Залежність від ДLk відносних внесків топоізомерів у їх розподілах є бімодальною (рис. 6), що негайно вказує на існування двох конформацій тетрасоми з негативним та позитивним значеннями ДLkp, тобто з різною хіральністю. Перша з конформацій є лівою і більш вигідною енергетично, що природно, бо тетрамер має вигляд закрученої ліворуч підкови у складі нуклеосоми. Друга є закрученою праворуч конформацією. Аналіз даних на підставі моделі двох станів та теорії рівноважних конфігурацій дозволяє отримати топологічні, енергетичні та структурні параметри двох станів (табл. 3). Зокрема, експериментальні значення Ksc є, згідно до розрахунків, дуже чутливими до радіуса r тетрасомної суперспіралі. У правому стані радіус виявився значно більшим (табл. 3).
Таблиця 3
Топологічні, енергетичні та структурні параметри тетрасом у складі
мініциклів
Знайдена для нуклеосом різниця між серіями ДНК у випадку тетрасом суттєво знижується. Але певний поліморфізм зберігається: тетрасома Bam характеризується дещо меншим радіусом суперспіралі у лівому стані та більш високою енергією конформаційного перетворення ДGp (табл. 3). Тобто, тетрасома Bam, як і відповідна нуклеосома, є більш конформаційно жорсткою у порівнянні з Taq. Крім того, зберігається різниця у локальній спіральній періодичності hloc, що вона спостерігалася для відповідних нуклеосом.
Загальними характеристиками тетрасом на обох досліджених серіях ДНК (табл. 3) є: 1) наявність структурного перетворення зі зміною хіральності, коли під впливом позитивної надспіралізації тетрасома перетворюється на більш енергетичну закручену праворуч форму; 2) вказана зміна хіральності супроводжується латеральним розкриттям тетрасоми (збільшенням радіусу тетрасомної суперспіралі); 3) тетрасомна ДНК, у порівнянні з нуклеосомною, характеризується більшим значенням твісту (зменшенням спіральної періодичності). Латеральне розкриття тетрасоми у її позитивному стані було підтверджено електронно-мікроскопічними спостереженнями (Alilat et al., 1999).
Виявляється, що гістонові хвости відіграють значну роль також у процесі структурного перетворення тетрасоми. Тетрасоми були реконструйовані з використанням трипсинизованих гістонів (обох або одного з двох). Аналіз релаксації свідчить, що усунення хвостів трипсином призводить до суттєвого полегшення структурного перетворення, а також до додаткового латерального розкриття (збільшення радіусу суперспіралі) у обох структурних формах (табл. 3). Головним чином за цей ефект відповідає хвіст гістона Н3. Релаксаційні експерименти з використанням ацетильованих тетрамерів демонструють менш значні зміни, але в тому ж напрямку. Таким чином, тетрасома може бути латерально розкритою у двох випадках: у ході перетворення у праву форму та після усунення кінцевих ділянок гістона Н3. Така кореляція наводить на думку, що кінцеві ділянки є дестабілізованими у складі правої форми тетрасоми, або, іншими словами, їхня дестабілізація є необхідною для структурного перетворення у праву форму з латеральним розкриттям тетрасоми. На підставі кристалічної структури нуклеосоми можна припустити "інтеркаляцію" хвостів у малий жолобок в структурі лівої тетрасоми. Малий жолобок при цьому збільшується на зовнішньому боці суперспіралі, що повинно блокувати ДНК у вигнутому стані.
Структурна динаміка та позиціювання тетрасоми. Модифікація тетрамера гістонів (Н3-Н4)2 ковалентним реагентом SH-груп ДТНБ призводить до реверсії енергетичної вартості двох структурних форм тетрасоми: права форма стає переважною (див. вище). Таке "блокування" тетрасоми у правій формі відкриває можливість дослідити структуру цієї форми у складі лінійної ДНК (199 п.о., серія Bam) методом футпринтинга ДНК за допомогою вільних ОН• радикалів.
