Варі-анти дос-ліду Кіль-кість замо-роже-них клітин Кількість клітин придатних для культивування після розмо-рожування Термін культи-вуван-ня, год. Кількість клітин:
на метафазі-2 на інших стадіях мейозу з дегенера-цією хромосом
n % n % n % n %
А 50 47 94,0 27 26 55,3 b 9 19,1 12 25,6 g
Ка 50 - - 27 39 78,0 cd 6 12,0 5 10,0 e
В 60 53 88,3 27 24 45,3 ab 13 24,5 16 30,2 gh
Кв 60 - - 27 44 73,3 cd 6 10,0 10 16,7 ef
С 70 57 81,4 27 25 43,9 a 12 21,0 20 35,1 h
Кс 70 - - 27 48 68,6 c 9 12,8 13 18,6 ef
a : b, f : g - P< 0,05; b : c, e : g - P< 0,01; a : c, a : d, b : d, e : g, e : h, f : h - P< 0,001
Встановлено, що найбільш перспективні для заморожування є ооцити корів з щільним багатошаровим кумулюсом. При заморожуванні/розморожуванні таких гамет порівняно з іншими варіантами досліду збільшується після 27 годинного культивування показник дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів до метафази- 2 мейозу (55,3% проти 45,3 і 43,9%) та зменшується показник клітин з порушенням хромосомного матеріалу (25,6% проти 30,2 і 35,1%).
Запліднення in vitro деконсервованих яйцеклітин корів
Успішне запліднення in vitro яйцеклітин корів і подальший розвиток зародків після їх культивування є одним з об'єктивних критеріїв повноцінності мейотичного дозрівання поза організмом гамет самиць.
В трьох дослідних варіантах (табл. 6), в яких заморожували-розморожували
Таблиця 6
Результати запліднення in vitro деконсервованих яйцеклітин корів з різним кумулюсом
Варі-анти дос-ліду Кількість клітин, що підлягали заплід-ненню Термін культиву-вання після запліднення, год Кількість ембріонів на стадіях:
2-х клітин-них 3-4-х клітин-них 5-16 клітин-них всього
n % n % n % n %
А 91 96 4 4,4 5 5,5 5 5,5 14 15,4 c
Б 126 96 5 3,9 6 4,8 2 1,6 13 10,3 ab
В 137 96 6 4,4 4 2,9 2 1,5 12 8,8 a
b : c - P< 0,05; а : c - P < 0,001
і дозрівали поза організмом до метафази- 2 мейозу ооцити корів з щільним багатошаровим кумулюсом (варіант – А), частково розпушеним кумулюсом (варіант – Б) і декількома шарами щільного кумулюсу (варіант – В), після запліднення in vitro і 96-ти годинного подальшого культивування дроблення гамет спостерігали відповідно у 15,4; 10,3 та 8,8% випадках.
При використанні для кріоконсервування ооцитів корів з щільним багатошаровим кумулюсом, після дозрівання і запліднення in vitro деконсервованих гамет самиць було отримано вірогідно більшу не тільки загальну кількість зародків порівняно з іншими експериментальними варіантами досліду, але й вірогідно більшу кількість зародків, що мали більше 2-х бластомерів, відповідно 11,0% проти 6,4% (P< 0,05) та 4,4% (P< 0,001).
Результати із запліднення in vitro деконсервованих яйцеклітин корів, що були заморожені на різних стадіях мейозу наведені в табл. 7.
Аналіз результатів досліджень свідчить, що загальний показник дроблення клітин після запліднення in vitro, що були заморожені на метафазі-2 (21,1%, варіант В) виявився вищим ніж аналогічний показник у клітин, що були заморожені на диплотені (9,4%, P< 0,001 варіант А) і метафазі-1 (14,9%, P< 0,01 варіант Б). В свою чергу цей показник у гамет корів, що були заморожені на метафазі-1 переважав
(P< 0,05) аналогічний показник у клітин, що були заморожені на диплотені мейозу.
