АНОТАЦІЯ
Лащевський В.В. Нові підходи до ідентифікації молочнокислих бактерій. Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія.- Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ, 2005.
Дисертація присвячена таксономічним дослідженням молочнокислих бактерій, що зберігаються в Українській колекції мікроорганізмів. Показано, що гетерогенність властивостей лактобактерій створює значні труднощі при їх ідентифікації. Враховуючи дані, що були отримані за допомогою фенотипових методів, і, використовуючи розширену характеристику штамів, яку склали завдяки молекулярно-генетичним методам, була встановлена видова приналежність штамів, які мали неясне таксономічне положення. Виявлена гетерогенність ключової ознаки - ферментації вуглеводів у встановленні таксономічного положення представників роду Lactobacillus на видовому і внутрішньовидовому рівні. Представлено результати нумеричного аналізу властивостей молочнокислих бактерій із невизначеним таксономічним положенням. Знайдено ендонуклеази рестрикції, що виявляють гетерогенність гена 16S рРНК деяких видів молочнокислих бактерій. У визначенні видової приналежності молочнокислих бактерій використано новий підхід із застосуванням комплексу RAPD-праймера і праймера-термінатора, що розширив характеристики штамів на генетичному рівні. Аналізом нуклеотидних послідовностей молочнокислих бактерій, узятих з бази даних GENBANK, показано, що придатним для визначення на видовому рівні є ген 16S рРНК, на рівні груп споріднених видів - спейсерна ділянка 16S-23S рРНК. На основі ПЛР створена експрес-система для ідентифікації промислово важливих штамів лактобацил, що відносяться до виду L. plantarum. Розроблено комп'ютерну програму мовою програмування С++Builder для ідентифікації молочнокислих бактерій, що дозволяє автоматизувати обчислення, пов'язані з приготуванням розчинів, проведенням електрофорезу і ПЛР.
Ключові слова: Lactobacillus, фенотипові ознаки, RAPD-типування, 16S рРНК, BLAST, ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), рестрикційний аналіз.
АННОТАЦИЯ
Лащевский В.В. Новые подходы к идентификации молочнокислых бактерий.
Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология.- Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 2005.
Диссертация посвящена таксономическим исследованиям молочнокислых бактерий, хранящихся в Украинской коллекции микроорганизмов. Показано, что проявление гетерогенности при сбраживании углеводов, выявление нетипичных свойств (восстановление нитратов в нитриты), нечеткое проявление таких признаков, как рост в присутствии NaCl, температурные точки роста и др. у отдельных штаммов создает проблемы при их идентификации. С помощью фенотипических методов и расширенной характеристики штаммов, составленной посредством молекулярно-генетических методов, была установлена видовая принадлежность штаммов, имеющих неясное таксономическое положение. Гетерогенность ключевого признака – сбраживание углеводов, проявилась при определении таксономического положения представителей рода Lactobacillus на видовом (штаммы L. plantarum, L. fermentum и др.) и внутривидовом уровне (штаммы подвидов L. delbrueckii). Представлены результаты нумерического анализа молочнокислых бактерий с неясным таксономическим положением по 73 фенотипическим признакам. Видовая принадлежность штаммов была установлена по их положению в дендрограмме сходства относительно типовых культур и с учетом результатов API-тестирования. Найдены эндонуклеазы рестрикции, обнаруживающие гетерогенность гена 16S рРНК некоторых видов молочнокислых бактерий: штаммы L. confusus и L. fermentum были разделены StyI, PmaCI и PstI, а штаммы других видов – с помощью эндонуклеаз рестрикций, среди которых HaeII, EcoRI и BamHI. В определении видовой принадлежности молочнокислых бактерий, относящихся к L. plantarum, использован новый подход с применением комплекса RAPD-праймера Lp3-st и праймера-терминатора LP2, расширивший характеристики штаммов на генетическом уровне за счет отличий в характеристике видоспецифического фрагмента у представителей других видов. Анализом нуклеотидных последовательностей молочнокислых бактерий: 16S рРНК, большого и малого спейсерного участка 16S-23S рРНК, взятых из GENBANK, показано, что пригодным для определения штаммов L. plantarum на видовом уровне является ген 16S рРНК, который имеет нуклеотидное отличие, позволившее дифференцировать посредством ПЦР такие близкородственные виды как L. plantarum, L. paraplantarum и L. pentosus. В отличие от 16S рДНК, анализ спейсерного участка 16S-23S рРНК выявил ограничения при видовом определении штаммов, принадлежащих близкородственным видам. На основе ПЦР создана экспресс-система, применяющая видоспецифические праймеры LP3-sp и LP2 для идентификации промышленно важных штаммов лактобацилл, относящихся к виду L. plantarum. Разработана компьютерная программа на языке программирования С++ Builder, которая использовалась при идентификации молочнокислых бактерий, автоматизировавшая вычисления, связанные с приготовлением растворов, проведением электрофореза и ПЦР.
Ключевые слова: Lactobacillus, фенотипические признаки, RAPD-типирование, 16S рРНК, BLAST, ПЦР (полимеразная цепная реакция), рестрикционный анализ.
ABSTRACT
Lashchevsky V.V. New approaches to identification of lactic acid bacteria.
Manuscript.The candidate degree thesis by speciality 03.00.07 – microbiology. Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.
The dissertation is devoted to taxonomic researches of lactic acid bacteria (LAB) stored in the Ukrainian collection of microorganisms (UCM). It was shown that heterogeneity of their phenotypical properties creates significant difficulties for their identification. The proper taxonomic position of strains that haven't clear species definitions were defined by molecular methods and using phenotypic data. It was established the atypical fermentation reactions for some Lactobacillus strains. For LAB definitions, it was presented the numeric analysis data. Also, the restriction endonucleases were selected to reveal heterogeneity of a 16S rDNA for some LAB species. The new approach was introduced into identification of LAB at species level. It was based on application of RAPD-primer and the primer-“terminator” and allowed to supply genetic characteristics of strains. The analysis of 16S rDNA sequences of LAB from GENBANK was confirmed data to reference to identification of closely related species using 16S rDNA sequences and shown the limits of 16S-23S spacer region. The PCR express-system was developed for identification of industrially important L. plantarum strains. The special computer program was written by C++ Builder. It was used in computing appurtenant to preparation of solution, PCR and et.al.
Keywords: Lactobacillus, phenes, RAPD-typing, 16S rRNA, BLAST, PCR (polymerase chain reaction), restriction analysis.
| 
