Библиотечный каталог авторефератов Украины

Використання кондуктометричних біосенсорів для аналізу реальних зразків

Аналіз концентрацій глюкози в сироватці крові щурів

Як об’єкти дослідження брали сироватку крові щурів з Чорнобильскої зони відчуження. Контрольні визначення глюкози в крові проводили по стандартній методиці з використанням ферментного набору «Діаглюк» Львівського підприємства лікарських препаратів (м.Львів, Україна) та за допомогою аналізатора «Ексан-Г» (Латвія).

Для визначення концентрацій глюкози біосенсорним методом використовували частину калібрувальної кривої до 1,5 мМ у модельному розчині, що відповідало 60 мМ глюкози в нерозведеній сироватці (розведення в 40 разів).

Ефективність проведення аналізів глюкози в сироватці крові за допомогою біосенсора була перевірена з використанням методу стандартних додавань. На рис. 12 приведені порівняльні криві для вимірювань, отриманих за допомогою біосенсору та набору «Діаглюк». З рисунку видно, що у випадку визначення концентрації глюкози за допомогою біосенсора ми маємо майже 100% узгодження даних (фактор лінійності 1,03, похибка визначення 3%) на відміну від визначень за допомогою «Діаглюка» (фактор лінійності 0,88, похибка визначення 12%). Це свідчить про високий ступінь точності для вимірювань з використанням біосенсору. Екстраполяція ж кривої на вісь х дає значення концентрації глюкози в пробі (без штучного додавання глюкози).

       На рис. 13 показано порівняльні результати аналізу глюкози в сироватці крові щурів, отримані за допомогою трьох різних методів. З рисунку чітко видно кореляцію даних. Краще співпадання відмічається для результатів, отриманих за допомогою біосенсора та «Ексану-Г», що може бути пов’язано з однаковими принципами формування відгуків. У випадку набору «Діаглюк» (фотометричний метод) може мати місце вплив забарвлення зразків на результати аналізів.

Рис. 12. Порівняльні криві визначення глюкози в сироватці крові за допомогою кондуктометричного біосенсору та ферментного набору «Діаглюк».

Рис. 13. Порівняльні результати аналізів, отримані за допомогою різних методів.

       Кількісна оцінка кореляції даних, отриманих за допомогою трьох методів в 29 різних пробах сироватки крові щурів показала високе співпадання результатів, отриманих за допомогою кондуктометричного біосенсора та аналізатора «Ексан-Г» (коефіцієнт кореляції - 2,2 %).

       Біосенсори демонстрували операційну стабільність протягом 48 годин роботи, що дозволяло провести 200-300 вимірів глюкози в реальних зразках на одному датчику.

Аналіз концентрацій глюкози в культуральних рідинах

Контроль і оптимізація процесів виробництва біологічно-активних препаратів вимагає швидкої та відтворюваної інформації про концентрацію субстратів та продуктів, а також про концентрацію мікроорганізмів і їх фізіологічний стан (клітинна маса, поглинання С-джерела (глюкоза), стан N-джерела (амоній та амінокислоти) тощо). Тому було проведено експерименти по застосуванню розробленого біосенсора для визначення концентрацій глюкози в культуральних рідинах.

Культуру клітин мікроорганізмів Klebsiella оxitoca вирощували в споживному середовищі LB з добавленням 40 мМ глюкози протягом доби при температурі 37°С при постійному перемішуванні та періодично відбирали проби для контролю рівню глюкози в середовищі. Порівняльні результати аналізів, отримані за допомогою двох методів вимірювання (біосенсорний і класичний фотометричний), представлено на рис. 14.

Рис. 14. Порівняльні результати аналізів концентрації глюкози при вирощуванні культури клітин Klebsiella оxitoca. Культуру мікроорганізмів вирощували в споживному середовищі LB

       На діаграмі видно хороше співпадання даних, отриманих різними методами, а також динаміку зменшення концентрацій глюкози при рості культури клітин. Таким чином наш біосенсор з успіхом можна використовувати для контролю вирощування культур в лабораторній практиці.

       Розроблений біосенсор також було застосовано для аналізу інших культуральних рідин, у тому числі, в зразках промислового виробництва, отриманих на Ладижинському заводі «Ензим» безпосередньо з ферментерів (табл. 2).

Таблиця 2.

       Біосенсори демонстрували операційну стабільність протягом 48 годин роботи, що дозволяло провести 200-300 вимірів глюкози в реальних зразках на одному датчику.

