Одержання позаклітинних сіалоспецифічних лектинів Bacillus
Виділення лектинів з культуральноі рідини. В літературі є відомості щодо майже 70 бактерійних лектинів (Коваленко Э.А., 1990; Подгорский B.C. и др., 1992), однак більшість із них не одержано в очищеному стані і не вивчено. Труднощі пов’язані з надзвичайною лабільністю молекул цих біополімерів, що проявляєються у великій втраті активності та вуглеводної специфічності, в більшій мірі до сіалових кислот, на різних етапах очищення. У зв’язку з цим одним із головних завдань був підбір і розробка методів одержання позаклітиних сіалоспецифічних лектинів бацил.
На першому етапі – виділенні лектинів із культуральної рідини – були апробовані у порівняльному аспекті загальні методи білкової хімії: висолювання сульфатом амонію та осаджування спиртом й ацетоном. Сумарні препарати лектинів з найвищими показниками за активністю, ступенем очищення, виходом за активністю і спорідненістю до N-ацетилнейрамінової кислоти були одержані при висолюванні сульфатом амонію. За результатами очищення були відібрані три най-більш активні лектини, які надалі будемо називати за номерами штамів: лектин 316, лектин 668 та лектин 102.
Очищення сіалоспецифічних лектинів. При підборі методів очищення сіалоспецифічних лектинів бацил були використані різні види хроматографії, гель-фільтрації та ізоелектрофокусування.
Використання методів афінної хроматографії на муцин-сефарозі та лектин-афінної хроматографії на конканавалін-А-глюкозил-сфероні не дали очікуваних результатів, однак дозволили одержати інформацію щодо дуже високого ступеня спорідненості досліджуваних лектинів до сіалових кислот та про наявність двох позаклітинних лектинів 668 і 102, які мають часткові відмінності в хімічній структурі їх молекул; один із них являє собою N-acпарагінзв’язаний глікопротеїн. При хроматографії на інших носіях відмічено значні втрати активності лектинів і повна відсутність їх спорідненості до N-ацетилнейрамінової кислоти.
Позитивні результати були отримані при використанні методів гель-фільтрації на різних типах сефароз (CL 6В, 6В та 4В) із наступною рехроматографією на цих же носіях, послідовної водень-зв’язуючої і гідрофобної хроматографії на TSK гелях та ізоелектрофокусування в системі борат поліольних носіїв. При використанні цих методів булі одержані один лектин 316 (рис. 6) і два лектини або їх п’ять ізоформ лектинів 668 та 102 (рис. 7, 8).
Рис. 6. Рехроматографія лектину B.subtilis 316М на сефарозі 4В: 1 – білок,
2 – гемаглютинуюча активність, 3 – вуглеводи.
Рис. 7. Воденьзв’язуюча (А) і гідрофобна (Б) хроматографія лектинів B.polymyxa 102 КДУ (аналогічні дані одержано для В.subtilis 668 ІМВ) 1 – білок; 2 – гемаглютинуюча активність.
Рис. 8. Рехроматографія на сефарозі CL-6В (А) та ізоелектрофокусування (Б) лектину В.subtilis 668 ІМВ: 1 – білок, 2 – гемаглютинуюча активність, 3 – вуглеводи, 4 – градієнт рН.
Очищені препарати лектинів чітко розподілялись на дві групи: перша – лектини 316, 668-1 та 102-1 з дуже високою питомою активністю (до 422813 ГАО), ступенем очищення 216,1-237,8 разів, виходом за активністю 64,0-81,9 % і за білком до 0,84 %; для другої групи лектинів (668-2 та 102-2) відмічено нижчі показники очищення, однак чіткий розподіл лектинів свідчить про ефективність застосованих методів.
Для очищених препаратів лектинів характерна різниця в ступені спорідненості до специфічних вуглеводів. Для лектину 316 відмічена здатність реагувати в більшій мірі з фруктозо-1,6-дифосфатом та N-ацетилнейраміновою кислотою (мінімальні інгібуючі РГА дози вуглеводів 0,6 мМ та 0,9 мМ, відповідно). Лектини 668-1 та 102-1 виявляли спорідненість до N-ацетилнейрамінової кислоти (0,5 мМ та 0,9 мМ, відповідно), D-глюкуронової кислоти (0,9 мМ), фруктозо-1,6-дифосфату (2,3 мМ та 0,3 мМ, відповідно), обох аміносахарів (18,7 мМ). Лектин 102-1 реагував також з D-галактуроновою кислотою (0,9 М). Лектини другої групи відрізнялись від лектинів першої групи більш вузькою вуглеводною специфічністю; лектин 668-2 мав здатність до впізнавання тільки N-ацетилнейрамінової та D-глюкуронової кислот (0,9 мМ), а лектин 102-2 через свою чутливість тільки до D-глюкуронової кислоти (0,9 мМ) відноситься до моноспецифічних лектинів, що зустрічається вкрай рідко.
