Виявилося, що урокіназа, так само як і поліреактивні антитіла, ослаблювала адгезію клітин до субстрату, причому за внесення у культуральне середовище поліреактивних антитіл клону 2С3, тобто одночасної дії обох регуляторів, ослаблення адгезії було більшим (Рис.8), що свідчить скоріше за незалежні механізми реалізації впливу.
Вплив антитіл клону 2С3 на проліферативну активність фібробластів.
Факти залежності мітотичного циклу клітин від наявності адгезивних сигналів є загальновідомими. Відповідно, визначення проліферативної активності клітин за присутності регуляторів сили адгезії може надати додаткову інформацію щодо механізмів їхнього впливу. Антитіла клону 2С3 змінювали проліферативну активність нормальних фібробластів людини, знижуючи її на 10% (n = 3, р = 0.01). Час подвоєння популяції клітин у контролі був 43.4 год, а за присутності антитіл клону 2С3 збільшувався до 47.3 год. На порівняння, присутність 10 нг/мл ТФР призводила до зростання проліферативної активності клітин на 47%, час подвоєння популяції – 36.1 год.
Однією з умов активації мітотичних сигнальних шляхів є агрегація інтегринів. Ослаблення мітотичної активності нормальних фібробластів людини за присутності поліреактивних антитіл клону 2С3 може бути спричинене перешкодами у агрегації інтегринів.
Таким чином, нами зафіксовано ослаблення сили адгезії фібробластів до субстрату під впливом поліреактивних антитіл клону 2С3. Така регуляторна дія антитіл не обумовлена зв'язком з рецептором тромбоцитарного фактору росту чи з урокіназним рецептором. Показано також, що поліреактивні антитіла не впливали на початкове закріплення та розпластування клітин, коли вирішальне значення має взаємодія одиночних інтегринів з одиночними молекулами субстрату. При вивченні кінетики адгезії нами було показано ослаблення сили адгезії клітин за присутності антитіл клону 2С3 на пізніших етапах адгезії, коли вирішальною стає не сила одиночної взаємодії інтегрина з лігандом, а ступінь агрегованості інтегринів. Імовірною причиною такого ослаблення може бути створення поліреактивними антитілами стеричних перешкод до агрегації інтегринів.
ВПЛИВ АНТИТІЛ КЛОНУ 2С3 НА МІГРАЦІЮ КЛІТИН
Швидкість міграції клітин визначається силою адгезивної взаємодії з субстратом, опосередкованої інтегринами, та зовнішніми сигналами від ЕЦМ, цитокінів і факторів росту. Оскільки поліреактивні антитіла є досить ефективними регуляторами адгезії, випадало логічним дослідити іхній вплив на міграційну активність клітин. Для того було взято як нормальні, так і злоякісні фібробласти людини – клітини сполучної тканини.
Міграцію вивчали за допомогою фагокінетичного методу Альбрехта-Бехлера, адаптованого нами до 96-коміркового планшету. Така адаптація дала змогу значно спростити методику та збільшити кількість зразків в одному досліді за одночасного зниження витрати реактивів. Умови експерименту було оптимізовано за трьома параметрами: розмір часток колоїдного золота, кількість клітин на комірку та концентрація сорбованих адгезивних білків. Виявилося, що оптимальними є діаметр часток колоїдного золота у 410 ?, а кількість клітин - 3*102 на комірку. Для успішної міграції клітин існує оптимальний діапазон концентрації адгезивних білків (Рис.9). Форма кривої залежності швидкості міграції від концентрації лігандів у субстраті пояснюється необхідністю проміжної сили адгезії клітини до субстрату для забезпечення її максимальної швидкості.
 
[фібронектин], мкг/мл [колаген], мкг/мл
Рис.9. Залежність міграції нормальних фібробластів людини (о) та клітин лінії НТ1080 (·) від концентрації адгезивних білків. Час міграції – 16 год.
Вплив антитіл клону 2С3 на міграційну активність клітин.
Поліреактивні антитіла клону 2С3 стимулювали міграцію як нормальних, так і злоякісних фібробластів. Стимуляцію було показано для двох різних субстратів – фібронектину та колагену І типу. Контрольні IgG мишей за тих же концентрацій не справляли ніякого впливу на міграцію клітин, тоді як міграційна активність нормальних фібробластів за присутності 7 мкг/мл антитіл клону 2С3 зростала на 30% порівняно з контролем (Рис.10), а злоякісних фібробластів лінії НТ1080 вдвічі (Рис.11).
 
Рис.10 Рис.11
Рис.10. Міграція фібробластів людини за відсутності додаткових чинників (А) та в присутності 7 мкг/мл Ат клону 2С3 (Б). Час міграції – 16 год.
