Библиотечный каталог авторефератов Украины

РОЗДІЛ 6. Імунохімічні дослідження ЛПС

ЛПС являє собою основний термостабільний антиген мікробної клітини. Його серологічну специфічність, а також специфічність мікробної клітини в цілому визначає структура О-ПС. Для оцінки ступеня кореляції виявлених особливостей структури О-ПС з серологічними властивостями та з’ясування взаємозв’язків між досліджуваними культурами бактерій до них були отримані високоактивні сироватки, титри яких в реакціях кільцепреципітації та аглютинації складали 1:12800 та 1:25600, відповідно. Реакціями подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні, імуноелектрофорезу та ракетного імуноелектрофорезу встановлено, що в гомологічних системах ЛПС всіх досліджуваних штамів R. aquatilis проявляють антигенну активність (рис. 4).

Відомо, що перехресні серологічні реакції, які засновані на філогенетичній спорідненості, можуть бути використані як один з підходів в класифікації різних видів додатково з загальноприйнятими методами таксономії.

Результати перехресних реакцій з використанням подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні та ракетного імуноелектрофорезу повністю співпадають та свідчать про серологічну різноманітність ЛПС досліджуваних штамів R. aquatilis.

Рис. 4.        Ракетний імуноелектрофорез (А), імуноелектрофорез (В) та подвійна імунодифузія в агарі за Оухтерлоні (С) ЛПС штамів: 1 – 1-95; 2 – 2-95;

3 – 3-95; 4 – 2-87; 5 – 3-88; 6 – 33071 з О-антисироваткою до ЛПС штамів:

a – 1-95; b – 2-95; c – 3-95; d – 2-87; e – 3-88; f – 33071

Таким чином, отриманні дані свідчать, що R. aquatilis є імунохімічно гетерогенним видом. На основі О-антигенності ЛПС досліджувані штами можна віднести до трьох серогруп: до першої – типовий штам 33071, ЛПС якого взаємодіяв лише з гомологічною О-антисироваткою; до другої – штами 1-95, 2-95, 3-95 та 2-87, ЛПС котрих містять загальні антигенні детермінанти та проявляли серологічну специфічність не лише в гомологічних системах, а й перехресно взаємодіяли з гетерологічними О-антисироватками; до третьої – штам 3-88, ЛПС якого взаємодіяв як з гомологічною, так і з гетерологічними О-антисироватками (до штамів 1-95, 2-95, 3-95 та 2-87). Однак, О-антисироватка до штаму 3-88 була активна лише до гомологічного ЛПС.

Порівняльний аналіз структур О-ПС з серологічною активністю ЛПС свідчить про відсутність прямої кореляції між цими показниками, як це встановлено для інших видів бактерій. Незважаючи на те, що О-ПС типового штаму 33071 містить одну з структур, яка аналогічна О-ПС штамів 2-87 та 3-88, між ними не виявлено перехресних серологічних реакцій. В той же час ЛПС штаму 3-95, О-ПС якого представлений мананом та глюканом взаємодіє з антисироватками до культур R. aquatilis 1-95, 2-87 та 2-95, які відрізняються структурою О-ПС. Одержані результати можна пояснити рядом причин. По-перше, відомо, що внесок в серологічну активність молекули ЛПС, крім О-ПС, здійснюють олігосахарид кору та ліпід А, який був аналогічним у всіх досліджених штамів. По-друге, не слід виключати можливість того, що в структурах О-ПС присутні певні мінорні мономери, які обумовлюють серологічну специфічність ЛПС, але використані нами методи не здатні були їх виявити.

РОЗДІЛ 7. Біологічна активність ЛПС

Відомо, що грамнегативні бактерії здатні здійснювати потужний вплив на організми вищих тварин, людини та рослин. Вони викликають різного роду патофізіологічні зміни, порушення імунологічної реактивності організму. Одним із таких мікроорганізмів є R. aquatilis. Описані в літературі випадки виділення цього умовного патогену із широкого кола джерел (продукти харчування, вода, інфекційний матеріал) та відсутність відомостей щодо пірогенної та токсичної дії представників виду R. aquatilis спонукали нас до їх вивчення.

При дослідженні пірогенності ЛПС була емпірічно встановлена мінімальна пірогенна доза (7,5Ч10-3 мкг ЛПС/мл непірогенного ізотонічного розчину). Ця доза була використана при вивчені пірогенності ЛПС досліджуваних штамів R. aquatilis. Дослідження проводили в порівнянні з фармацевтичним препаратом „Пірогенал”, основу якого складає ЛПС Shigella typhi. Всі досліджувані штами виявились пірогенними і проявили активність на рівні з препаратом „Пірогенал”, на відміну від типового штаму 33071, який виявився значно активнішим в порівнянні з усіма іншими досліджуваними штамами (табл. 5).