Футпринтинг не виявляє жодної різниці у доступності певних нуклеотидів для радикалів між контрольними та ДТНБ-нуклеосомами. Унікальна позиція нуклеосоми досить точно передбачається теорією позиціювання (див. вище). Фур’є-трансформація частоти розщеплення обох нуклеосом дає оцінку періодичністі контактів hloc = 10,3±0,1. Періодичність контактів є однаковою для нативних та ДТНБ-тетрасом (hloc = 10,1±0,1). Це підтверджує припущення, зроблене у ході аналізу релаксаційних експериментів тетрасом, про незалежність hloc від конформаційних перетворень, а також висновок про збільшення твісту тетрасомної ДНК у порівнянні з нуклеосомною. Але нативний тетрамер займає на дослідженому фрагменті кілька позицій, що перекриваються (що теж узгоджується з теорією позиціювання), тоді як тетрамер-ДТНБ займає дві окремі позиції на протилежних кінцях фрагменту. Отже, одна з функцій, що її виконує in vivo виявлене структурне перетворення у тетрасомі зі зміною хіральності, може полягати у зміні переважних позицій, які займає тетрасома відносно послідовності ДНК.
Структурна динаміка нуклеосоми у присутності лінкерного гістону Н5. Лінкерні гістони (Н1 або його аналог з еритроцитів птахів Н5) зв'язуються з нуклеосомою в місці входу-виходу нуклеосомної ДНК. Специфічність зв'язування зумовлена глобулярним доменом (GH5). Але завдяки невпорядкованій С-кінцевій ділянці довжиною ~100 амінокислотних залишків, серед яких багато позитивно заряджених, лінкерні ділянки ДНК формують стеблоподібну структуру (Hamiche et al., 1996), яка зумовлює певний напрямок специфічної укладки ДНК у складі 30 нм фібрили.
Рис. 7. Відносні внески f топоізомерів у їх розподілах після релаксації нуклеосом, що містять гістон Н5, на мініциклах різного розміру серії Taq у залежності від ДLk цих топоізомерів. Суцільна крива є результатом підгонки під модель двох структурних станів. Конфігурації мініциклу розраховані в межах теорії рівноважних конфігурацій для вказаних значень ДLk згідно моделі для стеблоподібної структури на виході з нуклеосоми.
У релаксаційних експериментах із комплексами нуклеосома-Н5 (рис. 7, табл. 4) спостерігаються наступні відміни у порівнянні з нуклеосомою: 1) у присутності Н5 відкритий стан нуклеосоми зникає, що й очікувалось, оскільки Н5 взаємодіє з нуклеосомною ДНК на вході-виході; 2) залишаються два закриті конформаційні стани, що їх було зафіксовано для нуклеосоми, і це, у свою чергу, підтверджує їх передіснування в нуклеосомі; 3) зростає присутність позитивного стану (також і для нуклеосоми Bam); 4) практично зникає динамічний поліморфізм для двох досліджених послідовностей ДНК – крива для серії Bam виглядає так само, як крива Taq на рис.7, за винятком зсуву по осі абсцис, який відображає різницю у твісті нуклеосомної ДНК; 5) збільшується відстань по осі абсцис між двома конформаційними станами: негативний стає більш негативним, позитивний – більш позитивним.
Таблиця 4
Топологічні та енергетичні параметри комплексів нуклеосома-Н5 у складі
мініциклів
Ще однією характерною відзнакою Н5-нуклеосом є дивовижно низька, навіть на тлі загально високої конформаційної рухливості інших досліджених комплексів, силова константа надспіралізації (табл. 4). Якщо розмір вільної петлі дорівнює приблизно 190 п.о., то величина Ksc/Nl відповідає, в середньому, Ksc ~ 800, що практично співпадає зі значенням, отриманим методом флуоресценції БЕ для ДНК нативних клітинних ядер.
Як показують розрахунки на підставі теорії рівноважних конфігурацій еластичного стержня, для досягнення такої низької константи Ksc/Nl необхідно, щоб два кінця петлі ДНК були у контакті, при цьому тангенти до осі ДНК у цих точках були паралельними, та розмір петлі Nl не перевищував 180 п.о. Тобто, отримане значення Ksc/Nl може розглядатися як доказ існування на кінцях петлі стеблоподібної структури, у якій дві ділянки ДНК є паралельними одна до одної. З іншого боку, зміщення ДLkp приблизно на 0,2 у негативний (для негативного стану) чи у позитивний (для позитивного стану) бік у порівнянні з нуклеосомою (табл. 2, 4), вказує на відповідне закручення двох ділянок ДНК у складі стебла. Тобто паралелізм у стеблі досягається поступово: дві лінкерні ділянки, виходячи з нуклеосоми, формують перехрещення (негативне чи позитивне) під певним кутом та утворюють стебло у вигляді подвійної спіралі; далі крок такої спіралі поступово збільшується так, що дві ділянки стають паралельними на виході зі стебла. Відповідно до таких властивостей стебла була побудована модель мініциклу, що містить нуклеосому та гістон Н5. Галерея конфігурацій мініциклу (рис. 7) ілюструє легкість обертання петлі навкруг стебла. Дещо подібне повинно відбуватися й у хроматині, де нуклеосома може легко обертатися навкруг стебла у відповідь на зміну топологічного стану ДНК.
