Отже, виявлена нами фаза агрегації вегетативних клітин як доказ невипадковості існування феномену агрегації мікроорганізмів, могла б бути ще названа фазою припинення поділу клітин і початку підготовки культури до спороутворення. Це так звана “стаціонарна” фаза за загально визнаною термінологією. В наших умовах експерименту використаний термін “стаціонарна” не повністю і не зовсім точно, а лише частково віддзеркалює уявлення про зміст стаціонарної фази, в якій раніше автори бачили тільки рівновагу між розмноженням і відмиранням клітин. Здійснені мікробіологічні дослідження із застосуванням нової, розробленої нами експериментальної технології спостереження за долею клітин у процесі їх розвитку, без сумніву показали, що в наших умовах експерименту це не фаза рівноваги розмноження і відмирання клітин, тому що обидва ці процеси в ній відсутні. Отже, стаціонарність в даному випадку слід розуміти, як якісну стабілізацію без відмирання клітин. Абсолютно такий же характер розвитку відбувався у різний термін спостережень, що свідчить про невипадковий характер зазначених фаз і можливість постійного відновлення цього етапу, навіть після тривалого часу зберігання спор (протягом 25 років).
Після повного завершення агрегації бактерій періодичної культури її подальший розвиток переходив у якісно нову фазу, характерною ознакою якої була диференціація клітин. Аналіз морфології бактерій у зразках засвідчував, що переважним і принциповим процесом на даному етапі розвитку культури є спороутворення, яке здійснювалося в клітинах, об’єднаних в агрегати. Процес спороутворення бактеріальних клітин був динамічний: спочатку у складі агрегатів переважали передспори, потім вони набували рефрактильності і протягом 2-3 годин в усіх клітинах знаходилися дозріваючі спори (див. рис. 1). Зростання та коливання оптичної густини культури на даному етапі розвитку було пов’язане із зміною світлопоглинаючих властивостей клітин, що перебували на різних стадіях спороутворення (див. рис. 2). Після повного дозрівання спор та лізису параспоральних частин спорангіїв (20-24 години культивування) агрегати, які складалися повністю із спорових форм, починали поступово руйнуватися, а оптична густина періодичної культури досягала свого максимуму. Завершення циклу розвитку культури характеризувалося повним руйнуванням агрегатів, після чого культура складалася виключно із зрілих розрізнених спор. Таким чином, встановлено, що розвиток періодичних культур різних видів досліджуваних спороутворюючих бактерій в лімітованому за вмістом пептонів поживному середовищі неодмінно проходитиме фазу агрегації вегетативних клітин з наступною споруляцією їх у складі агрегатів, розпадом агрегатів і переходом життєздатних клітин у стан довготривалого анабіозу.
Динаміка формування агрегатів та розвиток сил міжклітинної взаємодії в процесі агрегації бактерій. Агрегація вегетативних клітин займає центральне місце серед встановлених нами особливостей розвитку періодичних культур різних видів спороутворюючих бактерій. У зв’язку з цим були проведені дослідження , задачею яких було з’ясувати: як швидко і яка доля клітин бактеріальної популяції включається в процес агрегації. Для цього кожні 30 хвилин відбирали зразки культури, що розвивалася в рідкому поживному середовищі, починаючи з фази прискорення темпів розмноження досліджуваних мікроорганізмів, та здійснювали підрахунок клітин в камерах для мікрокультивування бактерій, а також їх фотографування з метою оцінки послідовних змін у взаємному розташуванні мікроорганізмів. Динаміка включення вегетативних клітин в агрегати, на прикладі культури B.cereus 24, в залежності від часу культивування представлена в табл. 1 і на рис.3.
Таблиця 1
Результати вивчення переходу вегетативних клітин в агрегати в залежності
від часу культивування періодичної макрокультури
Рис. 3. Динаміка включення вегетативних клітин спороутворюючих бактерій в агрегати.
А – побудовано на підставі прямих підрахунків клітин в одному полі при застосуванні імерсійної системи; Б – дані табл. 1 враховували загальну кількість клітин в пробі; В – об’ємне зображення динаміки агрегації.
Таким чином, було встановлено, що агрегація вегетативних клітин відбувається протягом досить короткого часу (5-7 годин, в залежності від виду бактерій), якщо враховувати за її початок момент появи морфологічних ознак агрегації, а завершенням вважати час 100 % переходу клітин в агрегати і появи перших ознак споруляції в окремих клітинах. І хоча агрегати ще певний час будуть існувати, проте це вже будуть інші за змістом агрегати, в яких в результаті диференціації все менше залишатиметься вегетативних клітин і переважатимуть їх спорові форми.