Для оцінки токсичності ЛПС R. aquatilis визначали дозу, при введенні якої спостерігалась би загибель 50 % піддослідних тварин (ЛД50) (табл. 5). ЛД50 визначали в серії розведень ЛПС, що складали від 18 до 33 мкг/мл, на мишах, сенсибілізованих D-галактозамінгідрохлоридом. ЛПС досліжуваних штамів виявили близький рівень токсичності – показник ЛД50 коливався в межах від 3,6 до 5,0 мкг із розрахунку на мишу, в залежності від штаму.

ЛПС грамнегативних бактерій являють собою біополімери, з широким спектром біологічної активності. На сьогодні відомі та вивчаються радіопротекторна, пірогенна, імуномодулююча, протипухлинна та багато інших активностей ЛПС та розглядаються можливості впровадження їх в медичну практику. Одним із основних бар’єрів і ускладнень в цьому процесі є високий рівень їх токсичності. Це спонукає дослідників, поряд з постійним пошуком нових, менш токсичних полімерів, розробляти підходи до отримання хімічно модифікованих ЛПС з меншою токсичністю, але які б зберігали свої терапевтичні ефекти. З огляду на те, що ЛПС R. aquatilis виділені вперше і досі відсутні дані про участь окремих структурних компонентів ліпіду А (саме він відповідає за ендотоксичну активність ЛПС грамнегативних бактерій) в токсичності та пірогенності, нами була проведена хімічна модифікація ЛПС досліджуваних штамів (N,O-деацилюванням та дефосфорилюванням) та вивчений їх вплив на токсичність та пірогенність.

Отримані нами дані (табл. 5) повністю узгоджуються з даними інших дослідників про те, що за токсичність та пірогенність ЛПС грамнегативних бактерій відповідають як ацильні, так і фосфорильні групи ліпіду А: модифіковані форми ЛПС повністю втратили можливість проявляти вищезгадані види активності.

Таблиця 5

Біологічна активність ЛПС штамів R. aquatilis

Примітка: при вивчені пірогенності використовували дозу 7,5*10-3 мкг/мл

Таким чином, представлена робота є першим дослідженням щодо виділення, хімічної та біологічної характеристики ЛПС шести штамів нового виду Enterobacteriaceae - R. aquatilis. Дані щодо біохімічного аналізу цих макромолекул в поєднанні з іншими біохімічними, генетичними та морфолого-фізіологічними властивостями можуть привести до удосконалення класифікації представників цього виду бактерій.

ВИСНОВКИ

1. Вперше виділені та хімічно охарактеризовані ЛПС шести штамів R. aquatilis. Виявлена штамова гетерогенність за моносахаридним складом ЛПС.
2. ЛПС всіх досліджуваних штамів R. aquatilis за своєю структурою належать до S-форм і складаються з ліпіду А, олігосахариду кору та О-специфічного ланцюга.
3. Домінуючими жирними кислотами ліпідів А ЛПС R. aquatilis є

3-окситетрадеканова (від 48,5 до 63, 4 %) та тетрадеканова (від 24,4 до 30,5 %) (в залежності від штаму).

4. За якісним та кількісним моносахаридним складом олігосахариди корів досліджуваних штамів відрізняються між собою і можуть бути віднесені до 9-ти хемотипів.
5. Вперше для R. aquatilis встановлені структури О-ПС, які побудовані з ланцюгів, що представлені лінійними або розгалуженими моно-, три- та гекса- (або гепта-) сахаридами. Всі структури є унікальними і раніше не були встановлені в О-ПС інших грамнегативних бактерій.
6. Показана гетерогенність ЛПС за структурою О-ПС, тобто наявність в його складі більш ніж одного типу структур олігосахаридів.
7. Особливості структури О-ПС впливають на прояв серологічної активності ЛПС: встановлена імунохімічна гетерогенність виду R. aquatilis. Вперше, на основі О-антигенності ЛПС, досліджувані штами R. aquatilis, які характеризуються п’ятьма типами структур О-ПС, віднесені до трьох серогруп.
8. Вивчення структурних компонентів макромолекули ЛПС досліджуваних штамів R. aquatilis свідчить, що дивергенція її властивостей відбувається в наступному порядку: ліпід А – О-ПС – олігосахарид кору. В ліпіді А виявлений один хемотип жирних кислот, в той час як в О-ПС – чотири хемотипи, а в олігосахариді кору – дев’ять хемотипів.
9. Вперше, для ЛПС представників виду R. aquatilis показана пірогенна та токсична дія, в прояві якої приймають участь як ацильні, так і фосфорильні групи.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Варбанец Л.Д., Остапчук А.Н, Винарская Н.В. Выделение и характеристика липополисахаридов R. aquatilis // Мікробіол. журн. – 2004. – 66, № 2. – С. 25-34. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваних штамів, виділені ЛПС, проведені аналізи по вивченню їх хімічного складу).
2. Варбанец Л.Д., Остапчук А.Н, Похил С.И. Характеристика структурных компонентов липополисахаридов R. aquatilis // Мікробіол. журн. – 2004. – 66,