ВИСНОВКИ

1. Проведено детальне вивчення впливу різних факторів на роботу кондуктометричних ферментних біосенсорів та оптимізовано їх основні аналітичні характеристики для аналізу реальних зразків у медичній практиці і біотехнології.
2. Показано, що для виготовлення кондуктометричних перетворювачів не є обов’язково використання дорогих благородних металів і зменшення характеристичних розмірів електродів, а при цьому як підкладинку можна використовувати будь-який непровідний матеріал мікроелектроніки, що дозволяє спростити технологію та зменшити вартість виробництва таких перетворювачів.
3. Порівняння біосенсорів, створених на основі ферменту пеніцилінази та рН-чутливих польових транзисторів і кондуктометричних планарних електродів показало, що вони мають схожі робочі характеристики, однак, з технологічної точки зору кондуктометричні біосенсори простіші при виготовлені та в експлуатації, що робить їх більш перспективними для масового виробництва і практичного застосування.
4. Показано, що збільшення діапазону роботи кондуктометричного біосенсора до 20 мМ глюкози досягається при використанні фериціаніду калію як альтернативного кисню окислювача, однак в цьому випадку необхідно проводити виміри на низьких частотах змінного струму, що дещо ускладнює процедуру вимірювань, але дозволяє роботу в середовищах з високою буферною ємністю та іонною силою.
5. Застосування напівпроникних додаткових мембран при створенні глюкозного кондуктометричного біосенсора вирішує проблему розширення його динамічного діапазону в умовах високочастотної кондуктометрії та покращує основні аналітичні характеристики, а саме чутливість і стабільність, а також зменшує вплив факторів середовища на відгук.
6. Створені кондуктометричні біосенсори було використано для кількісного аналізу глюкози в реальних зразках (кров щурів, культуральні рідини) та показано високий ступінь кореляції з результатами, одержаними класичними методами. Запропоновано протоколи кількісного аналізу глюкози в біологічних рідинах за допомогою створеного приладу.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. С.В. Дзядевич, A.A. Шульга, С.В. Пацковский, В.Н. Архипова, A.П. Солдаткин, В.И. Стриха. Тонкопленочный кондуктометрический датчик для ферментных биосенсоров // Электрохимия.- 1994.- Т. 30, № 8.- C.982-987.

       S.V. Dzyadevich, A.A. Shul'ga, S.V. Patskovsky, V.N. Arkhipova, A.P. Soldatkin, V.I. Strikha. Thin-films conductometric transducer for enzyme biosensor // Russian Journal of Electrochemistry (by Interperiodica, USA).- 1994.- V. 30, No 8.- P. 887-891.

2. С.В. Дзядевич, О.П. Солдаткін, В.М. Архипова, О.А. Шульга, Г.В. Єльська. Кондуктометричний ферментний глюкосенсор. Пошук шляхів поліпшення аналітичних характеристик // Укр. біохімічний журнал.- 1995.- Т. 67, № 6.- С. 53-59.
3. В.Н. Архипова, С.В. Дзядевич, А.П. Солдаткин, А.В. Ельская. Ферментные биосенсоры для определения пенициллина на основе кондуктометрических планарных электродов и рН-чувствительных полевых транзисторов // Укр. биохимический журнал.- 1996. - Т. 68, № 1.- С. 26-31.
4. В.Н. Архипова. Влияние дополнительных положительно заряженных полимерных мембран на аналитические характеристики кондуктометрических глюкозных биосенсоров // Биополимеры и клетка.- 1998.- Т. 14, № 3.- С. 242-245.
5. A.P. Soldatkin, S.V. Dzyadevich, Y.I. Korpan, V.N. Arkhipova, G.A. Zhylyak, S.A. Piletsky, T.A. Sergeeva, T.L. Panasyuk, A.V. El’skaya. Biosensors based on conductometric detection // Biopolymers and Cell.- 1998.- V. 14, No 4.- P. 268-277.
6. S.V. Dzyadevich, V.N. Arkhipova, A.P. Soldatkin, A.V. El’skaya, A.A. Shul’ga, Glucose conductometric biosensor with potassium hexacyanoferrate(III) as an oxidizing agent // Analytica Chimica Acta.- 1998.- V. 374/1.- P.11-18.
7. A.P. Soldatkin, S.V. Dzyadevich, A.A. Shul,ga, V.N. Arkhipova, G.A. Zhylyak, Y.I. Korpan, V.I. Strikha, A.V. El’skaya. Conductometric enzyme biosensors for determining of concentrations of some substrates and inhibitors // Abstract Book of 7th European Congress on biotechnology, Nice, France, 1995, February 19-23.- Paris: “Synelog”.- 1995.- V.1.- P.92.
8. S.V. Dzyadevich, V.N. Arkhipova, A.A. Shul’ga, A.P. Soldatkin. Glucose conductometric biosensor with potasium ferricyanide as an oxidizing agent // Abstract Book of NATO ARW «New trends in biosensor development», Kiev, Ukraine, 1998, July 6-9.- P.64.
9. A.P. Soldatkin, Ya.I. Korpan, S.V. Dzyadevich, V.N. Arkhipova, N.V.Karpenko, M.Yu. Alesina. Application of enzyme field effect transistor for glucose analysis in blood serum // Abstract Book of NATO ARW «New trends in biosensor development», Kiev, Ukraine, 1998, July 6-9.- P.72.