У зв’язку з тим, що проміжки між клітинами в процесі агрегації поступово зменшувались, виникло припущення про існування певних сил, які забезпечують міжклітинні зв’язки. Так, у фазі інтенсивного розмноження рухливі клітини після випадкового зіткнення одна з одною, не злипалися, а досить швидко розходились, ніби відштовхуючись. Згодом такі зіткнення призводили до того, що клітини залишались у контакті, втрачаючи рухливість і об’єднуючись у все більші за розміром і різної форми групи. За допомогою фазово-контрастної мікроскопії здійснювали оцінку морфології міжклітинних зв’язків. При світовій мікроскопії та збільшенні в 900 разів між клітинами, об’єднаними в малі агрегати, помітним був певний простір, що могло свідчити про відсутність навіть часткового склеювання в новоутворених з’єднаннях клітин. При досягненні максимальних розмірів агрегатів з поглинанням вільних клітин розмежувальний простір був помітний тільки на периферії агрегатів, де клітини частіше контактували не полюсами, як при народженні, а своїми тілами. В центральній частині агрегатів багатошарове переплетіння клітин не дозволяло дослідити суть контактів, хоч і створювалось враження про досить міцне склеювання клітин.
Для визначення сил міжклітинної взаємодії та динаміки їх розвитку був застосований метод піпетування – руйнування агрегатів шляхом багаторазового їх пропускання через вузький отвір спеціальної мікропіпетки. Ефективність цього методу визначали за оптичною густиною культури до і після такої дії.
Слід визнати, даючи оцінку частини дослідів по з`ясуванню наявності певних сил, що обраний метод не достатньо характеризував процес появи і розвитку міжклітинних контактів. На точність розрахунків суттєво впливав приріст оптичної густини не тільки за рахунок руйнування агрегатів. Нас зацікавили взаємини клітин в самих агрегатах.
Для з`ясування динаміки контактних зв`язків вегетативних клітин в агрегатах різної зрілості довелось клітинну суспензію, в якій формувались агрегати, розділити на фракції, маючи на меті відділити агреговані клітини від вільних форм. Випробувавши кілька методів, ми зупинили свій вибір на фракціонуванні шляхом центрифугування відповідних зразків макрокультури. Агрегати клітин переходили в осад (при певній кількості обертів) значно швидше вільних клітин, які залишались в надосадовій рідині.
Пам`ятаючи про можливий вплив центрифугування на процес агрегації клітин, в контрольних дослідах суспензію таких же клітин (рівнозначної густини) фракціонували, але без ознак агрегації. Контроль за впливом центрифугування на динаміку зв’язків здійснювали мікроскопією зразків. Таким способом одержали кілька фракцій агрегатів з різною кількістю агрегованих клітин, що відповідали різним стадіям процесу агрегації. Кожну фракцію після декантації ресуспензували до повного руйнування агрегатів в нативному поживному середовищі шляхом піпетування. Виявилось, що кожна з фракцій диференціювалась за кількістю проходжень через отвір піпетки (табл. 2).
Таблиця 2
Результати впливу фракціонування і піпетування агрегатів вегетативних клітин
на міцність міжклітинних зв`язків
*-порівняно з контролем різниця не достовірна з вірогідністю в 99 % при n = 670.
Найбільшу кількість піпетувань (670) довелось здійснювати для повного руйнування агрегатів, які об’єднали всі вегетативні клітини (97-100 %). Якщо цю кількість прийняти за 100 % і вважати, що на цей момент сили міжклітинних контактів були найвищими, то за таких умов стає можливим визначити міцність агрегатів у відносних величинах. Так, для руйнування агрегатів четвертої фракції затрачено 58 піпетувань, що становить 8,653 7 1,083 % від максимальної міцності агрегатів.
Дані табл. 2 показують, що в перших двох фракціях агрегованих клітин сили зв’язку між ними були ледь помітними (1,8 і 2,4 %), такими, що достовірно не відрізнялися від контролю. Проте процес формування агрегатів продовжувався, міцність їх поступово (в межах п`яти фракцій) зростала. Різке збільшення міцності агрегатів відбулося в наступних двох фракціях (від 50,746 1,931 до 100%). Цей період характеризувався утворенням максимальних за розмірами агрегатів, які включали від 90 до 100 % вегетативних клітин.