Як показують релаксаційні експерименти з комплексами нуклеосома-GH5 (табл. 4), присутність GH5 є достатньою для зникання відкритого стану нуклеосоми, що підтверджує взаємодію глобулярного домену з нуклеосомою у місці входу-виходу ДНК. GH5 полегшує формування позитивної форми нуклеосоми, але є недостатнім для повного зникнення динамічного поліморфізму нуклеосом. GH5 є також недостатнім для збільшення ступеня перехрещення лінкерних ділянок ДНК, що він спостерігається у випадку Н5, – для формування стебла є необхідним С-кінцевий невпорядкований домен.
Динамічна модель організації хроматину. Результати дисертаційної роботи дозволяють сформулювати загальну модель динаміки нуклеопротеїнових комплексів у складі хроматину (рис. 8). Висока загальна конформаційна рухливість хроматину в складі клітинних ядер знаходить своє пояснення у високій конформаційній рухливості нуклеогістонових комплексів різного складу. Зокрема, надзвичайно висока конформаційна рухливість наднуклеосомної частинки, яка містить гістон Н1/Н5 (верхня частина рис. 8), дозволяє нуклеосомі у складі хроматину легко обертатися навкруг стеблоподібної структури. Висока обертальна рухливість стебла має полегшувати компактизацію хроматину завдяки зміні, в разі потреби, обертальної орієнтації нуклеосоми з метою забезпечення ефек-тивних міжнуклеосомних взаємодій. Крім того, рухливість стебла дає змогу хроматину "витримувати" еластичні напруження, що виникають у складі хроматинової петлі. Одним з головних джерел таких напружень є процес елонгації транскрипції (нижня частина рис. 8): проходження РНК-полімерази викликає, як відомо, дві хвилі надспіралізації – позитивну попереду і негативну позаду полімеразного комплексу. Стебло виступає своєрідним буфером, здатним гасити такі хвилі на віддалених від зони елонгації ділянках хроматину.
Роль такого ж буферу виконують негативний та позитивний стани нуклеосоми після усунення лінкерних гістонів із потенційно активних ділянок хроматину (середня частина рис. 8). Проте, в цьому випадку в активних ділянках хроматину на певних послідовностях ДНК, а також завдяки ацетилуванню гістонів і/або репозиціюванню нуклеосом, конформаційна рухливість нуклеосоми зменшується, і превалює відкрита форма нуклеосоми. Часткове розгортання нуклеосомної ДНК у відкритій формі повинно забезпечувати більшу доступність регуляторних послідовностей до транскрипційних факторів та дестабілізувати димери гістонів Н2А-Н2В.
Унаслідок цього димери можуть (завдяки дії проміжних переносників) видалятися з хроматину, де залишається тетрасома (нижня частина рис. 8). Структурне перетворення тетрасоми зі зміною її хіральності знову ж таки дозволяє швидко гасити хвилі надспіралізації. Те ж саме послаблення взаємодії кінцевих ділянок гістонів з ДНК, яке викликало збільшення жорсткості нуклеосоми, у даному випадку полегшує структурне перетворення. Загальна рухливість тетрасоми (здатність її до латерального розкриття, трансляційна рухливість вздовж ДНК) значно полегшує процес елонгації транскрипції. Негативна надспіралізація позаду РНК-полімерази зумовлює швидке відновлення структури нуклеосоми.
ВИСНОВКИ
- Головним загальним наслідком утворення нуклеопротеїнових комплексів хроматину є, поряд із компактизацією, значне підвищення конформаційної рухливості ДНК. Ця рухливість, що вона зумовлена змінами балансу різноманітних міжмолекулярних взаємодій та залежить від послідовності пар основ ДНК і посттрансляційних модифікацій гістонів, дає можливість вибірково активувати певні ділянки геному при збереженні загальної щільної упаковки ДНК у клітинному ядрі.