Отже, при порівняльному використанні для очищення сіалоспецифічних лектинів різних методів нами підібрані декілька найбільш результативних, які вперше використовуються для цієї мети, а саме: гель-фільтрація на різних типах сефароз, хроматографія на TSK гелях та ізоелектрофокусування в борат-поліольній системі, що дозволяє одержувати нативні препарати лектинів та їх ізоформи з різними, більшістю, високими показниками очищення і великою спорідненістю до сіалових і уронових кислот. Розроблені схеми очищення включають усього два етапи: висолювання звільненого від клітин культурального фільтрату сульфатом амонію та хроматографію на TSK гелях; для одержання ізоформ лектинів додається третій етап: рехроматографія або ізоелектрофокусуванння. Очищені препарати сіалоспецифічних лектинів бацил високоактивні і відповідають світовим стандартам таких біополімерів.
Характеристика позаклітинних лектинів Bacillus
Xімічний склад лектинів бацил. Вивчення хімічного складу ізольованих лектинів бацил показало, що всі вони є глікопротеїнами, які містять у своєму складі 53,7-76,0 % білка та від 4,9 % до 11,5 % вуглеводів (табл. 5). Відмічено різницю за вмістом білка в різних препаратах: у лектинах 668-1 та 102-1 кількість білка була в 1,3-1,4 рази більша, ніж у лектинах 668-2 та 102-2.
Таблиця 5
Хімічний склад позаклітинних лектинів Bacillus
За амінокислотним складом та кількісним вмістом амінокислот дocліджувані лeктини подібні до інших бактерійних лектинів і сіалоспецифічних лектинів, ізольованих з різних джерел. В їхньому складі визначена значна кількість дикарбонових кислот (аспарагіну та глютаміну) й валіну, і повністю відсутні сірковмісні амі-нокислоти; вміст інших амінокислот коливається в середніх значеннях. Відмічена подібність за кількісним вмістом певних амінокислот у лектинів першої і другої групи; лектини 662-2 та 102-2 відрізняються від лектинів першої групи підвищеною кількістю треоніна та серина.
При дослідженні моносахаридного складу встановлено, що лектини обох груп містять переважну кількість глюкози та галактози і відрізняються між собою за вмістом манози та арабінози (перша група лектинів) і рамнози та рибози (друга група лектинів).
Якісний та кількісний вміст амінокислот і моносахаридів у лектинах 316, 668-1 та 102-1 характерний для типу N-глікозидного зв’язку в молекулі глікопротеїнів, в яких білкова частина зв’язується з вуглеводною через аспарагін, а в лектинах 668-2 та 102-2 свідчить про наявність в їх молекулах О-глікозидного типу зв’язку через серин і треонін. Це узгоджується з результатами, одержаними при зв’язуванні досліджуваних лектинів з конканавалін-А-глюкозил-сфероном, а також при очищенні на TSK гелях.
Фізико-хімічні властивості лектинів бацил. Вивчення фізико-хімічних характеристик очищених до гомогенного стану препаратів позаклітинних лектинів показало, що лектини першої групи мають молекулярну масу порядку 19-26 кДа, а другої – значно (в 3 рази) меншу. За даними гель-фільтрації на сефарозі молекулярні маси всіх лектинів були на порядок більші, що пов’язано, можливо, з тенденцією очищених препаратів до агрегації з утворенням значних комплексів лектинів, що ясно видно на фотографії (рис. 9).
Рис. 9. Очищені лектини бактерій роду Bacillus
(електронна мікроскопія x30000 разів)
Порівняльні дані, одержані при використанні різних методів очищення, вивчення вуглеводзв’язуючих, фізико-хімічних властивостей свідчать про те, що B.subtilis 316М синтезує один позаклітинний лектин, який становить собою N-аспарагінзв’язаний, глюкозо/манозовмісний глікопротеїн, а дві інші культури (B.subtilis 668 ІMB та B.polymyxa 102 КДУ) мають здатність до утворення двох позаклітинних лектинів, один із яких є також N-аспарагінзв’язаним глікопротеїном, а другий відноситься до О-серин/треонінзв’язаних глікoпpoтeїнів.
Резумуючи результати вивчення фізико-хімічних властивостей позаклітинних лектинів Bacillus, слід відзначити, що вони становлять собою глікопротеїни, які відрізняються за вмістом білків, вуглеводів, амінокислот і моносахаридів, що може свідчити про відмінності в структурній організації їхніх молекул, ці біополімери мають різні молекулярні маси і в очищеному стані можуть утворювати крупномолекулярні агрегати.
Гемаглютинуючі властивості позаклітинних лектинів Bacillus
Взаємодія лектинів бацил з різними типами еритроцитів та глікоконьюгатами. Нами вперше виявлена здатність сапрофітних бактерій синтезувати позаклітинні лектини та їх специфічність до сіалових кислот. Порівняльна характеристика ступеня спорідненості до незаміщених сіалових кислот найбільш відомих сіалоспецифічних лектинів показала, що лектини бацил є найбільш чутливими до цих моносахаридів (табл. 6). За своїми характеристиками сіалоспецифічні лектини бацил відповідають світовим стандартам сіалоспецифічних лектинів, виділених з інших джерел, а за деякими (активністю, ступенем спорідненості до сіалових кислот, тощо) – перевищують їх.
