Повстян О.В. Мембранні механізми дії апаміну на іонні струми гладеньком’язової клітини. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2000.
Робота присвячена фармако-біофізичному дослідженню компонентів сумарного трансмембранного іонного струму ГМК taenia coli морської свинки та з’ясуванню мембранних механізмів дії апаміну на кожний з ідентифікованих компонентів. З використанням методу фіксації потенціалу показано, що трансмембранний іонний струм цих клітин складається з вхідного Са2+ струму L-типу і вихідного К+ струму, в якому можна виділити три компоненти: потенціалзалежний струм “затриманого випрямлення” та два Са2+-залежні струми, що відрізняються не тільки провідністю каналів, через які вони переносяться, але й різною чутливістю до [Са2+]i та потенціалу на мембрані, відношенню до блокаторів (апаміну, харібдотоксину, ТЕА) а також кінетичними характеристиками. Відносний внесок компонентів К+ струму до сумарного вихідного струму (на максимумі амплітуди) при 0 мВ становив 35 - 45 % для потенціалзалежного К+ струму “затриманого випрямлення”, 5 - 15 % для апамінчутливого IK(Ca) та 45 - 55 % для харібдотоксинчутливого IK(Ca). Крім того, виявлено новий апамін-активований катіонний струм з потенціалом реверсії близько 0 мВ. Вперше показано, що дія апаміну на трансмембранний іонний струм ГМК taenia coli морської свинки включає в себе два механізми: блокування КСа малої провідності, з одного боку, та активування катіонної провідності, з іншого боку.
Ключові слова: гладеньком’язові клітини, taenia coli, апамін, харібдотоксин, ТЕА, кальційзалежні калієві струми, катіонний струм, внутрішньоклітинна концентрація кальцію.
Повстян А.В. Мембранные механизмы действия апамина на ионные токи гладкомышечной клетки. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2000.
Работа посвящена фармако-биофизическому исследованию компонентов суммарного трансмембранного ионного тока ГМК taenia coli морской свинки и выяснению мембранных механизмов действия апамина на каждый из идентифицированных компонентов. С использованием метода фиксации потенциала показано, что трансмембранный ионный ток этих клеток состоит из входящего Са2+ тока L-типа и выходящего К+ тока, в котором можно выделить три компонента: потенциалзависимый ток “задержанного выпрямлення” и два Са2+-зависимых тока, которые отличаются не только проводимостью каналов, через которые они переносятся, но й разной чувствительностью к [Са2+]i и потенциалу на мембране, отношению к блокаторам (апамину, харибдотоксину, ТЭА), а также кинетическими характеристиками. Относительный вклад компонентов К+ тока в суммарный выходящий ток (на максимуме амплитуди) при 0 мВ составлял 35 - 45 % для потенциалзависимого К+ тока “задержанного выпрямлення”, 5 - 15 % для апаминчувствительного IK(Ca) и 45 - 55 % для харибдотоксинчувствительного IK(Ca). Кроме того, обнаружен новый апамин-активируемый катионный ток с потенциалом реверсии около 0 мВ. Впервые показано, что действие апамина на трансмембранный ионный ток ГМК taenia coli морской свинки включает в себя два механизма: блокирование КСа малой проводимости, с одной стороны, и активирование катионной проводимости, с другой стороны.
Ключевые слова: гладкомышечные клетки, taenia coli, апамин, харибдотоксин, ТЭА, кальцийзависимые калиевые токи, катионный ток, внутриклеточная концентрация кальция.
Povstyan O.V. Membrane mechanisms of apamin action on smooth muscle cell ionic currents. - Manuscript.
Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.
The dissertation is devoted to pharmacological and biophysical investigations of the components of transmembrane ionic current in single smooth muscle cells isolated from guinea pig taenia coli and to clarification the membrane mechanisms of apamin action on each of discovered components. Using patch-clamp technique it was shown that this transmembrane ionic current induced by depolarizing shifts of membrane potential from its holding level of -60 mV contained an initial L-type inward Ca2+ current, which in 30 - 40 ms was followed by the outward one. Outward current was shown to be carried by K+ ions and consisted, at least, of three components: voltage dependent and Ca2+-independent “delayed rectifier” (KV) current, and two Ca2+-dependent currents. First of them (SK) - is apaminsensitive current carried via small-conductance Ca2+-activated K+ channels and second (BK) - charybdotoxinsensitive current carried via high-conductance Ca2+-activated K+ channels.
KV current was strictly voltage-dependent. With the increase of depolarization its amplitude sharply increased. The time-dependent inactivation of this current was very slow. SK current, which carried via small conductance K+ channels, was highly sensitive to intracellular free Ca2+ concentration ([Ca2+]i) - only decreasing [Ca2+]i to 50 nM completely blocked this current. I-V relationship of this current had a peak in the voltage range where Ca2+ current was maximal. This SK current was voltage-independent and did not demonstrate any time-dependent inactivation. Also it was insensitive to the action of TEA (4 - 5 mM) but was abolished by apamin (500 nM). BK current, which carried via high conductance K+ channels, was both voltage- and Ca2+-dependent: with the increase of depolarization the amplitude of this current sharply increased (as KV current), but I-V relationship had some peak in the range of maximum of Ca2+ current (as SK current). BK current was less sensitive to [Ca2+]i compared to the SK current. Also this current had fast inactivation - the time course of decay of BK current was found to follow closely the rate of Ca2+ current inactivation. It is necessary entry of calcium ions via voltage dependent Ca2+ channels for this current activation. When cells undergo spontaneous, localized Ca2+ release from intracellular storages (Ca2+ ‘‘sparks’’), and local Ca2+ concentration can reach levels sufficient to regulate Ca2+-dependent conductances in the plasma membrane, activation of BK channels leads to appearance of spontaneous transient outward currents (STOCs). In addition, BK current was inhibited by TEA (< 1 mM) and was completely blocked by charybdotoxin (100 nM). Contributions of these components in total outward current were 35-45%, 5-15% and 45-55% respectively for KV, SK and BK currents.
It has been found that application of apamin (500 nM) led to deflection of holding current into inward direction and increased membrane conductance. This effect was observed in normal physiological salt solution (PSS) as well as in PSS, contained Cs+ and Co2+ instead of K+ and Ca2+ respectively. At the same time substitution of Na+ in PSS by N-methyl-d-glucamine prevented this effect. Effect of apamin reappeared upon Na+ returning into PSS. This apamin-induced current has reversal potential at 0 mV. The obtained results suggested that apamin activate some cationic current and Na+ is a main ion, which entry into the cell at -60 mV
For the first time it has been shown that action of apamin on transmembrane ionic current of guinea pig taenia coli smooth muscle cells include two mechanisms: blocking of SK channels - on one hand, and activation of cationic conductance - on the other hand. In the range of smooth muscle resting potential both these effects lead to the increasing of inward current and so promote the development of depolarization. Activation of cationic conductance plays important role in the generation of threshold depolarization for starting action potential in smooth muscle cells. Blocking of SK channels, which play main role in the development of slow action potential afterhyperpolarization, will promote the increase in frequency of action potentials generation.
Key words: smooth muscle cells, taenia coli, apamin, charybdotoxin, ТEА, calcium-dependent potassium currents, cationic current, intracellular calcium concentration.
| 