- Запропонована теорія електростатичних взаємодій позитивно заряджених лігандів з ДНК, яка базується на використанні рівняння Пуассона-Больцмана для зарядженого циліндра та дозволяє оцінювати значення електростатичного внеску у вигин ДНК, загальну електростатичну енергію полііону, константи зв’язування позитивно заряджених білків з ДНК.
- Теоретичний аналіз, проведений на підставі теорії електростатичних взаємодій, вказує, що конформаційна динаміка нуклеосоми зумовлена можливістю руйнування електростатичних контактів кінцевих ділянок ДНК із гістонами та (або) контактів димера гістонів Н2А-Н2В з тетрамером (Н3-Н4)2.
- В рамках теоретичної моделі ДНК як ізотропного еластичного стержня показано, що залежні від послідовності пар основ еластичні властивості ДНК є головним фактором позиціювання нуклеосом відносно послідовності. Розроблений теретичний алгоритм, що враховує пружні властивості динуклеотидних контактів у складі ДНК, у багатьох випадках дозволяє передбачити переважні нуклеосомні позиції з точністю до 10 пар основ.
- Флуоресцентне титрування бромистим етидієм свідчить, що, незважаючи на щільну компактизацію, ДНК зберігає високу загальну конформаційну рухливість у складі нативних клітинних ядер. Результати флуоресцентних експериментів вказують також на високу конформаційну рухливість нуклеогістонових комплексів, реконструйованих на циркулярній ДНК малого розміру (мініциклах).
- Аналіз релаксації мініциклів ДНК, які містять реконструйовану нуклеосому, ДНК-топоізомеразою І вказує, що нуклеосома здатна існувати у трьох структурних формах за фізіологічних умов, в залежності від топологічного стану ДНК: двох закритих, у яких нуклеосомна суперспіраль містить 1,7 витка, та у місці входу-виходу ДНК із нуклеосоми формується негативне або позитивне перехрещення, та відкритого – з 1,4 витка суперспіралі.
- Рівновага між структурними формами нуклеосоми залежить від послідовності пар основ ДНК, на якій ця нуклеосома сформована. Існування закритого позитивного стану нуклеосоми зумовлено залежною від послідовності пар основ деформацією нуклеосомної суперспіралі зі зближенням та зміною орієнтації лінкерних ділянок ДНК.
- У тетрасомі – комплексі ДНК із тетрамером гістонів (Н3-Н4)2 – під впливом позитивної надспіралізації здійснюється структурне перетворення зі зміною хіральності суперспіралі та її латеральним розкриттям.
- Дестабілізація кінцевих невпорядкованих ділянок гістонів унаслідок їх ацетилування призводить до зменшення конформаційної рухливості нуклеосоми та до збільшення рухливості тетрасоми: доступ до закритих форм нуклеосоми зменшується, структурне перетворення у тетрасомі значно полегшується після послаблення взаємодії кінцевих ділянок із ДНК.