Таблиця 6
Порівняльна характеристика сіалоспецифічних лектинів
(мінімальні інгібуючі концентрації сіалових кислот в мМ)
Примітка: “—” – відсутність інгібування, н/в – не визначали, * – цит за Mandal C., 1990.
Визначення тонкої вуглеводної специфічності досліджуваних лектинів до природних сіало- та сіаловмісних глікоконьюгатів, які мали у своєму складі різні типи, форми та кількість сіалових кислот, дозволило встановити, що всі вони взаємодіють тільки з тими з них, щo містять у своєму складі обидва типи сіалових кислот (муцином підщелепної залози бика та фетуїном) або -ізомером N-ацетилнейрамінової кислоти в О-ацетильованій формі, які мають 2,3-, a2,6- та в меншій мірі 2,8-зв’язки: фібриногеном, імуноглобуліном і коломіновою кислотою (табл. 7). Найвищу спорідненість лектини бацил виявляли до муцину підщелепної залози бика, що містить найбільшу кількість обох типів сіалових кислот, в яких термінальна нейрамінова кислота зв’язана з галактозою 2,6-зв’язком. Цим і можна пояснити велику міцність комплексу муцин-лектин при пропусканні розчинів лектинів через муцин-сефарозу.
Для підтвердження одержаних результатів проведено дослідження аглютинуючих властивостей позаклітинних лектинів бацил у відповідності до еритроцитів різних видів тварин, які відрізняються вмістом відмінних типів сіалових кислот й наявністю їхніх заміщених форм. Виявилось, що позаклітинні лектини бацил взаємодіють тільки з еритроцитами кроля та миші, в яких сіалові кислоти представлені в більшій мірі N-гліколилнейраміновою кислотою та О-заміщеною формою N-ацетилнейрамінової кислоти. Відсутність аглютинації еритроцитів усіх груп крові людини зрозуміла, через те що в еритроцитах людини немає N-гліколилнейрамінової кислоти, а є переважно N-ацетилнейрамінова кислота в незаміщеній формі.
3aлeжнicть гeмaглютинуючoї активності лектинів від факторів зовнішнього середовища. Вивчення гемаглютинуючих властивостей позаклітинних лектинів бацил продемонструвало, що вони мають ряд особливостей, які суттєво відрізняють їх від інших бактерійних лектинів. Насамперед, лектини бацил стійкі в широкому діапазоні рН: від 4,8 до 9,1. Вони є Са2+ – незалежними біополімерами, нечутливими до дії детергентів, зокрема ЕДТА, (табл. 8). Це свідчить, можливо, про те, що йони металів не є структурними елементами лектинів, необхідними для їх зв’язуючих властивостей. Для інших бактерійних та сіалоспецифічних лектинів така залежність встановлена й виявлено, що в присутності йонів Са2+ та ЕДТА відбувається їхня повна або часткова інактивація (Mandal C., 1990).
Таблиця 7
Спорідненість позаклітинних лектинів Bacillus до природних глікоконьюгатів
Примітка: “—” – відсутність РГА.
Таблиця 8
Аглютинація кролячих еритроцитів лектинами Bacillus
у присутності Са2+ і ЕДТА (титр–1 РГА)
Одна з важливих характеристик досліджуваних лектинів – це їхня термостабільність. Прогрівання 1 %-них розчинів лектинів при 80°С протягом майже 5 год. не змінює їхні аглютинуючі властивості, у той час як інші лектини рідко витримують прогрівання вище, ніж 50°С (Atkinson H.M., Trust T.I., 1980; Dehazya P., Coles R.S., 1982; Huang J. et al., 1988).
Стабільність бацилярних лектинів при зберіганні. Необхідною умовою при роботі з препаратами лектинів є збереження їхніх головних характеристик: активності та вуглеводної специфічності при довгому зберіганні. Дослідження різних способів зберігання позаклітинних лектинів бацил дало можливість установити, що ці речовини у ліофілізованому стані можуть зберігатися роками без особливих втрат активності та специфічності.
Одержані дані щодо гемаглютинуючих властивостей позаклітинних лектинів Bacillus свідчать про те, що ці біополімери мають дуже вузьку вуглеводну специфічність та високий ступінь впізнавання точно певних структур і можуть успішно конкурувати з моноклональними антитілами як аналітичні й діагностичні реагенти. Лектини бацил стійкі до впливу різних факторів зовнішнього середовища (температури, рН, хелатуючих агентів, тривалого зберігання), що є важливі-шою відмінністю від інших бактерійних лектинів і визначає їхні переваги при одержанні та використанні.