Співставлюючи дві криві (рис. 4), можна помітити, що агрегати вегетативних клітин, досягши максимальних розмірів, продовжували існувати протягом певного часу, зберігаючи стаціонарність. В той час сили міжклітинних зв`язків почали втрачати свою інтенсивність (крива 2 після піку різко знижувалась). Це співпало із диференціацією вегетативних клітин у спорову форму. Розміри агрегатів зберігались до повного завершення споруляції, після чого вони спонтанно і раптово розсипались. Повне руйнування (дезагрегація) агрегатів співпало з втратою сил притягування, які змінились відштовхуванням.
Рис. 4. Співвідношення інтенсивності агрегації (1) і темпів росту міжклітинних зв’язків в агрегатах (2). Графік побудовано за даними табл. 2.
Таким чином, вдалось з’ясувати, що в процесі розвитку спороутворюючих бактерій міняються міжклітинні зв’язки, як за своїм характером, так і силою: на початкових етапах розвитку, коли спори трансформувались у первинні вегетативні клітини і коли останні інтенсивно розмножувались, все більше заповнюючи простір в поживному середовищі, діяли відштовхувальні сили. Зміни в характері сил зв’язку наступили в період завершення експоненціальної фази розвитку. В цей час почало зростати контактне гальмування між клітинами, яке переростало в притягальну силу, об’єднуючи вегетативні клітини в міцні агрегати. Створювалось враження про найвірогідніше призначення об’єднання клітин в агрегати як своєрідні генетично обумовлені морфологічні структури, в яких здійснювався процес спороутворення. На таку думку наводила і та обставина, що як тільки завершилась фаза споруляції, змінився і характер міжклітинних зв’язків в агрегатах. Повне і швидке руйнування агрегатів, суцільне 100 % вивільнення спорових форм клітин із агрегатів, переконливо засвідчувало про закінчення функції агрегатів, про відсутність потреби в них у подальшій долі культури, а, отже, і в подальших затратах енергії на підтримку міжклітинних сил взаємодії. Наведені факти переконливо вказували на невипадковість явища агрегації клітин, як самостійного, фізіологічного періоду розвитку бацил.
Виникло дуже важливе питання про природу міжклітинних зв`язків, виявлених у процесі розвитку культури. Наведені нижче дані частково дадуть можливість наблизитись до отримання відповіді на поставлене питання.
Електрофоретичні дослідження поверхневих біополімерів клітинної стінки та полімерів культуальної рідини в процесі агрегації бактерій. У процесі агрегації бактерій виникають тісні міжклітинні контакти, міцність яких має свою динаміку розвитку. Тому, мабуть, важливе значення у формуванні агрегатів, а також і в їх розпаді можуть мати біополімери поверхневих шарів клітинних стінок (КС). Крім того, не виключено, що певне значення у цьому процесі відіграють розчинні полімери, які потрапляють у культуральну рідину (КР) на різних фазах розвитку періодичної культури. У зв’язку з цим була проведена серія експериментів з метою дослідження поверхневих біополімерів клітинних стінок, а також розчинних полімерів культуральної рідини на різних фазах розвитку періодичної культури.
Для характеристики та реєстрації змін, які відбуваються у складі клітинних стінок бактерій під час періодичного культивування, поверхневі біополімери КС одержували із інтактних клітин B.cereus 24 на різних фазах розвитку. Водночас, матеріалом для дослідження була культуральна рідина після осадження бактеріальних клітин. Вибраний нами час відбору зразків клітинної біомаси та КР (0,5; 1,5; 2; 4; 5; 6,5; 8; 11; 14; 18 та 24 години культивування) репрезентував усі фази розвитку культури під час проходження макроциклу. В результаті проведеного аналізу було показано, що одержані зразки містили білкові та вуглеводні компоненти в кількості, достатній для подальших електрофоретичних досліджень (табл. 3).
Таблиця 3
Вміст білкових та вуглеводних компонентів у препаратах поверхневих біополімерів клітинних стінок (КС) і біополімерів культуральної рідини (КР) B.cereus 24
Електрофоретичні дослідження одержаних препаратів поверхневих біополімерів КС показали, що на стадії проростання спор у зразках практично відсутні біополімери як білкової, так і змішаної природи. Виключення становили декілька низькомолекулярних компонентів, які були ідентифіковані у слідовій кількості при фарбуванні гелей нітратом срібла, з ММ 20,0; 19,0; 17,0; 16,0; 15,5; 15,0; 14,4; 14,2; 13,0 12,5 і 12,2 кДа. Для стадії початку та завершення утворення вегетативних клітин характерне поступове збільшення поверхневих компонентів, хоча більшість із них виявляли в препаратах у незначній кількості.