Рис.11. Міграція клітин лінії НТ1080 за відсутності додаткових чинників (А) та в присутності поліреактивних антитіл клону 2С3 (Б). Час міграції – 16 год.
Вплив антитіл до a5b1 інтегрину на міграцію клітин. Порівняння з дією поліреактивних антитіл.
Оскільки міграцію клітин опосередковано інтегринами, то для з'ясування механізму впливу поліреактивних антитіл на міграцію клітин ми порівняли їхню дію з дією специфічних анти-інтегринових антитіл. Як показано вище (Табл.1), антиінтегринові антитіла повністю блокували розпізнавання інтегрином відповідного ліганду субстрату, пригнічуючи тим самим адгезію клітин. Така їхня дія дозозалежно пригнічувала і міграцію нормальних фібробластів на фібронектині, причому за концентрації антитіл 7 мкг/мл пригнічення сягало майже 80%, а за 17.5 мкг/мл вони повністю інгібували рух (Рис.12).
Отже, поліреактивні та моноспецифічні антиінтегринові антитіла діяли протилежним чином на міграцію клітин. Такі їхні ефекти можуть пояснюватися різною модуляцією сили адгезивної взаємодії інтегринів з субстратом. Як було показано раніше, специфічні антитіла блокували розпізнавання інтегриновим рецептором ліганду, а поліреактивні ослабляли адгезію в основному на стадії агрегації та кластеризації інтегринів, тобто на етапі формування адгезивних комплексів (Табл.1). Саме зменшення сили адгезивної взаємодії через зменшення розмірів адгезивних комплексів і могло бути причиною зростання міграційної активності клітин.
Вплив тромбоцитарного фактору росту на міграцію клітин. Порівняння з дією поліреактивних антитіл.
Градієнт концентрації ТФР у середовищі є ефективним стимулятором хемотаксису фібробластів. Але, як виявилося, постійна концентрація фактору в середовищі, на відміну від поліреактивних антитіл клону 2С3, не лише не стимулює ненаправлену рухливість, тобто хемокінезис, клітини, а й пригнічує його (Рис.13). Отже, з різниці ефектів антитіл клону 2С3 та ТФР у міграції клітин можна зробити висновок, що поліреактивні антитіла не взаємодіють з рецептором цього фактору росту.
  
Рис.12 Рис.13 Рис.14
Рис.12. Міграція нормальних фібробластів людини за відсутності додаткових чинників (А) та в присутності 7 мкг/мл (Б) та 17.5 мкг/мл (В) антитіл до a5b1 інтегрину. Час міграції – 16 год.
Рис.13 Міграція фібробластів людини за відсутності додаткових чинників (А) та в присутності 10 нг/мл ТФР (Б). Час міграції – 16 год.
Рис.14 Міграція клітин НТ1080 за відсутності додаткових чинників (А) і в присутності 7 мкг/мл поліреактивних антитіл клону 2С3 (Б), 50 нг/мл урокінази (В) та обох вищезазначених чинників одночасно (Г). Час міграції – 6 год.
Вплив активатору плазміногену урокіназного типу на міграцію клітин. Порівняння з дією поліреактивних антитіл.
За умов нашого експерименту одноланцюгова, протеолітично неактивна, урокіназа, внесена до комірок культуральних планшетів у концентрації 50 нг/мл, діяла на рух клітин приблизно так само, як антитіла клону 2С3, внесені до культурального середовища концентрацією 7 мкг/мл (Рис.14). Аби з'ясувати, чи не діють урокіназа та поліреактивні антитіла клону 2С3 через один рецептор, нами було проведено дослідження їхньої одночасної дії. Як виявилося, посилення міграційної активності клітин було ще більшим за спільної інкубації, аніж за дії кожного з агентів окремо (Рис.14 Г). Таке посилення ефекту є свідченням на користь різних місць зв'язування на поверхні клітини для урокінази та антитіл клону 2С3.
Таким чином, зростання швидкості міграції клітини за присутності поліреактивних антитіл найімовірніше пояснюється зниженням сили адгезивної взаємодії через зменшення розмірів адгезивних комплексів. Досліджений нами вплив антитіл клону 2С3 на адгезію та міграцію клітин виявляв порівняно незначне ослаблення адгезії з досить великим зростанням міграційної активності фібробластів. Одержані дані узгоджуються з теорією DiMilla еt al, згідно з якою для досягнення максимальної швидкості міграції потрібна проміжна сила адгезії клітини до матриксу – за малої сили клітина нездатна розвинути достатню тягу, за великої – відірватися від субстрату. Отже, посилення міграції та ослаблення адгезії нормальних і злоякісних фібробластів людини під дією поліреактивних антитіл клону 2С3 найімовірніше обумовлено перешкодами кластеризації інтегринів і зменшенням таким чином розміру фокальних адгезій.