№ 4. – С. 13-22. (Здобувачем деградовані ЛПС та отримані їх структурні компоненти, проведена хімічна ідентифікація: вивчені склад О-ПС, кору, визначений жирнокислотний склад ліпідів А ).

3. Остапчук А.Н, Варбанец Л.Д. Биологическая активность нативных и модифицированных липополисахаридов R. aquatilis // Мікробіол. журн. – 2004. – 66, № 6. – С. 31-36. (Здобувачем отримані модифіковані препарати ЛПС та проведені досліди по вивченню токсичності та пірогенності нативних і модифікованих ЛПС).
4. Варбанец Л.Д., Здоровенко Э.Л., Остапчук А.Н, Здоровенко Г.М Характеристика липополисахарида R. aquatilis 1-95 // Микробиол. – 2005. – 74, № 4. – С. 466-474. (Здобувачем отримана бактеріальна маса досліджуваного штаму, віділено ЛПС та його структурні компоненти, проведені аналізи по вивченню їх хімічного складу та біологічної активності).
5. Zdorovenko E.L., Varbanets L.D., Zatonsky G.V., Ostapchuk A.N. Structure of the O-polysaccharide of the lypopolysaccharide of R. aquatilis 1-95 // Carbohydr. Res. – 2004.-339.-P. 1809-1812. (Здобувачем накопичена бактеріальна маса досліджуваного штаму, ізольовано ЛПС, проведена його очистка, деградація та гель-хроматографія, отримано О-специфічний полісахарид та вивчений його хімічний склад).
6. Остапчук А.М. Вивчення жирнокислотного складу ліпіду А ліпополісахаридів R. aquatilis // Тези доп. Х з’їзду товариства мікробіологів України. - Одеса. 2004. – С. 67.
7. Ostapchuk A.N. Fatty acid composition of R. aquatilis lipopolysaccharides // 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates. - Wroclaw (Poland). – 2004. -  P. 75.
8. Varbanets L.D., Ostapchuk A.N. Characterization of R. aquatilis lipopolysaccharides // 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates. - Wroclaw (Poland). – 2004. -  P. 74.
9. Остапчук А.М. Вивчення токсичності та пірогенності нативних та хімічно-модифікованих ліпополісахаридів R. aquatilis // Тези доп. Першої Міжнародної конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ в біології”. - Львів. 2005. – С.165.

АНОТАЦІЯ

Остапчук А.М. Ліпополісахариди Rahnella aquatilis: структурно-функціональні дослідження. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню ліпополісахаридів (ЛПС) Rahnella aquatilis. Вперше виділені та охарактеризовані на структурно-функціональному рівні ЛПС шести штамів (33071 – типовий, 1-95, 2-95, 3-95, 2-87 та 3-88), виділених з різних джерел. Аналіз моносахаридного складу показав, що домінуючими моносахаридами в ЛПС досліджених штамів були рамноза, маноза та галактоза.

Для отримання окремих структурних компонентів молекули ЛПС був проведений м’який кислотний гідроліз. Штами 33071, 3-95, 2-87 та 3-88 містили по дві високомолекулярні фракції О-ПС (1 та 1*). Домінуючими моносахаридами О-ПС були галактоза, фукоза, рамноза, маноза та глюкоза. Більшість олігосахаридів корів представлені галактозою і глюкозою. За моносахаридним складом О-ПС всіх досліджуваних штамів можна розподілити на чотири хемотипи, а олігосахариди корів віднести до 9-ти хемотипів. За жирнокислотним складом ЛПС були подібні. Домінуючою була 3-окситетрадеканова кислота – діагностична для ентеробактерій, виявлені також тетрадеканова, додеканова та гексадеканова жирні кислоти.