У експоненціальній фазі розвитку B.сereus 24 відбувався активний синтез поверхневих компонентів КС. Деякі з них під час росту бактерій виділялися в культуральне середовище, хоча більша частина залишалася асоційованою з клітинною стінкою. У препараті, який було одержано з клітин цієї фази, при застосуванні обох способів фарбування ідентифікували максимальну кількість біополімерів (> 50). При фарбуванні гелів кумасі блакитним були ідентифіковані мінорні білки з ММ 85,0; 80,0; 75,0; 72,0; 65,0; 62,0; 60,0; 58,0; 46,0; 45,0; 44,0; 43,0; 40,0; 38,0; 35,0; 34,0; 33,0; 32,0; та 30,0 кДа та значна кількість низькомолекулярних компонентів. Характерною особливістю цієї фази розвитку є відсутність у зразках високомолекулярних білків з ММ 130,0; 122,0 і 110,0 кДа, а замість комплексу, утвореного мажорними білками 60,0 і 58,0 кДа, нами були ідентифіковані 3 мінорні компоненти з ММ 62,0; 60,0 і 58,0 кДа.
Починаючи із фази агрегації у B.cereus 24 зареєстровано суттєві зміни складу поверхневих біополімерів. Якщо фазі експоненціального росту був притаманний активний синтез практично всіх ідентифікованих поверхневих компонентів, то фаза агрегації характеризувалась їх вибірковою секрецією. Зокрема, у зразках виявляли мажорні компоненти з ММ 94,0; 60,0; 58,0 і 26,0 кДа, а також декілька біополімерів змішаної природи з ММ 25,0; 23,0; 19,5; 18,5; 18,0; 17,5; і 15,5 кДа. Особливістю фази агрегації була наявність у зразках мінорних білків з ММ 72,0 і 70,0 кДа, синтез яких, очевидно, пов’язаний із агрегацією клітин, оскільки вони найкраще представлені у препаратах цієї фази, насамперед, білок з ММ 70,0 кДа. Перехід B. cereus у стадію визрівання спор в агрегатах та інтенсивного лізису параспоральних частин спорангіїв також супроводжувався незначними змінами складу та ступеня вираження поверхневих біополімерів.
Фаза зрілих спор, як і фаза проростання спор характеризувалась найменшою кількістю біополімерів, які виявляли у досліджених зразках. У препараті, одержаному із клітин цієї фази, у слідовій кількості із раніше ідентифікованих були зареєстровані біополімери з ММ 48,0; 26,0; 18,5; 18,0 та 12,2 кДа, а також два нових мінорних компонента з розрахунковими молекулярними масами 130,0 і 122,0 кДа.
Дослідження полімерів культуральної рідини (КР) дозволили встановити вже на початкових фазах росту B. сereus 24 наявність у КР мінорних білків, не асоційованих з клітиною, з ММ 97,0; 94,0; 82,0; 75,0; 62,0; 60,0; 58,0; 56,0; 55,0; 52,0; 50,0; 48,04 46,0; 35,0 та 27,0 кДа. Необхідно підкреслити, що більшість із вказаних мінорів практично не виявляли у зразках КР на більш пізніх фазах розвитку при фарбуванні гелів кумасі блакитним. Крім того, у цих зразках ідентифікували компоненти змішаної (глікопротеїдної) природи, специфічні для певних фаз розвитку.
Фаза початку та підсилення агрегації супроводжувалась появою в КР мажорних компонентів з ММ 62,0; 58,0; 52,0; 48,0; 41,0 та 33,5 кДа. Слід зауважити, що біополімери з ММ 62,0; 58,0, 52,0 та 48 кДа як мінорні були виявлені також і в інших зразках КР, тому їх ми вважаємо “супутніми” для фази агрегації. Особливістю даного періоду розвитку був синтез глікопротеїдів з ММ 41,0 і 33,5 кДа, які, безумовно, можуть бути віднесені до тих специфічних розчинних компонентів, що синтезуються клітинами B. сereus саме у фазі агрегації.
За результатами аналізу зразків КР та наявності характерних біополімерів макроциклічний розвиток B. cereus можна розділити на 4 періоди. Перший період розвитку бацил пов’язаний з фазами проростання спор, набухання та інтенсивного лізису параспоральної частини спорангію і утворення спор. Він супроводжувався секрецією у культуральне середовище біополімерів, здебільшого, змішаної природи з ММ 34,0; 33,0; 30,0; 27,0; 26,0; 23,0 і 21,5-19,5 кДа. Другий період агрегації бактерій включав фази початку, підсилення та максимальної агрегації вегетативних клітин і характеризувався наявністю двох специфічних біополімерів з ММ 41,0 і 33,5 кДа та супутніми компонентами (ММ 62,0; 58,0; 52,0; 48,0; 38,0 і 35,0 кДа). Третій період був “перехідним” між стадією агрегації вегетативних клітин B. сereus та утворенням і визріванням спор в агрегатах, оскільки містив біополімери спільні для вказаних стадій макроциклу. Четвертий період спороутворення включав дві фази – дезагрегації спор та зрілих спор поза агрегатами. Цей період розвитку бацил характеризувався практично повною відсутністю специфічних біополімерів.