Біологічна активність позаклітинних лектинів Bacillus
Гостра токсичність лектинів бацил. Науковий і практичний інтерес до бактерійних лектинів зумовлений їхньою постійною дією на організм макроорганізмів і можливістю регуляції імунологічної реактивності організму за допомогою цих фізіологічно активних речовин. Лектини сапрофітних бактерій можуть стати перспективними медикаментозними препаратами. Визначення одного з головних фармакологічних індексів медикаментозних препаратів – гострої токсичності на двох видах тварин при різних шляхах введення показала, що досліджувані лектини бацил відносяться до помірних та малотоксичних речовин (табл. 9).
Таблиця 9
Середньосмертельні дози лектинів Bacillus за різними шляхами введення
Примітка: тут и далі досліджували сумарні препарати лектинів 668 и 102.
Протипухлинна активність лектинів бацил. Проведене вивчення протипухлинної активності позаклітинних лектинів Bacillus у відношенні штамів пухлин різного генезу дозволило одержати різні результати (рис. 10). Найбільш активну та стабільну протипухлинну дію у відношенні гальмування росту пухлин виявляв лектин 668 (позитивний ефект на 4-х з 5-ти експериментальних пухлин). Близьким до нього за протипухлинним ефектом був лектин 102 (гальмування росту 3-х пухлин). Дія лектина 316 була неоднозначною: цей лектин мав вагомий протипухлинний ефект на одному штамі пухлини, а на двох – стимулював їх ріст. Такі неоднозначні результати цілком пояснюються; відомо, що при трансформації нормальної клітини в пухлинну в складі компонентів поверхні клітини відбувається ряд кількісних та якісних змін: збільшується кількість сіалових кислот, змі-нюється їхній якісний склад, зв’язки з субтермінальним вуглеводом (Глузман Д.Ф. и др., 1989). Досліджувані лектини, які мають тонкі відмінності в пізнаванні різних типів і структур сіалових кислот, можливо, спочатку розпізнають певні компоненти поверхні клітини, а потім чинять імунотропну дію, характерну для кожного лектину, в протипухлинний ефект. Одержані дані відкривають нові сторони фармакологічної дії позаклітинних сіалоспецифічних лектинів Bacillus та дозволяють розглядати їх як вельми перспективні протипухлинні засоби, можливо, у сполученні з іншими терапевтичними препаратами.
Вплив лектинів бацил на окремі ланцюги імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму. Вивчення впливу позаклітинних лектинів бацил на окремі рівні імуногенезу від початкових етапів (функціонального стану поліпотентної стовбурової клітини кісткового мозку) до функціонування системи імунітету (диференційованої оцінки специфічних реакцій Т- і В- лімфоцитів та їх кооперативної взаємодії в імунній відповіді) дозволило встановити, що всі досліджувані лектини бацил мають виражений та диференційований імуностимулюючий ефект (рис. 10). На ранні етапи імуногенезу (міграцію і проліферацію стовбурової клітини кісткового мозку) найбільшу дію чинить лектин 102 (+44,6-51 %); міграція та функціональна активність Т- і В-лімфоцитів (середні етапи) приблизно однакова при дії всіх трьох лектинів з деякою перевагою для лектину 668 (22,2-35,7 %); однак, вплив лектину 316 на кооперативну взаємодію імунокомпетентних клітин (пізні етапи) значно вища, ніж в інших досліджуваних лектинів (61,4 %).
Імунна відповідь спленоцитів у більшій мірі зростає під впливом лектину 668 (33,0 %), а функціональна активність В-лімфоцитів кісткового мозку значно вища після обробки лектинами 102 і 316 (62,5 та 72,6 % відповідно). Найбільшу дію на В-лімфоцити чинить лектин 668, на Т-клітини – лектин 102. Виявлення вираженого та вибіркового впливу позаклітинних лектинів бацил на різні етапи імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму, встановлення можливості селективно модулювати T- і В- системи лімфоцитів має безперечний інтерес з точки зору керованої імунодепресії та імуностимуляції.
Інтерфероногенна активність лектинів бацил. Інтерфероногенні властивості виявлені у вірусів, бактерій та їхніх активних компонентів – ліпополісахаридів (Liener I.E., 1986). Добре вивченими і широко використовуваними у лабораторній практиці є також рослинні лектини: ФГА та КонА (Луцик М.Д. и др., 1981). Аналіз інтерфероніндукуючої здатності позаклітинних лектинів бацил in vivo та in vitro продемонстрував, що всі три лектини є індукторами утворення -інтерферону, однак найбільш високий ефект мав лектин 668 (рис. 10). Його інтерфероногенна дія була однаковою з дією стандартних комерційних препаратів рослинних лектинів, а у випадку застосування “праймінгу” перевищувала її. Здатність до індукції синтезу -інтерферону лектину 102 була близькою до подібної лектину 668, а для лектину 316 – незначною. Одержані результати свідчать про те, що позаклітинні лектини бацил є сильними індукторами синтезу природного -інтерферону; відсутність токсичних та алергічних ефектів дозволяє рекомендувати лектин 668 для широкого використання.