ВИСНОВКИ
1. Антитіла клону 2С3 є поліреактивними, тобто здатними, хоч і з низькою афінністю, реагувати з антигенами різної природи, в тому числі з антигенами живих клітин. Їх здатність зв'язуватися з антигенами значною мірою залежить від вмісту заряджених амінокислотних залишків у їхньому активному центрі. Можливо, їх поліреактивність зумовлюється гнучкістю поліпептидного ланцюга і здатністю “підлаштовувати” свій активний центр під структуру антигену.
2. Поліреактивні антитіла клону 2С3 здатні модулювати адгезію нормальних фібробластів людини та злоякісних клітин. Цей вплив здійснюється, головним чином, на етапі формування адгезивних комплексів і призводить до зниження сили адгезивної взаємодії клітини із субстратом.
3. Часткове пригнічення антитілами клону 2С3 адгезивної взаємодії клітин із субстратом призводить до вираженого зростання міграційної активності клітин.
4. Через порівняння з дією специфічних антиінтегринових антитіл, тромбоцитарного фактору росту та активатору плазміногену урокіназного типу показано, що ефекти поліреактивних антитіл клону 2С3 на адгезію та міграцію клітин реалізуються, найімовірніше, через створення стеричних перешкод агрегації та кластеризації інтегринів на етапі формування адгезивних комплексів.
Список опублікованих праць за темою дисертації.
1. Бобровник С.А., Веремеенко Е.Ю., Петрова Ю.И., Комисаренко С.В. Оценка фагоцитарной активности перитонеальних клеток с помощью проточной цитофлюориметрии // Доповіді НАН України. – 1995. – № 11. – С. 139-142.
2. Бобровник С.А., Петрова Ю.И., Ефетов К.А. Трансформация сывороточных иммуноглобулинов в полиреактивные антитела // Укр биохим журн. – 1997. – Т. 69, №3. – С. 36-42.
3. Петрова Ю.И. Влияние полиреактивных антител на адгезию и миграцию клеток in vitro. // Медицинская иммунология. – 1999. – Т.1, № 3-4. – С. 22.
4. Петрова Ю.І., Скок М.В. Регуляція адгезії фібробластів поліреактивними антитілами // Укр біохім журн. – 2002. – Т. 74, №1. – С. 44-51.
5. Петрова Ю.І., Скок М.В., Комісаренко С.В. Регуляція міграції фібробластів поліреактивними антитілами // Доповіді НАН України. – 2002. – №9. – С. 152-155.
6. Bobrovnik S.A., Petrova Yu.I., Veremeenko E.Yu. Opsonizing properties of polyreactive immunoglobulins // The 9th International Congress of Immunology, – San Francisco, California, USA, 23-29 July, 1995, P. 283, N. 3137.
7. Petrova J.I., Skok M.V. The influence of polyreactive immunoglobulins on cell adhesion and migration in vitro // Fourth John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, - Puschino, Russia, 14-18 September, 1998, P. 61.
Петрова Ю.І. Поліреактивні антитіла як регулятори адгезивних взаємодій клітин. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2002.
Показана поліреактивна природа моноклональних антитіл клону 2С3 та можливість зв'язування цими антитілами антигенів нормальних фібробластів людини і злоякісних клітин. Показано, що поліреактивні антитіла здатні модулювати адгезію клітин. Цей вплив здійснюється, головним чином, на етапі формування адгезивних комплексів і призводить до зниження сили адгезивної взаємодії клітини із субстратом. Часткове пригнічення антитілами клону 2С3 адгезивної взаємодії клітин із субстратом призводило до вираженого зростання міграційної активності клітин. Дія поліреактивних антитіл клону 2С3 на адгезію та міграцію клітин відрізнялась від ефектів специфічних антиінтегринових антитіл, тромбоцитарного фактору росту та активатору плазміногену урокіназного типу. Припускається, що механізмом реалізації впливу поліреактивних антитіл є створення стеричних перешкод агрегації та кластеризації інтегринів на етапі формування адгезивних комплексів.
Ключові слова: поліреактивні антитіла, адгезія, міграція клітин, інтегрини.
Петрова Ю.И. Полиреактивные антитела как регуляторы адгезивных взаимодействий клеток. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2002.