Таким чином, аналіз зразків КР дозволив встановити у B. cereus існування розчинних біополімерів, які приурочені до певних фаз розвитку. Для фази агрегації специфічними були біополімери з ММ 41,0 і 33,5 кДа. Враховуючи те, що після агрегації бактерії активно приступали до споруляції, можна припустити, що вказані специфічні біополімери здатні відігравати роль індукторів спорогенезу.
Електронно-мікросокпічні дослідження структури агрегатів клітин спороутворюючих бактерій. Бактеріальні спори в растровому електронному мікроскопі (РЕМ) мають вигляд світлих круглястих та злегка подовжених утворень з гладенькою поверхнею та маленькими виростами, розташованими, переважно на полюсах і добре помітних при збільшені в 60 000 разів. Через півтори години культивування, після остаточного набухання, оболонки спор розривались і з них виростали первинні вегетативні клітини, які в РЕМ, на відміну від спор, мали вигляд подовжених темних утворень. Оболонка спори у вигляді ковпачка іноді залишалася прикріпленою до полюса первинної вегетативної клітини (рис. 5 ).
Рис.5. Розвиток періодичної культури В.subtillis 83
1 – спори в стані спокою; 2 – проростання спор; 3 – вегетативні клітини (експоненціальна фаза); 4, 5, 6 – агрегати вегетативних клітин (стаціонарна фаза); 7, 8, 9 – дезагрегація спор.
Растрова електронна мікроскопія, х10000.
Експоненціальна фаза росту періодичної культури починалася через 2,5-3,0 години й продовжувалася протягом 2-3 годин. В цей час культура складалася майже на 100 % із вегетативних форм, розташованих переважно поодинці, а іноді короткими ланцюжками. Через 5,5-6 годин культивування в РЕМ було видно, що вегетативні клітини починали групуватися, прилягаючи одна до одної по поздовжній осі. Спочатку такі групи, тобто агрегати, складалися із 2–3–5 клітин, а незабаром їх кількість досягала вже кількох десятків. На 10 годині агрегати набули своїх максимальних розмірів, в них були об’єднані кілька сотень клітин. На поверхні агрегатів було чітко видно, що окремі клітини не випадково наближалися одна до одної, а вступали в міцний контакт, нібито зливаючись своїми оболонками, переважно не залишаючи між собою вільного простору (рис. 6). В стані агрегації досліджувані мікроорганізми знаходилися досить тривалий час (15 годин), і цей період, безумовно, можна характеризувати як стаціонарну фазу розвитку. Після дванадцятої години культивування спочатку в окремих клітинах, а потім і в інших утворювалися світлі ділянки. Ще через кілька годин в таких місцях можна було побачити чітко оформлені спори. При цьому параспоральні частини клітин залишалися темними. Поступово темні ділянки клітин зникали, а агрегати складалися із суцільних спор, які ще міцно контактували між собою. Після завершення дозрівання спор поступово почалося роз’єднання клітин агрегатів, тобто наступив зворотній процес – дезагрегація мікроорганізмів (рис. 5).
Рис. 6. Агрегати вегетативних і спорових форм бактерій роду Bacillus.
Різні за розмірами агрегати вегетативних клітин В.cereus 8035 (1, 3, 4) та В.subtilis 83 (2); агрегати спор та окремі спори B.mesentericus AB-56 (5, 6).
Растрова електронна мікроскопія, х3000–60000.
Підтвердженням цього було те, що досліджувані проби складалися майже на 100 % із форм клітин у стані спокою, розташованих на значній відстані одна від одної. Таким чином, вивчення періодичних культур спороутворюючих бактерій в РЕМ остаточно підтвердило, що вегетативні клітини неодмінно і невипадково об’єднуються в агрегати, саме в агрегованих клітинах відбувається спороутворення, а після його завершення наступає дезагрегація спор.