- У нуклеосомі, яка містить лінкерний гістон Н5, лінкерні ділянки ДНК формують стеблоподібну структуру. Стебло є правою чи лівою подвійною спіраллю, крок якої поступово змінюється так, що дві ділянки ДНК виходять із неї майже паралельними, що забезпечує високу обертальну рухливість стебла.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Теоретическое исследование структурного перехода в нуклеосоме при низкой ионной силе // Молек. биология. – 1987. – Т.21, №3. – С.714-723. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
2. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Структура октамера гистонов в составе реконструированных полинуклеосом в присутствии гистона Н1 и двухвалентных катионов // Биополимеры и клетка. – 1987. – Т.3, №4. – С.192-201. (Особистий внесок дисертанта: реконструкція нуклеосом, виміри тирозинової флуоресценції гістонів, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
3. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Связывание положительно-заряженных лигандов с ДНК. Влияние ионной силы, заряда и размера лиганда // Молек. биология. – 1988. – Т.22,№2. – С.414-422. (Особистий внесок дисертанта: розробка теорії електростатичних взаємодій білків з ДНК, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
4. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Теоретическое рассмотрение механизмов компактизации ДНК поликатионами // Биофизика. – 1989. – Т.34, №1. – С.28-33. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
5. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Влияние сверхспирализации ДНК на структуру нуклеосом // Молек.биология. – 1991. – Т.25, №1. – С.144-152. (Особистий внесок дисертанта: теоретичний аналіз можливих варіантів впливу надспіралізації на структуру нуклеосом, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
6. Бондарь Н.В., Безруков В.Ф., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Возможная роль эндогенных нуклеаз в структурной организации хроматина // Биологические науки. Научные доклады высшей школы. – 1992. – №2. – С.58-64. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
7. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Флюоресцентная спектроскопия в исследованиях белково-нуклеиновых взаимодействий в хроматине // Биополимеры и клетка. – 1992. – Т.8, №1. – С.89-100. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів флуоресцентної спектроскопії щодо структури хроматину, розробка флуоресцентних підходів до вивчення білково-нуклеїнових взаємодій, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
8. Sivolob A.V., Khrapunov S.N. Translational positioning of nucleosomes on DNA: the role of sequence-dependent isotropic DNA bending stiffness // J. Mol. Biol. – 1995. – Vol.247, N5. – P.918-931. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі та алгоритму, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
9. Khrapunov S.N., Dragan A.I., Sivolob A.V., Zagariya A.M. Mechanisms of stabilizing nucleosome structure. Study of dissociation of histone octamer from DNA // Biochim. Biophys. Acta. – 1997. – Vol.1351, N1-2. – P.213-222. (Особистий внесок дисертанта: теоретичний аналіз дисоціації нуклеосом, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
10. Sivolob A., Khrapunov S.N. Electrostatic contribution to the bending of DNA // Biophys. Chemistry. – 1997. – Vol.67, N1-3. – P.85-96. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
11. Бондар Н.В, Сиволоб А.В., Демідов С.В. Використання методу титрування бромистим етидієм для дослідження топологічного стану ДНК у складі ядер // Вістник Київського університету. Біологія – 1998. – вип. 28. – С.23-24. (Особистий внесок дисертанта: розробка методики визначення топологічного стану ДНК у складі клітинних ядер, виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
12. Sivolob A., De Lucia F., Rйvet B., Prunell A. Nucleosome dynamics II. High flexibility of nucleosome entering and exiting DNAs to positive crossing. An ethidium bromide fluorescence study of mononucleosomes on DNA minicircles // J. Mol. Biol. – 1999. – Vol.285, N3. – P.1081-1099. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
De Lucia F., Alilat M., Sivolob A., Prunell A. Nucleosome dynamics III. Histone tail-dependent fluctuation of nucleosomes between open and closed DNA conformations. Implication for chromatin dynamics and the linking number paradox. A relaxation study of mononucleosomes on DNA minicircles // J. Mol. Biol. – 1999. – Vol.285, N3. – P.1101-1119. (Особистий внесок дисертанта: розробка методики релаксації нуклеогістонових комплексів топоізомеразою І, теоретичний аналіз релаксації нуклеосом, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
13. Alilat M., Sivolob A., Rйvet B., Prunell A. Nucleosome dynamics IV. Protein and DNA contributions in the chiral transition of the tetrasome, the histone (H3-H4)2 tetramer-DNA particle // J. Mol. Biol. – 1999. – Vol.291, N4. – P.815-841. (Особистий внесок дисертанта: визначення позицій нуклеогістонових комплексів методом футпринтинга ДНК, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
14. Sivolob A., Prunell A. Nucleosome dynamics V. Ethidium bromide versus histone tails in modulating ethidium bromide-driven tetrasome chiral transition. A fluorescence study of tetrasome on DNA minicircles // J. Mol. Biol. – 2000. – Vol.295, N1. – P.41-53. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, розробка моделі кількох структурних станів тетрасоми у присутності барвника, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
Sivolob A., De Lucia F., Alilat M., Prunell A. Nucleosome dynamics VI. Histone tail regulation of tetrasome chiral transition. A relaxation study of tetrasomes on DNA minicircles // J. Mol. Biol. – 2000. – Vol.295, N1. – P.55-70. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з релаксації тетрасом топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
15. Сиволоб А.В. Структурная динамика нуклеосомы и суперспиральный парадокс // Молек. биология. – 2002. – Т.36, №3. – С.391-396.