Подібні медико-біологічні властивості лектинів 668 та 102 пояснюються великою схожістю цих лектинів за фізико-хімічними та гемаглютинуючими характеристиками. Лектин 316 відрізняється від них багатьма властивостями і не є винятком у відношенні його біологічної активності.
Одержання активних препаратів сіалоспецифічних лектинів сапрофітних бактерій, вивчення їхніх гемаглютинуючих і фізико-хімічних властивостей та біоло-гічної активності дозволило визначити такі можливі аспекти їх використання. Насамперед, надзвичайна, на наш погляд, тонка вуглеводна специфічність дозволяє застосовувати позаклітинні лектини бацил як цінні аналітичні реагенти та діагностичні препарати, що не поступаються за своєю чутливістю моноклональним антитілам. Медико-біологічні властивості цих біополімерів свідчать про перспективність їхнього використання як протипухлинних та імуномодулюючих лікарських засобів, індукторів синтезу g-інтерферону, а також для конструювання лікарських препаратів на базі бактерійних лектинів (вакцин, молекулярних асоціацій, тощо).
ВИСНОВКИ
1. Проведено широкий пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед представників спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus та виявлено їхню здатність синтезувати та виділяти в середовище росту лектини зі специфічністю, що рідко зустрічається, до сіалових і уронових кислот.
2. Особливостями утворення позаклітинних лектинів сапрофітних культур бацил у процесі їхнього росту є: наявність двох періодів виявлення лектинової активності в динаміці росту бактерій, максимальне продукування лектинів у фазі затримання росту, відокремленість ростових та лектинсинтезуючих процесів. Визначено оптимальні умови утворення позаклітинних лектинів (температура і час вирощування, склад та рН середовища, наявність у ньому біостимуляторів і конкретних вуглеводів), що дозволяє здійснити керований синтез цих біополімерів.
3. Підібрано методи виділення та очищення позаклітинних сіалоспецифічних лектинів бактерій із використанням хроматографії на TSK гелях, гель-фільтрації на різних типах сефароз та ізоелектрофокусування в борат-поліольній системі, які дозволяють одержувати препарати лектинів та їхні ізоформи з високими показниками за активністю, очищенням та ступенем спорідненості до специфічних вуглеводів.
4. У сапрофітних бактерій установлено здатність до продукування двох позаклітинних лектинів, що відрізняються між собою за хімічним складом їхніх молекул, фізико-хімічними характеристиками, активністю та вуглеводзв’язуючими властивостями:
– лектини першої групи відносяться до N-аспарагінзв’язаних глікопротеїнів з вираженими гідрофільними властивостями, молекулярною масою 19-26 кДа, високою гемаглютинуючою активністю та ступенем спорідненості до обох типів сіалових та уронових кислот, а також до фруктозо- 1,6-дифосфату; для першої групи лектинів установлено наявність трьох ізоформ;
– лектини другої групи становлять собою О-серин-треонінзв’язані глікопротеїни, котрі виявляють великі гідрофобні властивості з молекулярною масою 7,7-10,0 кДА, більш низькою активністю і вузькою вуглеводною специфічністю до N-ацетилнейрамінової та D-глюкуронової кислот, лектини цієї групи існують у двох ізоформах.
5. Позаклітинні лектини Bacillus є термостабільними, стійкими до дії рН та детергентів, Ca+2 – нeзалежними глікополімерами, які зберігають свою активність при тривалому зберіганні, здатними у чистому вигляді утворювати великі агрегати з молекулярною масою 77-260 кДА.
6. Досліджувані лектини розпізнають тонкі відмінності в структурі сіалових кислот та їхніх зв’язках із термінальними вуглеводами; найбільшу спорідненість лектини бацил виявляють до глікоконьюгатів, які містять N-гліколил- та N-ацетилнейрамінові кислоти або -ізомер О-ацетильованої форми N-ацетилнейрамінової кислоти з 2,3- та 2,6- зв’язками.
7. Позаклітинні лектини бацил відносяться до помірно й малотоксичних речовин та мають виражені імунотропні властивості: диференційовано стимулюють ведучі ланцюги імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму, виявляють вибірковий стимулюючий ефект у відношенні Т- і В-лімфоцитів, чинять селективну протипухлинну дію, виступають індукторами утворення -інтерферону в різних біологічних системах.
8. Розроблено лабораторний регламент на отримання позаклітинного сіалоспецифічного лектину (штам B.subtilis 668 1MB), де описуються особливості проведення технологічного процесу і характеристика готового продукту для використання його як імунотропної речовини, індуктора -інтерферону та хіміко-аналітичного реагенту. Одержані практичні результати за здатністю лектину B.subtilis 668 ІМВ індукувати синтез -інтерферону увійшли як складова частина в ТУ по виробництву -інтерферонів свиней та великої рогатої худоби.