Рентгеноспектральний аналіз іонного складу бактеріальних клітин у різні фази розвитку періодичної культури. Дослідження вмісту окремих елементів в клітинах спороутворюючих бактерій на різних фазах розвитку періодичної культури здійснювали за допомогою рентгеноспектрального аналізатора в комплексі РЕМ-РМА, де РЕМ – растровий електронний мікроскоп фірми YEOL YSM 845, а РМА – система Link Analytical M-2000. Спектри
якісного хімічного складу об’єкта дослідження реєстрували в двох точках: в скупченні однорідних клітин (метод “площі”) і в поодинокій клітині (метод “точки”). Про вміст окремих елементів судили на основі порівняння відношення висоти піків, які відповідають числу одиниць імпульсів, генерованих пучком електронів, що попадають на детектор рентгенівського випромінювання з даного зразка дослідження.
Встановлено, що в процесі періодичного культивування В. cereus 24, B.mesentericus AB-56, B.megaterium H вміст хімічних елементів суттєво змінювався в залежності від фази їх розвитку. Так, у фазі проростання спор досліджуваних видів бактерій відбувалася значна втрата клітинами катіонів кальцію (табл. 6, рис. 7), хлору, фосфору.
Таблиця 6
Зміна вмісту кальцію в окремих клітинах В. mesentericus АБ-56 у процесі розвитку періодичної макрокультури від спори до спори через фазу агрегації вегетативних клітин
В експоненціальній фазі розвитку В. cereus 24 відзначено зниження показників вмісту натрію та інтенсивне поглинання бактеріальними клітинами катіонів калію (рис.8) фосфору та кисню, які необхідні для підтримання обмінних, окислювально-відновлювальних процесів та утворення енергетичних сполук. Вказані тенденції змін спектрів вмісту даних елементів в експоненціальній фазі розвитку спостерігали і при дослідженні інших штамів спороутворюючих бактерій.
Процес агрегації вегетативних клітин спороутворюючих бактерій В. cereus 24 супроводжувався підвищенням показників вмісту фосфору (рис.9) калію, хлору, сірки, що беруть участь у синтетичних та енергетичних процесах клітин. Такі закономірності змін спектрів вмісту названих елементів спостерігали і при дослідженні періодичних культур В. megaterium H та B.mesentericus AB-56. У фазі спороутворення періодичної культури бактерій роду Bacillus відзначено зниження спектрів вмісту калію, сірки та значного підвищення показників вмісту кальцію, натрію та хлору. Тенденція інтенсивного накопичення катіонів кальцію на етапі спороутворення простежувалася на прикладі всіх досліджених представників бактерій із роду
Рис. 7. Динаміка вмісту кальцію в клітинах B.mesentericus AБ-56 за даними рентгеноспектрального мікроаналізу в залежності від фази розвитку макрокультури.
А – метод “площі”, Б – метод “точки”.
Рис. 8. Динаміка вмісту калію в клітинах B.cereus 24, визначеного методом “площі” (А) і “точки” (Б).
Рис. 9. Динаміка вмісту фосфору в клітинах B.megateriun H в залежності від тривалості культивування (в годинах) за результатами рентгеноспектрального мікроаналізу.
А – метод “площі”, Б – метод “точки”.
Bacillus. Встановлений факт підтверджував важливе значення катіонів кальцію у формуванні високої резистентності спорових форм бактерій та в підтриманні стану анабіозу.
Таким чином, завдяки застосуванню сучасного високочутливого методу рентгеноспектрального мікроаналізу вдалось встановити суттєві зміни хімічного складу спороутворюючих бактерій на різних фазах розвитку періодичної культури. Характерним було і те, що коливання рівнів певних іонів для одних видів мали схожі показники, а для інших – індивідуальні. Найбільше співпадання динаміки змін іонного складу було характерне для фази агрегації бактеріальних клітин.
Управління розвитком спороутворюючих мікроорганізмів. У зв’язку з тим, що після агрегації бактеріальні клітини періодичної культури приступають до якісно нового етапу розвитку – спороутворення, важливим було, на наш погляд, дослідити такі взаємовідношення між клітинами, які мають регуляторні функції. Простіше кажучи, як впливають одні клітини на інших, який результат цих впливів на подальший розвиток та диференціацію клітин.
Для цього нами була розроблена мікробіологічна модель для дослідження впливу одних клітин на інші, суть якої полягала в тому, що окремі бактеріальні клітини, будучи певним чином іммобілізовані на блоках камери для мікрокультивування бактерій, ізольовані від контакту з іншими клітинами популяції, яка вводиться в міжблочний простір камери і, таким чином знаходиться в їх безпосередньому оточенні. В такій системі взаємодія між одиничними ізольова-ними бактеріями та гомологічною культурою певної фази розвитку могла здійснюватись завдяки екзогенним факторам, які виділяються клітинами культури в середовище.