16. Сиволоб А.В. Висока конформаційна рухливість ДНК в ядрах клітин // Вісник Київського університету. Біологія. – 2002. – вип. 36. – С. 17-19.
17. Сиволоб А.В. Енергетика та конформаційна рухливість циркулярної ДНК малого розміру // Вісник Київського університету. Біологія. – 2002. – вип. 38. С. 21-22.
18. Sivolob A., Lavelle C., Prunell A. Sequence-dependent nucleosome structural and dynamic polymorphism. Potential involvement of histone H2B N-terminal tail proximal domain // J. Mol. Biol. – 2003. – Vol.326, N1. – P.49-63. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з релаксації нуклеосом топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів, розробка теоретичних моделей, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
19. Sivolob A., Prunell A. Linker histone-dependent organization and dynamics of nucleosome entry/exit DNAs // J. Mol. Biol. – 2003. – Vol.331, N5. – P.1025–1040. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з релаксації топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів, розробка теоретичних моделей, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
20. Prunell A., Sivolob A. Paradox lost: nucleosome structure and dynamics by the DNA minicircle approach // Chromatin structure and dynamics: state-of-the-art. New Comprehensive Biochemistry. Vol. 39 (Eds. J.Zlatanova, S.H.Leuba). – Amsterdam: Elsevier, 2004. – P. 45-74. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів релаксації нуклеогістонових комплексів топоізомеразою І, вирішення надспірального парадокса, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
21. Dragan A.I, Potekhin S.A., Sivolob A., Lu M., Privalov P.L. Kinetics and thermodynamics of the unfolding and refolding of the three-stranded б-helical coiled coil, Lpp-56 // Biochemistry. – 2004. – Vol.43, N47. – P.14891-14900. (Особистий внесок дисертанта: розробка методів підгонки теоретичних моделей під експериментальні дані, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
22. Sivolob A., Prunell A. Nucleosome conformational flexibility and implications for chromatin dynamics // Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. A. – 2004. – Vol.362, N1820. – P.1519-1547. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів релаксації нуклеогістонових комплексів топоізомеразою І, розробка моделі структурної динаміки хроматину, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)
23. Драган А.И., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Структурные перестройки нуклеосом в растворах с высокой ионной силой // Тезисы докладов IX Всесоюзного симп. "Структура и функции клеточного ядра". – Черноголовка. – 1987. – С.52. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
24. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Механизмы стабилизации нуклеосомы при низкой ионной силе // Тезисы докладов IX Всесоюзного симп. "Структура и функции клеточного ядра". – Черноголовка. – 1987. – С.86. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
25. Драган А.И., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Механизмы диссоциации нуклеосомы при высокой ионной силе по данным флуоресцентной спектроскопии // Тезисы докладов VI конференции по спектроскопии биополимеров. – Харьков. – 1988. – С.116-117. (Особистий внесок дисертанта: теоретичний аналіз дисоціації нуклеосом, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
26. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Структурный переход в нуклеосоме при низкой ионной силе. Флуоресцентная спектроскопия и теоретический анализ // Тезисы докладов VI конференции по спектроскопии биополимеров. – Харьков. – 1988. – С.269-270. (Особистий внесок дисертанта: виміри тирозинової флуресценції нуклеогістонових комплексів, розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
27. Сиволоб А.В., Безруков В.Ф., Бондарь Н.В., Храпунов С.Н. Торсионные напряжения в ДНК клеточных ядер. Флуоресцентные исследования // Тезисы докладов VII конференции по спектроскопии биополимеров. – Харьков. – 1991. – С.219. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
28. Безруков В.Ф., Бондарь Н.В., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Зависимость активности Ca-Mg эндонуклеазы от структурного состояния хроматина // Тезисы докладов IX конференции межотраслевого проекта “Нуклеазы”. – Казань. – 1991. – С.18-20. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
29. Khrapunov S.N., Dragan A.I., Sivolob A.V. The topological complementarity of the charge groups controlling the interaction of DNA with core histones in nucleosome // Progr. Biophys. and Mol. Biol. (International Biophysical Congress, Amsterdam). – 1996. – Vol.65, N1 – Р.82. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів щодо конформаційної рухливості нуклеосоми в залежності від іонної сили, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
30. De Lucia F., Sivolob A., Alilat M., Cohen-Solal J., Prunell A. Histone-tail dependent flexibility of nucleosome entering and exiting DNAs to positive crossing // EMBL Transcription meeting. – Heidelberg. – 1998. – P.256-257. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)
АНОТАЦІЯ
Сиволоб А.В. Молекулярні механізми структурної динаміки хроматину. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.