9. Позаклітинні сіалоспецифічні лектини сапрофітних бактерій можуть використовуватись у таких напрямках:
– як високочутливі та специфічні аналітичні реагенти (для виділення, очищення, вивчення сіалоспецифічних глікополімерів) та діагностикумів (при пухлинах різного генезу);
– як медикаментозні препарати направленої дії на різні етапи імуногенезу, імунну відповідь макроорганізму, Т- і В-системи імунітету;
– для одержання -інтерферонів;
– для профілактики та лікування інфекційних захворювань, злоякісних утворювань та імунодефіцитних станів різної етиології;
– для конструювання на основі бактерійних лектинів принципово нових терапевтичних препаратів.
Перелік основних праць, опублікованих за темою дисертації
1. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Лектины бактерий. – К.: Наукова думка, 1992. – 203 с.
2. Коваленко Э.А. Внеклеточные лектины бактерий (обзор) //Микробиол. ж. – 1990. – Т. 52, № 3. – С.92-99.
3. Коваленко Э.А. Аминокислотный и моносахаридный состав внеклеточных сиалоспецифичных лектинов бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. – 1997. – Т. 59, № 5. – С. 3-6.
4. Коваленко Э.А. Углеводная специфичность внеклеточных лектинов бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. – 1997. – Т. 59, № 5. – С. 7-13.
5. Коваленко Э.А. Ферменты, обладающие лектиновыми свойствами //Микробиол. ж. – 1984. – Т. 46, № 2. – С. 65-66.
6. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Влияние факторов внешней среды на биосинтез лектинов Bacillus mesentericus //Микробиол. ж. – 1998. – Т. 50, № 2. – С. 12-16.
7. Коваленко Э.А., Колтукова Н.В., Стрельчина Т.В., Подгорский В.С. Использование крахмалсодержащих сред для культивирования Bacillus mesentericus //Прикладная биохимия и микробиология. – 1988. – Т. 24, № 6. – С. 784-788.
8. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Вьюницкая В.А. Влияние условий культивирования на продуцирование лектинов некоторыми представителями бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. – 1989. – Т. 51, № 5. – С.30-34.
9. Косенко Л.В., Коваленко Э.А. Республиканская конференция “Изучение и применение лектинов” //Микробиол. ж. – 1989. – Т. 51, № 5. – С. 108-110.
10. Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Вьюницкая В.А. Бактерии рода Bacillus – продуценты внеклеточных лектинов //Ученые записки Тартуского ун-та, 869. – 1989. – Т. 1. – С. 72-80.
11. Симоненко И.А., Коваленко Э.А., Подгорский В.С. Лектинпродуцирующая способность Bacillus mesentericus //Ученые записки Тартуского ун-та, 869. – 1989. – Т. 1. – С. 118-123.
12. Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Физиологические аспекты регуляции биосинтеза лектинов бактериями рода Bacillus // Ученые записки Тартуского ун-та, 869. – 1989. – Т. 2. – С. 122-126.
13. Коцоурек Я., Франц Г., Этцлер М., Чакрабарти Р., Джильбоа-Гарбер Н., Коваленко Э.А., Косенко Л.В., Лахтин В.М. Лектины и аспекты их изучения (дискуссия). //Микробиол. ж. – 1990. – Т 52, № 1. – С. 84-90.
14. Косенко Л.В., Коваленко Э.А. II-я Международная конференция по лектинам (ИНТЕРЛЕК-II) //Микробиол. ж. – 1990. – Т. 52, №3. – С. 102-105.
15. Скрипаль И.Г., Малиновская Л.П., Токовенко И.П., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И. Гидрофобная и водород-связывающая хроматография лектинов // Микробиол. ж. – 1992. – Т. 54, №2. – С. 59-65.
16. Zhigis L.S., Ivanov A.E., Rapoport E.M., Kovalenko E.A., Getman E.I., Zubov V.P. Purification of sialic acid binding protein from saprophytic bacteria by hydrophobic-interaction chromatography on butyl-toyoperl and polymer-coated porous glass //Biotechnology Technique. – 1993 (Sept.) – Vol. 7, № 9. – P. 667-670.
17. Валагурова Е.В., Козырицкая В.Е., Шеремет Л.К., Коваленко Э.А. Способность коллекционных культур стрептомицетов образовывать внеклеточные лектины // Микробиол. ж. – 1994. – Т. 56, №4. – С. 11-15.
18. Kishko Ya.G., Kovalenko E.A. New technology on production of animal gamma-interferons //J. Interferon & Cytokine Research. – 1995. – Vol. 15, Suppl. 1. – P. S84.
19. Rapoport E.M., Ivanov A.E., Zhigis L.S., Kovalenko E.A., Getman E.I., Zubov V.P. Purification of lectin ву hydrophobic – interation and size-exlusion chromatography. //IJBS – 1996. – Vol. 2 (1). – P.17-24.
20. Kishko Ya.G., Vasilenko M.I., Podgorsky V.S.,Kovalenko E.A. Lectin of Bacillus subtilis sp. as overinducer of g-interferonogenesis //Микробиол. ж. – 1997. – Т. 59, № 6. – С. 20-26.