Вперше встановлені структури О-ПС досліджуваних штамів R. aquatilis. Виявлено п’ять типів структур, які є унікальними. Структури О-ПС представлені лінійними або розгалуженими гетеро- або гомополісахаридами, які включають моно-, три- або гекса- (гепа-) сахаридні ланцюги, які повторюються. О-ПС ряду штамів містять більш ніж один тип олігосахаридів, які відрізняються за структурою.

На основі О-антигенності ЛПС досліджувані штами розподілені на три серогрупи: до першої віднесено типовий штам 33071, до другої – штами 1-95, 2-95, 3-95 та 2-87, до третьої – штам 3-88.

ЛПС всіх досліджуваних штамів є пірогеними та токсичними. Хімічна модифікація ЛПС шляхом N,O-деацилювання та дефосфорилювання призводить до повної втрати токсичних та пірогенних властивостей.

Ключові слова: ліпополісахарид, жирнокислотний склад, структури О-ПС, серогрупи, токсичність, пірогенність, N,O-деацильований та дефосфорильований ЛПС, Rahnella aquatilis.

АННОТАЦИЯ

Остапчук А.Н. Липополисахариды Rahnella aquatilis: структурно-функциональные исследования. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины.

Диссертация посвящена исследованию липополисахаридов (ЛПС) нового, мало изученого, условно-патогенного вида Rahnella aquatilis. Впервые выделены и охарактеризированы на структурно-функциональном уровне ЛПС шести штаммов (33071 – типовой, 1-95, 2-95, 3-95, 2-87 и 3-88), которые были изолированы из различных источников. Исследуемые штаммы характеризовались высоким содержанием ЛПС относительно сухой биомассы (до 19,8 %), что отличает их от других представителей грамотрицательных бактерий. Анализ моносахаридного состава показал, что доминирующими в ЛПС типового штамма 33071 являются рамноза (57,2 %) и манноза (16,7 %). ЛПС четырёх штаммов (1-95, 2-95, 2-87 и

3-88) отличались от типового наличием галактозы (78,7; 34,7; 31,1 и 36,0 %, соответственно) и фукозы (10,0; 10,0; 21,3 и 8,8 %, соответственно) как основных моносахаридов. ЛПС R. aquatilis 3-95 характеризовался наличием 86,6 % маннозы.

Для выделения отдельных структурных компонентов молекулы ЛПС (О-специфического полисахарида, олигосахарида кора, липида А) был проведён мягкий кислотный гидролиз. Особенностью штаммов 33071, 3-95, 2-87 та 3-88 было наличие не одной, а двух высокомолекулярных фракций О-ПС (1 и 1*). Доминирующими моносахаридами О-ПС штаммов 1-95, 2-95 являются галактоза и фукоза штамма 2-87 – фукоза,галактоза,манноза и глюкоза, штамма 3-88 – галактоза, маноза и глюкоза, О-ПС типового штамма 33071 в качестве основных моносахаридов содержал рамнозу, маннозу, галактозу и глюкозу. О-ПС штамма 3-95 представлен маннозой и значительно меньшим количеством глюкозы. Большую часть коров всех исследованых штаммов составляли галактоза и глюкоза. В каждом из штаммов R. aquatilis были выделены по две фракции олигосахарида кора, что свидетельствует о его гетерогенности. По моносахаридному составу О-ПС все исследованные штаммы можна разделить на четыре хемотипа, а олигосахарида кора – на 9 хемотипов.

В липиде А выявлен один хемотип жирных кислот. Доминирующей является 3-окситетрадекановая кислота (48,5 – 63,4 %, в зависимости от штамма) – диагностическая для энтеробактерий, также выявлены тетрадекановая (24,4 – 30,6 %), додекановая (4,7 – 19,4 %) и гексадекановая (3,3 – 9,1 %) жирные кислоты. В липиде А типового штамма 33071 выявлено незначительное количество гексадеценовой жирной кислоты (3,7 %).

Впервые устновлены структуры О-ПС исследованных штаммов R. aquatilis. Выявлено пять типов структур, которые являются уникальными. Показано, что они представлены линейными или разветвлёнными гетеро- или гомополисахаридами, которые содержат, моно -, три - или гекса- (или гепта-) сахаридные повторяющиеся звенья. Установлено, что О-ПС ряда исследованых штаммов содержат более одного типа олигосахаридов, отличающихся по своей структуре, что свидетельствует о гетерогенности – наличии в одном штамме молекул ЛПС с более, чем одним типом О-ПС.