Принципова схема цієї серії експериментів полягала в тому, що ізольовані в камері спори пророщували в поживному середовищі, доводячи їх до різних стадій розвитку клітин, – активації, ініціації, набухання, елонгації, утворення первинної вегетативної клітини та її поділу. На різних стадіях розвитку ізольованих клітин здійснювали заміну поживного середовища (умовно – індуктор вегетації) в камері на гомологічну культуру (умовно – індуктор споруляції), що знаходилася в фазі максимальної агрегації клітин та переходу до споруляції.
В результаті, на різних видах бацил було встановлено (схематичне зображення на рис.10), що гомологічна культура у фазі агрегації (індуктор споруляції) зупиняє вегетацію ізольованих клітин і підпорядковує їх диференціацію в такому напрямку, в якому відбувається її розвиток, тобто в напрямку активної споруляції. Характер життєвого циклу “від спори до спори” визначався конкретною стадією проростання первинної спори, під час якої відбувалася заміна “сигнала” вегетації на “сигнал” споруляції (див. рис. 4). Сприймаючи “сигнал” гомологічної культури, досліджувані клітини, в залежності від стадії проростання, в якій вони перебували на час введення індуктора споруляції, продовжували свій розвиток або по типу мікроциклу (від спори до
Рис. 10. Схема управління розвитком спороутворюючих бактерій з використанням дії індуктора споруляції на різних стадіях проростання спори та утворення первинної вегетативної клітини.
ІВ – індуктор вегетації; ІС – індуктор споруляції; СС – спора в стані спокою; А – активація; І – ініціація; Н – набухання; Е – елонгація; В – виростання; ПВК – первинна вегетативна клітина; ПС – передспора; С – спора; ЛСП – лізис пароспоральних частин спорангіїв.
спори, без поділу первинної вегетативної клітини), або за типом макроциклу з різною інтенсивністю розмноження первинних вегетативних клітин та їх подальшим спороутворенням.
Таким чином, в результаті досліджень на різних видах спороутворюючих мікроорганізмів було встановлено, що бактеріальна культура у фазі агрегації, підпорядковує диференціацію інших клітин саме в такому напрямку, в якому відбувається її розвиток. Найбільше вірогідно, що факторами регуляції розвитком в даному випадку виступають розчинні полімери, а саме: специфічні (як було показано вище для цієї фази глікопротеїди з ММ 41,0 та 33,5 кДа). В таких умовах напрямок розвитку бактеріальної клітини та його результат буде залежати від того, на якій стадії її онтогенезу подавати “сигнал” на диференціацію. Проведені дослідження показали також і те, що в циклі розвитку бактеріальної клітини існують певні стадії, коли її геном здатний чи не здатний сприймати “сигнали” на вегетацію або на споруляцію. Такі стадії нами були визначені, завдяки чому стало можливим управляти розвитком бактеріальної клітини в тому чи іншому напрямку. І ще одна важлива, на наш погляд, закономірність, яка стосується гетерогенності властивостей бактеріальних клітин. Так, в умовах регулюємого розвитку характерним для мікроорганізмів є синхронність у відповіді на регулюючі “сигнали”, а значить і синхронність в подальшому розвитку. І навпаки, якщо популяція мікроорганізмів залишається без зовнішніх втручань, то процеси розвитку в ній характеризуються виключною асинхронністю та гетерогенністю. Вершина гетерогенності властивостей бактерій щодо їх розвитку, проявляється в тому, що процеси вегетації та спороутворення в мікропопуляціях клітин, які знаходяться в абсолютно однакових умовах, можуть здійснюватися одночасно.
ВИСНОВКИ
В роботі вирішено актуальну наукову проблему – визначені закономірності розвитку спороутворюючих мікроорганізмів роду Bacillus, встановлена здатність різних їх видів утворювати клітинні агрегати, в яких відбувається диференціація бактерій, визначені фазові зміни властивостей досліджуваних мікроорганізмів на клітинному та популяційному рівнях, показане значення певних мікробних біополімерів у становленні та формуванні міжклітинних зв’язків, з’ясовані періоди компетентності до сприймання регуляторних факторів в онтогенезі бактеріальної клітини, що дало можливість спрямовано впливати та змінювати стадії розвитку і диференціації клітин у певному напрямку.
- Встановлено, що в процесі розвитку різних видів бактерій роду Bacillus вегетативні форми здатні об’єднуватися у багатоклітинні агрегати. В оптимальних для споруляції умовах розвиток періодичної культури спороутворюючих бактерій складається з наступних послідовних фаз: проростання спор, утворення первинних вегетативних клітин, експоненціального їх розмноження, початку агрегації, максимальної агрегації, споруляції агрегованих клітин, дозрівання спор в агрегатах, лізису параспоральних частин спорангіїв, дезагрегації спор, анабіозу бактеріальної популяції.