Архипова В.М. Оптимізація основних характеристик кондуктометричних ферментних біосенсорів для аналізу реальних зразків. - Рукопис.

       Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія.- Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 1998.

В дисертаційній роботі представлено результати по оптимізації основних характеристик кондуктометричних ферментних біосенсорів та створенню високоефективних і стабільних систем для аналізу реальних зразків. Всебічно досліджено вплив умов проведення експериментів, матеріалів, форми та розмірів електродів на характеристики перетворювачів і розроблені практичні рекомендації щодо їх оптимального вибору. Проведено порівняння робочих характеристик біосенсорів на основі кондуктометричних перетворювачів та рН-чутливих польових транзисторів для кількісного аналізу пеніциліну. Запропоновано декілька шляхів цілеспрямованої зміни аналітичних характеристик кондуктометричних ферментних біосенсорів, зокрема чутливості та динамічного діапазону вимірювань, і проведено їх детальний аналіз. Розроблено глюкозний кондуктометричний біосенсор для аналізу реальних зразків (крові і культуральних рідин) без попередньої їх обробки.

       Ключові слова: кондуктометричний ферментний біосенсор, імпедансна спектроскопія, глюкоза, пеніцилін, мембрана.

Архипова В.Н. Оптимизация основных характеристик кондуктометрических ферментных биосенсоров для анализа реальных образцов. Рукопись.

       Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология.- Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 1998.

В диссертационной работе представлены результаты по оптимизации основных характеристик кондуктометрических ферментных биосенсоров и созданию высокоэффективных и стабильных систем для анализа реальных образцов. Всесторонне исследовано влияние условий проведения экспериментов, материалов, формы и размеров электродов на характеристики преобразователей и разработаны практические рекомендации для их оптимального выбора. Проведено сравнение рабочих характеристик биосенсоров на основе кондуктометрических преобразователей и рН-чувствительных полевых транзисторов для количественного анализа пенициллина. Предложено несколько путей целенаправленного изменения аналитических характеристик кондуктометрических ферментных биосенсоров, а именно чувствительности и динамического диапазона измерений, и проведен их детальный анализ. Разработан глюкозный кондуктометрический биосенсор для анализа реальных образцов (крови и культуральных жидкостей) без их предварительной обработки.

       Ключевые слова: кондуктометрический ферментный биосенсор, импедансная спектроскопия, глюкоза, пенициллин, мембрана.

Arkhipova V.N. Optimization of basic characteristics of conductometric enzyme biosensors for analysis of real samples. Manuscript.

       Thesis for degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Biology, speciality 03.00.20 - biotechnology.-O.V.Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

The thesis contains the results on optimization of basic characteristics of conductometric enzyme biosensors and creation of highly effective and stable systems for analysis of real samples. Influence of the experimental conditions, materials, forms and sizes of electrodes on characteristics of the transducers was thoroughly investigated, and practical recommendations for their optimal selection were developed. Working characteristics of biosensors based on conductometric transducers and pH-sensitive field-effect transistors for determination of penicillin were compared. Some ways of purposeful change of analytical characteristics of conductometric biosensors such as sensitivity and dynamic range of measurements were proposed, and their detailed analysis was conducted. The glucose conductometric biosensor for analysis of real samples (blood and cultural media) without treatment was developed.

       Key words: conductometric enzyme biosensor, impedance spectroscopy, glucose, penicillin, membrane.