21. Kishko Ya.G., Vasilenko M.I., Podgorsky V.S., Kovalenko E.A. Influence of Bacillus subtilis sp. lectin on functional activity on phagocytes //Мікробіол. ж. – 1998. – Т. 60, № 1. – С. 36-42.
22. Ас. СССР SU № 1622397 А1. МКИ С12 Р 19/04. Способ получения бакте-риального лектина, специфичного к сиаловым кислотам /Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А., Лахтин В.М. Заявлено 01.08.88. Опубл. 12.01.91. Бюл. № 3 – 2 с.
23. Ас. СССР SU № 1756357 А1. МКИ С12 Р 19/00. Способ определения молекулярно-массового распределения биологически активных веществ /Воцелко С.К., Иутинская Г.А., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Заявлено 23.12.88. Опубл. 23.08.92. Бюл. № 31 – 14 с.
24. Ас. СССР № 4936807/1341712. МКИ С12 Р 19/04 Способ получения бактериального внеклеточного лектина /Кудря В.А., Симоненко И.А., Захарова И.Я., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Заявлено 15.01.90. Положительное решение 29.09.92.
25. Ас. СССР SU № 1701322. МКИ 5А 61К 45/2. Индуктор g-интерферона /Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Лазоренко Л.В., Симоненко И.А. Заявлено 12.05.91. Опубл. в Бюл. № 48, 1992. – 10 с.
26. Патент України UA № 1791. МКІ 5С 12Р 19/04 Засіб одержання бактерійного лектину, специфічного до сіалових кислот /Підгорський В.С., Коваленко Е.О., Симоненко І.А., Лахтін В.М. Заявлено 10.08.91. Опубл. 20.10.93. Бюл. № 3 – 2 с.
27. Патент України UA № 8276 А. Спосіб виготовлення гама-інтерферону та пристрій для його здійснення /Кішко Я.Г., Іваненко В.К., Думанський В.Д., Коваленко Е.О., Лазоренко Л.В., Селезньов О.В. Заявлено 23.03.94. Опубл. 29.03.96. Бюл. № 1 – 5 с.
28. Патент України № В 4602486/4 (4506). МКІ С12 Р 1/00. Штам Bacillus subtilis – продуцент позаклітинного сіалоспецифічного лектину /В’юницька В.О., Коваленко Е.О., Гетьман К.І. Заявлено 30.06.94. Позитивне рішення 5.03.97.
29. Патент України № 98052626. Індуктор синтезу гама-інтерферону /Підгорський В.С., Кішко Я.Г., Коваленко Е.О., Гетьман К.І. Заявлено 20.05.98. Позитивне рішення 5.11.98.
30. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И. Лабораторный регламент на производство сиалоспецифичного лектина микроорганизма Bacillus subtilis штамм 668 ИМБ. /Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины. – 1993. – 21 с.
31. Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Гамма-бовиферон /ТУ №15 –9.1/17. – 1992. – 17 с.
32. Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Гамма-суиферон /ТУ №16 –9.1/15. – 1992. – 17 с.
Коваленко Е.О. Позаклітинні лектини бактерій роду Bacillus. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 1999.
Дисертацію присвячено поглибленому вивченню позаклітинних лектинів сапрофітних бактерій. У дисертації розроблено новий напрямок в мікробіології, що грунтується на концепції пошуку і застосування в різних галузях біології та медицини принципово нових нешкідливих медикаментозних засобів природного походження.
Проведено розширений скринінг продуцентів позаклітинних лектинів серед бактерій роду Bacillus і встановлена їхня здатність до синтезу лектинів з унікальною специфічністю до сіалових і уронових кислот. Виявлено фізіологічні особливості росту продуцентів і утворення ними позаклітинних лектинів; здійснено спрямований біо-синтез цих метаболітів. Розроблено технологію одержання препаратів та ізоформ бактерійних сіалоспецифічних лектинів. Вивчено їх вуглеводзв’язуючі, гемаглютинуючі, фізико-хімічні та медико-біологічні властивості. Запропоновано можливі сфери застосування цих біополімерів як цінних хіміко-аналітичних та діагностичних реагентів, індукторів g-інтерфероногенезу, імунотропних та протипухлинних засобів. Створено наукові основи для конструювання на базі позаклітинних лектинів сапрофітних бактерій терапевтичних препаратів направленої дії.
Ключові слова: лектини, бактерії, синтез, одержання, вуглеводна специфічність, властивості, застосування.
Коваленко Э.А. Внеклеточные лектины бактерий рода Bacillus. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 1999.
Диссертация представляет собой научную работу, положения и выводы которой создают новое направление в микробиологии: углубленное изучение внеклеточных лектинов сапрофитных бактерий с целью поиска и использования в различных областях биологии и медицины принципиально новых безвредных медикаментозных препаратов природного происхождения.
Проведен расширенный поиск продуцентов внеклеточных лектинов среди представителей спорообразующих аэробных бактерий рода Bacillus, выделенных из различных экологических ниш, и выявлена их способность синтезировать и выделять в среду роста лектины с редко встречающейся специфичностью к сиаловым и уроновым кислотам.