- Виявлена динаміка зміни сил міжклітинних взаємодій від початку агрегації до її повного завершення та наступної дезагрегації клітин. Процес формування агрегатів характеризується послідовною зміною сил міжклітинної взаємодії: спочатку вони зростають, досягають максимуму, потім зменшуються і повністю зникають. Існує зв’язок між зростанням сил міжклітинної взаємодії та утворенням специфічних для цієї фази розвитку білків поверхневих шарів клітинних стінок (молекулярна маса 70,0-72,0 кДа).
- Визначена морфологія бактеріальних клітин та їх взаєморозташування на всіх етапах агрегації. Електронно-мікроскопічними дослідженнями встановлено, що агрегація вегетативних клітин виникає в результаті щільного контакту їх боковими поверхнями (по поздовжній осі) з наступним злиттям поверхневих шарів клітинних стінок. Між бактеріями по завершенні спороутворення в складі агрегату та лізису параспоральних частин спорангіїв втрачаються попередні зв’язки та наступає дезагрегація клітин. Взаєморозташування бактеріальних клітин пов’язано з тим, що після поділу між ними зберігаються або зникають міжклітинні зв’язки поверхневими шарами клітинних стінок.
- Показано важливе значення мікробних екзогенних біополімерів у розвитку процесів клітинної диференціації. На початкових етапах агрегації бактеріальні клітини синтезують специфічні для даної фази розчинні біополімери, а культура саме у цій фазі розвитку індукує спорогенез у інших вегетуючих клітин. На підставі біохімічних та електрофоретичних досліджень встановлено, що вказані біополімери мають глікопротеїдну природу з молекулярною масою 41,0 та 33,5 кДа.
- Доведено, що агрегація бактеріальних клітин – закономірний процес, який має важливе значення у розвитку бактеріальної популяції. Агрегація бактеріальних клітин розглядається як найбільш ранній еволюційний механізм формування міжклітинної взаємодії. Агрегація забезпечує найкращу компетентність бактеріальних клітин для реалізації міжклітинних взаємодій, їх захист в складі агрегатів від зовнішніх впливів і створює умови для диференціації клітин та індукції спорогенезу.
- Вперше одержані дані про зміну вмісту хімічних елементів на різних фазах розвитку мікробної клітини. Методом рентгеноспектрального мікроаналізу хімічного складу бактерій роду Bacillus встановлено, що вміст калію, натрію, кальцію, хлору, сірки, фосфору та кисню суттєво змінюється в окремих клітинах на різних фазах розвитку періодичної культури. Під час проростання спор відбувається втрата клітинами більшості елементів, утворення агрегатів вегетативних клітин супроводжується накопиченням калію, хлору, сірки та фосфору, що беруть участь у синтетичних та енергетичних процесах клітин.
- Вперше експериментально встановлено, що бактеріальні спори при зберіганні в лабораторних умовах протягом більше 25 років не втрачають життєздатність та характерні для кожного виду мікроорганізмів властивості. Клітини періодичної культури, що розвиваються із спор після довготривалого зберігання, здатні до агрегації. В процесі довготривалого анабіозу зростає асинхронність проростання спор та виростання первинних вегетативних клітин. Час генерації при цьому не змінюється.
- Вперше об’єктивно доведено, що в бактеріальних популяціях процеси вегетації та споруляції можуть відбуватися одночасно. На всіх етапах розвитку бактеріальної популяції встановлена гетерогенність властивостей окремих її особин: спори проростають, а первинні вегетативні клітини утворюються асинхронно, процеси вегетації та спороутворення відбуваються одночасно в однакових умовах середовища, в популяції клітин в стані спокою завжди існують поодинокі вегетативні форми, здатні до криптичного росту. Гетерогенність розвитку, як еволюційно сформована і генетично детермінована властивість, має важливе значення для виживання бактерій у природних умовах існування.
- Створена мікробіологічна модель для дослідження регуляторних механізмів розвитку окремих бактеріальних клітин, використання якої дозволило встановити наступні закономірності: явище агрегації клітин різних видів умовно патогенних спороутворюючих бактерій; можливість спорогенезу під впливом індукторів споруляції в умовах середовища, де без них відбувається вегетація; визначені фази в онтогенезі бактеріальної клітини, коли вона сприймає або не сприймає зовнішні регуляторні сигнали, що дало можливість змінювати стадії її розвитку в певному напрямку; одержані дані, що підтверджують гіпотезу існування у бактерій материнської клітини.
|