Существование в сыворотке крови здоровых, неиммунизированных животных и человека антител, способных с низкой афинностью связываться с собственными антигенами организма, было установлено еще в начале прошлого столетия. Позже было установлено, что эти антитела являются полиреактивными, т.е. одна молекула такого антитела способна реагировать с двумя и более антигенами. CD5-положительные В лимфоциты (продуценты полиреактивных антител) составляют значительный процент В лимфоцитов организма. Роль полиреактивных антител и их клеток-продуцентов в функционировании иммунной системы неизвестна. Существует ряд гипотез, объясняющих роль полиреактивных антител в организме, однако ни одна из них не стала общепринятой. Известно, что полиреактивные антитела способны модулировать функции моноцитов и клеток эндотелия сосудов, в том числе, влияя на экспрессию молекул адгезии на поверхности этих клеток. Эти данные дают основание более детально изучить влияние полиреактивных антител на адгезивные взаимодействия клеток. Адгезия как одно из проявлений лиганд-рецепторных взаимодействий опосредуется адгезивными рецепторами клеточной поверхности, с одной стороны, и адгезивными молекулами внеклеточного матрикса или рецепторами соседних клеток, с другой.
Целью данной работы было исследовать иммунохимические характеристики полиреактивных антител, их влияние на адгезивные взаимодействия клеток и установить возможный механизм такого влияния.
Адгезивные взаимодействия клеток исследовали на примере адгезии клеток к белкам внеклеточного матрикса и ненаправленой миграции клеток (хемокинеза), поскольку последовательная адгезия и де-адгезия – это физический механизм миграции клеток. Как модельные использованы быстромигрирующие нормальные и злокачественные фибробласты человека. Низкая афинность и способность создавать комплексы с собственными антигенами организма усложняют очистку сывороточных полиреактивных антител, поэтому в работе были использованы моноклональные полиреактивные антитела.
В результате проведенных экспериментов была показана полиреактивная природа моноклональних антител клона 2С3 и возможность связывания этими антителами антигенов нормальных фибробластов человека и злокачественных клеток. Было также показано, что полиреактивные антитела клона 2С3 модулируют адгезию клеток. Установлено, что антитела клона 2С3 не влияют на прямое взаимодействие адгезивных рецепторов клеток – интегринов с лигандами субстрата, так как не влияют на начальное прикрепление и распластывание клеток, т.е. на процессы, где решающим является прямое взаимодействие одиночных интегринов с молекулами субстрата. Влияние полиреактивных антител на адгезию осуществляется, главным образом, на этапе формирования адгезивних комплексов, когда происходит агрегация и кластеризация интегринов. В присутствии полиреактивных антител наблюдалось дозозависимое снижение силы адгезивного взаимодействия клетки с субстратом с достижением максимума эффекта через 1 час после посадки клеток. При изучении миграции нормальных фибробластов и злокачественных клеток было показано возрастание миграционной активности в присутствии полиреактивных антител. Такой эффект вызван частичным ингибированием антителами клона 2С3 адгезии клеток к субстрату. Известно, что для достижения клеткой максимальной скорости движения необходима умеренная сила адгезии к субстрату. Путем сравнения с действием известных модуляторов адгезии и миграции клеток, таких как специфические антиинтегриновые антитела, тромбоцитарный фактор роста и активатор плазминогена урокиназного типа показано, что эффекты полиреактивных антител клона 2С3 на адгезию и миграцию клеток отличаются от действия вышеперечисленных факторов. Предполагается, что механизмом ослабления адгезии полиреактивными антителами является создание стерических препятствий агрегации и кластеризации интегринов на этапе формирования адгезивных комплексов.
Ключевые слова: полиреактивные антитела, адгезия, миграция клеток, интегрины.
Petrova Yu.I. Polyreactive antibodies as regulators of cell adhesive interactions. – Manuscript.
Thesis for the scientific degree of candidate of biological sciences, specialization 03.00.04. – biochemistry. – Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.
2C3 monoclonal antibodies polyreactivity and the binding to cellular antigens were established for normal human fibroblasts and malignant cell antigens. It was shown that polyreactive antibodies are able to modulate cell adhesion. This influence is realized mainly at the stage of adhesive complex formation and leads to the decreasing of cell adhesion strength. Partial inhibition of cell-substratum adhesive interaction by polyreactive 2C3 antibodies resulted in noticeable cell migration increasing. The effect of polyreactive antibodies on cell adhesion and migration differs from action of specific anti-integrin antibodies, platelet derived growth factor or urokinase type plasminogen activator. Mechanism of polyreactive antibodies effect was suggested as steric handicaps to integrin aggregation and clastering.
Key words: polyreactive antibodies, adhesion, cell migration, integrins.
| 