Гетерогенность ЛПС R. aquatilis также была подтверждена в ДСН-ПААГ электрофорезе, результаты которого показывают, что ЛПС образуют большое количество линий с различной степенью электрофоретической подвижности.

Реакциями двойной иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони, иммуноэлектрофореза и ракетного иммуноэлектрофореза показано, что в гомологических системах ЛПС всех исследованых штаммов R. aquatilis проявляют антигенную активность. Результаты перекрёстных иммунологических реакций свидетельствуют о серологическом разнообразии ЛПС исследованых штамов.

Показано, что R. aquatilis являются иммунохимически гетерогенным видом. На основе О-антигенности ЛПС исследованные штаммы могут быть разделены на три серогруппы: к первой отнесён типовой штамм 33071, ЛПС которого взаимодействовал только с гомологичной О-антисывороткой; ко второй – штаммы 1-95, 2-95, 3-95, 2-87, ЛПС которых проявляли серологическую специфичность не только в гомологичных системах, а и перекрёстно взаимодействовали с гетерологичными О-антисыворотками; к третьей – штамм 3-88, ЛПС которого взаимодействовал как с гомологичной, так и с гетерологичными О-антисыворотками (к штамамм 1-95, 2-95, 3-95 и 2-87). В то время как О-антисыворотка к штамму 3-88 была активна только с гомологичным ЛПС.

Сравнительный анализ структур О-ПС с серологической активностью ЛПС свидетельствует об отсутствии прямой кореляции между этими показателями, как это продемонстрировано для других видов бактерий.

Изучение пирогенности показало, что ЛПС пяти исследованных штаммов R. aquatilis являются пирогенными и проявляют активность на уровне препарата „Пирогенал”, в то время как ЛПС типового штамма 33071 был более активным. ЛПС исследованных штаммов показали близкий уровень токсичности – показатель ЛД50 составлял от 3,6 до 5,0 мкг/мышь.

Химическая модификация ЛПС исследованных штаммов путём N,O-деацилирования и дефосфорилирования привела к полной утрате токсичных и пирогенных свойств.

Ключевые слова: липополисахарид, жирнокислотный состав, структуры О-ПС, серогруппы, токсичность, пирогенность, N,O-деацилированный и дефосфорилированный ЛПС, Rahnella aquatilis.

SUMMARY

Ostapchuk A.M. Lipopolysaccharides of Rahnella aquatilis: structure-function investigations. – Manuscript.

The thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.07 – microbiology. Institute of Microbiology and Virology named by D.K. Zabolotny of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

Candidate’s thesis is dedicated to investigation of lipopolysaccharides (LPS) of Rahnella aquatilis. Six strains (33071 - type, 1-95, 2-95, 3-95, 2-87, and 3-88 ) were isolated from different sources, and their LPS were characterised on structure - function level. The analyses of monosaccharides showed us, that the predominant monosacharides in LPS of investigated strains were rhamnose, mannose, and galactose.

Mild acid hydrolysis was used for receiving individual structural components of LPS molecule. R. aquatilis strains 33071, 3-95, 2-87, 3-88 contained two high molecular fractions of O-specific polysaccharide (OPS): 1 and 1*. The predominant monosaccharides of OPS were galactose, fucose, rhamnose, mannose and glucose. The majority of core-olygosaccharides were represented by galactose and glucose. All investigated strains were devided into four chemotypes by their OPS monosaccharide composition, and into nine chemotypes by their core olygosaccharide composition. By fatty acids composition all LPS were the similar. The predominant fatty acid was 3-oxytetradecanoic– diagnostic for Enterobacteriaceae. Tetradecanoic, dodecanoic and hexadecanoic were also detected.

At first, the OPS structure of investigated R. aquatilis strains were established. It was identified 5 types of OPS structure, which were unique. The structure of OPS were represented by linear or branched hetero- or homopolysaccharides, which include mono-, three-, hexa- (or hepta-) saccharides repeating units. OPS of some strains tested included more than one type of oligosaccharide, which were different by their structure.

On the basis of O-antigenicity of LPS, strains investigated were devided in to three serogroups: the first include the type strain 33071, the second – strains 1-95, 2-95, 3-95,

2-87, the third – strain 3-88.

LPS of all investigated strains are pyrogenic and toxic. Chemical modifications of LPS by N,O-deacylation and dephosphorylation lead to the complete loss of their toxicity and pyrogenicity.

Key words: lipopolysaccharides, fatty acids composition, structure of OPS, serogroup, toxicity, pyrogenicity, N,O-deacylation, dephosphorylation LPS, Rahnella aquatilis.