Представлено експериментальні та теоретичні результати досліджень механізмів нуклеопротеїнових взаємодій у складі хроматину та конформаційної динаміки нуклеосом і хроматину в залежності від топологічного стану циркулярної ДНК. Розроблено теорію взаємодії позитивно заряджених лігандів з ДНК. Показана важлива роль асиметричної нейтралізація зарядів ДНК у стабілізації нуклеосоми. Розвинуто теорію позиціювання нуклеосом відносно послідовності пар основ ДНК, яка дозволяє передбачати переважні нуклеосомні позиції з точністю до 10 пар основ. Для нуклеосоми та інших нуклеогістонових комплексів охарактеризовані певні конформаційні стани, які реалізуються у фізіологічних умовах та залежать від рівня надспіралізації циркулярної ДНК. Згідно отриманих результатів, головним загальним наслідком утворення нуклеопротеїнових комплексів хроматину є, поряд із компактизацією, значне підвищення конформаційної рухливості ДНК. Ця рухливість, що вона зумовлена змінами балансу різноманітних міжмолекулярних взаємодій та залежить від послідовності пар основ ДНК і посттрансляційних модифікацій гістонів, дає можливість вибірково активувати певні ділянки геному при збереженні загальної щільної упаковки ДНК у клітинному ядрі.
Ключові слова: хроматин, нуклеосома, електростатичні взаємодії, позиціювання нуклеосом, надспіралізація циркулярної ДНК, конформаційна рухливість.
АННОТАЦИЯ
Сиволоб А.В. Молекулярные механизмы структурной динамики хроматина. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2005.
Представлены экспериментальные и теоретические результаты исследований механизмов белково-нуклеиновых взаимодействий в составе хроматина и конформационной динамики нуклеосом и хроматина в зависимости от топологического состояния ДНК. Разработана теория взаимодействия положительно заряженных лигандов с ДНК. Показана важная роль асимметричной нейтрализации зарядов ДНК в стабилизации нуклеосомы. Развита теория позиционирования нуклеосом относительно последовательности пар оснований, которая позволяет предсказывать преимущественные нуклеосомные позиции с точностью до 10 пар оснований. Для нуклеосомы и других нуклеогистоновых комплексов охарактеризованы определенные структурные состояния, которые реализуются в физиологических условиях и зависят от уровня сверхспирализации кольцевой ДНК. В соответствие с полученными результатами, главным общим следствием образования нуклеогистоновых комплексов хроматина является, наряду с компактизацией, значительное возрастание конформационной подвижности ДНК. Эта подвижность, обусловленная изменениями баланса разнообразных межмолекулярных взаимодействий и зависящая от последовательности пар оснований ДНК и посттрансляционных модификаций гистонов, позволяет избирательно активировать определенные участки генома при сохранении общей плотной упаковки ДНК в клеточном ядре.
Ключевые слова: хроматин, нуклеосома, электростатические взаимодействия, позиционирование нуклеосом, сверхспирализация кольцевой ДНК, конформационная подвижность.
SUMMARY
Sivolob A.V. Molecular mechanisms of chromatin structural dynamics. – Manuscript.
A dissertation submitted to acquire the degree of Doctor of Science in Biology, speciality 03.00.02 – Biophysics. – Taras Shevchenko National University of Kiev, Kiev, 2005.
Experimental and theoretical results are presented on the mechanisms of the DNA-protein interactions in chromatin and the nucleosome and chromatin conformational dynamics that depends on the DNA topological properties.
A theory of electrostatic interactions of positively charged ligands with DNA has been developed on the basis of a simplified Poisson-Boltzmann equation for DNA modelled as the charged polyion cylinder. The theory can be used to analyze proteins to DNA binding in a wide range of salt concentrations. The effect of an increase in the affinity for the ligand of larger size (provided that the charge remains the same) has been established. A theoretical analysis of changes in the electrostatics upon DNA bending has been performed in terms of the Posson-Boltzmann equation. The electrostatic contribution to the DNA persistence length is found to be independent on ionic strength at salt concentrations higher than 10 mM, in agreement with known experimental data. In the case of an asymmetric neutralization of the DNA charges on a protein surface the electrostatic bending energy was found to give a significant favorite contribution to the total bending energy of DNA. A simple theoretical analysis showed that the formation of polycationic bridges between distant DNA sites is the principal mechanism of DNA compaction in the presence of unfolded positively charged polypeptides.
