АННОТАЦИЯ
Овчаренко О. А. Получение межтрибных соматических гибридов семейства Brassicaceae, содержащих активную гетерологическую систему транспозонов кукурузы Spm/dSpm. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2005.
В диссертационной работе предложен новый подход к созданию системы, пригодной для исследования межгеномной транспозиции мобильных генетических элементов растений с использованием транспозона кукурузы Spm/dSpm. Суть подхода состоит в создании межтрибных соматических гибридов между Arabidopsis thaliana L. – модельным объектом генетических исследований, чей геном сиквенирован на сегоднешний день, и рядом культурных (Brassica juncea (L.) Czern & Coss., B.napus L.) и дикорастущих (Orychophragmus violaceus (L.) O.E. Schulz.) видов семейства Brassicaceae. Использование Arabidopsis thaliana, трансформированного вектором, содержащим гетерологическую систему транспозонов Spm/dSpm, а также гены npt II, bar, gusА даст возможность исследовать активность мобильных генетических элементов в таких гибридах. При отдаленной соматической гибридизации возможна транспозиция мобильного генетического элемента с одного генома на другой и последующая утрата хромосом вида-донора с сайтом первичной интеграции транспозона, содержащего источник транспозазы. Перемещение мобильного элемента можно проследить по сохранению в геноме реципиента трансгена (bar), окруженного последовательностями транспозона, и отсутствию других трансгенов (npt II, gusА, SpmTPase), элиминируемых вместе с геномом вида-донора.
В ходе нашей работы с помощью метода соматической гибридизации были получены межтрибные гибриды в следующих видовых комбинациях: B.napus+A.thaliana, B.juncea+A.thaliana, O.violaceus+A.thaliana, O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana). Три последние гибридные комбинации получены впервые. На примере соматических гибридов O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana) нами была обнаружена возможность регенерации растений при объединении четырех геномов: O.violaceus, A.thaliana и B.nigra с B.campestris, составляющих геном B.juncea. Гибридное происхождение полученных растений было доказано с помощью морфологического, ПЦР-ПДРФ, RAPD и изоферментного анализов. Хотя при создании гибридов нами не были использованы специальные методы способствующие элиминации генетического материала A.thaliana, полученные растения B.napus+A.thaliana, B.juncea+A.thaliana и O.violaceus+A.thaliana были морфологически подобны B.napus, B.juncea и O.violaceus, соответственно. Гибриды O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana) имели промежуточные морфологические признаки B.juncea и O.violaceus. Молекулярно-биологический и изоферментный анализы показали, что, несмотря на схожесть с видом-реципиентом, у гибридов не происходило полной элиминации генетического материала арабидопсиса. Для исключения возможной химерности растений было проведено длительное расхимеривание путем культуры протопластов, либо черенкования, которое показало, что полученные растения были истинными гибридами.
Для более полной характеристики полученых гибридов был проведен анализ ДНК органелл. Показано, что во всех проанализированных гибридных комбинациях сохранялся пластом только одного из родителей: пластом A.thaliana не был унаследован ни одним из гибридов. Наследование митохондриона происходило случайным образом, как от одного, так и от другого родительского вида.
Нами было показано, что при межтрибной соматической гибридизации селективный ген (bar), транспозирующийся за счет транспозазы вида-донора, сохранялся в гибридах, фенотипически схожих с видом-реципиентом. Хотя селекцию гибридных растений проводили только с использованием фосфинотрицина, все полученные растения были устойчивыми как к фосфинотрицину, так и к канамицин-сульфату благодаря перенесенным от A.thaliana трансгенам. Активность β-глюкуронидазы, являющаяся маркером активности мобильного генетического элемента была обнаружена в гибридах B.napus+A.thaliana, B.juncea+A.thaliana и O.violaceus+A.thaliana и отсутствовала в растениях O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana). Однако, ПЦР анализ показал сохранение всех трансгенов и в этих гибридах.
С помощью гистохимического определения активности gusA гена нами впервые была показана активность гетерологической системы мобильных генетических элементов кукурузы Spm/dSpm в межтрибных соматических гибридах B.juncea+A.thaliana, B.napus+A.thaliana, O.violaceus+A.thaliana.
Ключевые слова: межтрибная соматическая гибридизация, Brassicaceae, Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, B.napus, Orychophragmus violaceus, гетерологическая система транспозонов Spm/dSpm.
SUMMARY
Ovcharenko O.O. Production of intertribal somatic hybrids with active heterologous maize transposable element Spm/dSpm within the Brassicaceae family. – Manuscript.
Thesis for PhD degree (Biology) by speciality 03.00.20 – biotechnology. – Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Science, Kyiv, 2005.
The thesis is devoted to production of a system for investigation of intergenomic transposition using maize transposable element Spm/dSpm. Approach is based on production of intertribal somatic hybrids between a model object of genetic studies Arabidopsis thaliana L., transformed with heterologous maize transposable element Spm/dSpm and some cultivated (Brassica juncea (L.) Czern & Coss., B.napus L.) or wild species (Orychophragmus violaceus (L.) O.E. Schulz.) from Brassicaceae, for further investigation of Spm/dSpm activity. We have produced such combinations of intertribal somatic hybrids: B.napus + A.thaliana, B.juncea + A.thaliana, O.violaceus + A.thaliana, O.violaceus + (B.juncea + A.thaliana). The last three of them were produced for the first time. In somatic hybrids O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana) we found opportunity to regenerate plants when four genomes are combined: O.violaceus, A.thaliana and B.nigra with B.campestris, which form genome of B.juncea. Hybrid nature of obtained plants was confirmed by morphology, PCR-RFLP, RAPD and analysis of isozymes. There was no complete elimination of A. thaliana genetic material in hybrids and transgenes were stably maintained. It was demonstrated that selective gene (bar), transposed by Spm-transposase of donor species have been maintained in hybrids similar phenotypic to recipient species. In all analyzed hybrid combinations plastome was inherited only from one of the parents while origin of mitochondrion was casual. Activity of heterologous maize transposable element Spm/dSpm in intertribal somatic hybrids B.juncea+A.thaliana, B.napus+A.thaliana, O.violaceus+A.thaliana have been shown for the first time.
Key words: intertribal somatic hybridization, Brassicaceae, Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, B.napus, Orychophragmus violaceus, heterologous maize transposable element Spm/dSpm.
Автор висловлює глибоку вдячність своєму керівнику д.б.н. Кучуку М.В. за підтримку і увагу, проявлені при виконанні дисертаційної роботи. Висловлюю щиру подяку к.б.н. Комарницькому І.К. та Черепу М.Н. за допомогу у проведенні аналізів. Висловлюю величезну вдячність всім співробітникам відділу генетичної інженерії ІКБГІ НАНУ за розуміння, підтримку та цінні поради при обговоренні результатів роботи та її написанні. Особливу вдячність висловлюю своєму чоловіку і колезі к.б.н. Рудасу В.А.
| 
