует с тРНК со стороны D - ветви. Контакт в вариабельным стеблем, по-видимому, имеет лишь дополнительное значение для дискриминации тРНКLeu от других тРНК ІІ класса. Взаимодействие лейцил-тРНК синтетазы с фосфатами нуклеотидов, образующих в пространственной структуре тРНКLeu триплеты, позволяет предположить важную роль найденных нами отличий в структуре коровых частей тРНКSer и тРНКLeu в процессах специфичного узнавания и дискриминации лейцил-тРНК синтетазой.
Клюючевые слова: тРНКSer, тРНКLeu, пространственная структура, длинная вариабельная ветвь, коровые триплеты, РНК-белковые взаимодействия, методы химической модификации.
SUMMARY
Kovalenko O.P. A comparative study on the tertiary structure of Thermus thermophilus tRNASer and tRNALeu and the sites of their interaction with cognate aminoacyl-tRNA synthtases. - Manuscript.
Thesis for Philosophy Doctor (Ph.D.) degree in Biology, speciality 03.00.03 - Molecular Biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.
Thesis is devoted to investigation of thertiary structure of procaryotic tRNASer and tRNALeu and the interaction sites of these tRNAs with cognate aminoacyl-tRNA synthetases in solution. This is important for understanding the structural basis of class II tRNAs function. Sequiences of tRNASer(GCU), tRNASer(GGA), and tRNALeu(CAG) from T.thermophilus have been determined. The phosphates and the bases, wich paticipate in the tertiary folding of these tRNAs have been determined by the chemical modification methods. A different orientation of the long variable arm in a tRNASer and tRNALeu has been shown and the differences in the core triplets structure have been shown too. The interaction sites of tRNASer and tRNALeu with their cognate aminoacyl-tRNA synthetases have been determined by the chemical footprinting method. Seryl-tRNA synthetase approaches the tRNASer from the variable arm side and variable arm was found as the main contact area with enzyme. On the other hand, tRNALeu is contacted by leucyl-tRNA synthetase along the D-arm side. Enzyme interacts with the tertiary core triplets, wich suggests the important role of the observed differences in the tRNASer and tRNALeu tertiary core structures for recognition by leucyl-tRNA synthetase.
Key words: tRNASer, tRNALeu, tertiary structure, long variable arm, tertiary core triplets, protein-RNA interactions, chemical probes.
| 