These theoretical approaches have been applied to analyze salt-dependent nucleosome conformational changes. It has been shown that these changes are caused by a possibility to break the histone-DNA electrostatic contacts on the edges of the nucleosome DNA and/or the contacts between the histone H2A-H2B dimer and (H3-H4)2 tetramer. At low salt (~1 mM NaCl), due to an increase in the electrostatic repulsion between the adjucent DNA gyres, a DNA unwrapping occurs on the edges, which is accompanied by the breakage of the dimer-tetramer contacts. About the same unwrapping, but with the breakage of 1 to 2 histone-DNA electrostatic contacts, is possible at physiological ionic strength. During the nucleosome dissociation at high ionic strength an increase of the curvature radius (lateral opening) happens in the tetrasome – the complex of DNA with the histone tetramer (H3-H4)2.
A theoretical model has been derived that accounts for the nucleosome translational positioning in terms of the bending energy that depends on the nearest-neighbor interactions between base pairs. The model allows one to predict the preferred nucleosome translational positions with an accuracy of about one turn of the double helix. A partial nucleosome unwrapping on the sites of high bending stiffness may occur. The nucleosome conformational changes result in changes of positions.
DNA flexibility in chromatin and reconstituted histone-DNA complexes was studied using fluorescence titration by ethidium bromide. The experimental evidence has been obtained for the phenomenon of onset of writhing upon accumulation of some positive supercoiling in the naked circular DNA of low contour length (minicircle). The nucleosome reconstituted on the minicircle is characterized by high resistance to the positive supercoiling. The reason appeared to be the ease with which the naked DNA loop could undergo a positive crossing. The terasome in the minicircle has been shown to be able to a chiral transition to a right-handed conformation. Both nucleosome and tetrasome flexibilities were found to be modulated by histone acetylation. In agreement with these results, fluorescence has shown that, regardless of the tight compaction, DNA retains its high flexibility in the cell nuclei.
The results on the DNA flexibility were confirmed and extended using an original approach based on the DNA-topoisomerase I relaxations of particles reconstituted on DNA minicircles, combined with their theoretical simulation. All the types of particles studied were found to exist in two to three conformational states, which differ by their topological and mechanical properties. Structural attributes of the DNA superhelix inside the particle that fit the state parameters are subsequently derived by simulations of loop DNA most probable configurations, using the explicit solutions to the equations of the equilibrium in the theory of the elastic rod model for DNA.
Tetrasomes were found to exist in two conformational states: left-handed, which resembles to the tetrasome structure in the nucleosome; and less preferred right-handed, which is also characterized by a lateral opening of the particle. The conformational transition to the right-handed state is significantly facilitated upon destabilization of unfolded histone tails, especially that of H3. Nucleosomes fluctuate between three conformational states. Two of these states are closed ~1.7-turn DNA conformations with either negatively or positively crossed entering and exiting DNAs; the third state is an open ~1.4-turn conformation with uncrossed DNAs, where the DNA is unwrapped on the edges. The access to these nucleosome conformations appears to be regulated by the DNA sequence in interaction with the histones, which influences the local twist of the wrapped DNA as well as the flexibility of the entering and exiting DNAs. The tails destabilization through their acetylation makes the open state to be the most favorable. The conformational equilibrium between the nucleosome states explains the linking number paradox.
Linker histones H5 were found to suppress nucleosome access to the open conformation and to increase nucleosome ability to positive crossing in a sequence-independent manner. This was accompanied by a large increase in loop flexibility in either conformation, that the simulation attributed to the stem formed by H5 C-terminal tail through its bridging of the entering and exiting DNAs.
The main conclusion of the work is that DNA overall flexibility increases considerably upon chromatin particles formation, which should indeed be a requirement of genome function.
Key words: chromatin, nucleosome, electrostatic interactions, nucleosome positioning, circular DNA supercoiling, conformational flexibility.
|