Установлены физиологические особенности роста бацилл и образования ими внеклеточных лектинов: индувидуальность процесса лектинообразования для каждой культуры, ограниченность во времени проявления лектиновой активности в культуральной жидкости, наличие в ней двух периодов активности, максимальное продуцирование лектинов в фазе замедления роста бактерий и разобщенность во времени ростовых и синтетических процессов. Показано, что на лектинсинтезирующие свойства бацилл оказывают значительное влияние характеристики роста бактерий, а также различные факторы внешней среды: температура и время выращивания, состав и рН среды, наличие в ней биостимуляторов и конкретных углеводов. Подбор условий выращивания позволил значительно повысить лектинпродуцирующую способность каждой культуры и осуществить направленный синтез внеклеточных лектинов бактериями.
При сравнительном использовании для очистки сиалоспецифичных лектинов различных методов подобрано несколько, впервые применяемых для этой цели: гель-фильтрацию на сефарозах, хроматографию на TSK гелях и изоэлектрофокусирование в борат-полиольной системе. Эти методы позволили получить препараты лектинов и их изоформы с высокими критериями очистки и сродства к специфичным углеводам; по своим характеристикам очищенные препараты лектинов бацилл соответствуют (а по некоторым – превышают) мировые стандарты сиалоспецифичных лектинов.
Показано, что сапрофитные культуры бацилл способны синтезировать два внеклеточных лектина, которые отличаются между собой по активности, углеводсвязывающим свойствам, химическому составу и физико-химическим характеристикам. Они представляют собой термостабильные, Са2+ – независимые гликопротеины с мМ от 7,7 до 26 кДа, устойчивые к действию рН, детергентов и длительному хранению, способные в очищенном состоянии образовывать крупно-молекулярные агрегаты с мМ до 260 кДа.
Использование более 70-ти моно-, ди- и трисахаридов и природных гликополимеров позволило установить, что исследуемые лектины обладают узкой углеводной специфичностью и проявляют чувствительность только к сиаловым и уроновым кислотам, фруктозо-1,6-дифосфату и обоим аминосахарам. Наибольшее сродство лектины бацилл проявляют к N-гликолилнейраминовой и N-ацетилнейраминовой кислотам и гликоконьюгатам, в которых содержатся оба типа сиаловых кислот или a-изомер О-ацетилированной формы N-ацетилнейраминовой кислоты, связанной с субтерминальным углеводом a2,3-, a2,6- и в меньшей мере a2,8- связями. Высокая степень узнавания строго определенных структур дает возможность утверждать, что внеклеточные лектины бацилл могут с успехом конкурировать с моноклональными антителами (например, при диагностике различных опухолей).
Исследуемые лектины относятся к умеренно и малотоксичным веществам и проявляют выраженные иммунотропные свойства: оказывают значительный противоопухолевый эффект, индивидуальный в отношении опухолей различного генеза, дифференцированно стимулируют отдельные этапы иммуногенеза и иммунного ответа макроорганизма, Т- и В- системы лимфоцитов, являются индукторами синтеза g-интерферона.
Результаты исследований внеклеточных лектинов сапрофитных культур свидетельствуют о том, что эти биополимеры могут быть использованы в качестве высокочувствительных аналитических и диагностических реагентов и эффективных лечебно-профилактических препаратов при иммунодефицитах различной этиологии, в т.ч. инфекционных заболеваний и злокачественных новообразований. Созданы научные основы для конструирования принципиально новых терапевтических препаратов направленного действия с использованием внеклеточных лектинов сапрофитных бактерий.
Ключевые слова: лектины, бактерии, синтез, получение, углеводная специфичность, свойства, применение.
Kovalenko E.A. Extracellular lectins of Bacillus genus bacteria. – Manuscript.
Thesis for a doctor’s degree by speciality 03.00.07 – microbiology. – The Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1999.
The dissertation represents the study of saprophytic bacteria extracellular lectins. A new direction in the microbiology is elaborated and based on the concept of the research and application of the principal new nontoxic natural medical preparations in different regions of biology and medicine.
Broadened screening of extracellular lectin producers are conducted among Bacillus genus bacteria, their ability for synthesis of the lectins with unique specificity to sialic and uronic acids was established. There were shown the physiological peculiarity of the growth and formation extracellular lectins; the direct biosynthesis of these metabolites was realized. The technology of the obtaining of bacterial sialospecific lectin preparations has been developed. Carbohydrate-binding haemagglutinating, physico-chemical and medical-biological properties has been determined. The possible sphere of these biopolymers application as the valuable chemical-analytical and diagnostic reagents, so as inductors of the g-interferonogenesis, immunotropic and antitumoral means were offered. The scientific grounds are created for the construction of the new direct action therapeutic preparations on the basis of the saprophytic bacteria extracellular lectins.
Key words: lectins, bacteria, synthesis, obtaining, carbohydrate specifity, properties, application.
| 