Таблиця 7
Результати запліднення in vitro деконсервованих яйцеклітин корів,
що були заморожені на стадіях диплотени, метафази-1 і метафази-2
Варі-анти дос-ліду Кількість клітин, що підлягали заплід-ненню Термін культиву-вання після запліднення, год Кількість ембріонів на стадіях:
2-х клітин-них 3-4-х клітин-них 5-16 клітинних всього
n % n % n % n %
А 139 96 5 3,6 5 3,6 3 2,2 13 9,4 a
Б 107 96 4 3,7 7 6,5 5 4,7 16 14,9 b
В 114 96 5 4,4 10 8,8 9 7,9 24 21,1 c
К 84 96 7 8,3 8 9,6 19 22,6 34 40,5 d
a : b - P < 0,05; b : c - P < 0,01; а : c, a : d, b : d, c : d - P < 0,001
Крім цього виявлено й той факт, що індекс подальшого дроблення зародків великої рогатої худоби (кількість ембріонів, що мають більше 2-х бластомерів/від загальної кількості ембріонів) був також вищим після 96 годинного культивування запліднених in vitro деконсервованих і дозрілих поза організмом яйцеклітин корів, що були заморожені на стадії метафази-2 (79,2%) порівняно з іншими дослідними варіантами, в яких для заморожування використовували клітини на стадії диплотени (61,5%) та метафази-1 (75,0%).
ВИСНОВКИ
1. Чутливість ооцит-кумулюсних комплексів корів до дії низьких температур залежить від стадії їх мейотичного дозрівання. Заморожування гамет корів на метафазі- 2 мейозу підвищує вихід життєздатних і дозрілих клітин після розморожування і короткочасного культивування на 8,0% (P< 0,05) порівняно з клітинами замороженими на стадії диплотени.
2. Рівень дроблення яйцеклітин корів після запліднення in vitro вищий при використанні для заморожування гамет на стадії метафази-2 порівняно з ооцит-кумулюсними комплексами замороженими на диплотені (P< 0,001) та метафазі-1 (P< 0,01) і становить 21,1%.
3. Найбільш перспективні для заморожування є ооцити корів з щільним багатошаровим кумулюсом. Доля таких за морфологічними ознаками клітин із загальної популяції ооцит-кумулюсних комплексів корів придатних для культивування складає 19,5% (5,8±2,2 клітин на яєчник), 55,3% з них після деконсервування і дозрівання поза організмом досягає метафази –2 мейозу, кількість отриманих зародків після запліднення in vitro становить 15,4%.
4. Збільшення концентрації кріопротекторів (гліцерину і пропандіолу) з 50 до 70% у загальному об'ємі вітрифікаційного розчину не призводить до збільшення після заморожування-розморожування і культивування кількості життєздатних та дозрілих до метафази-2 мейозу гамет корів.
5. Ступеневий спосіб виведення кріопротекторів з гамет корів після їх деконсервування за допомогою розчину сахарози більш ефективний (P< 0,05) порівняно з варіантами одноступеневого способу (з використанням 1,0 М; 0,75 М; 0,5 М сахарози) за такими показниками як життєздатність та дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів корів.
6. Попереднє культивування ооцит-кумулюсних комплексів корів перед заморожуванням за умов використання 10 і 20 клітин у 200 мкл культурального середовища підвищує кріорезистентність гамет, що проявляється у збільшенні на 4,6-22,4% після розморожування кількості життєздатних і дозрілих до метафази-2 мейозу клітин.
ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ
1. Для розробки біотехнологічних методів кріоконсервування гамет корів рекомендуємо використовувати для заморожування ооцити з щільним багатошаровим кумулюсом.
2. Для підвищення життєздатності деконсервованих гамет корів рекомендуємо для заморожування використовувати яйцеклітини на стадії метафази- 2 мейозу, а виведення кріопротекторів після розморожування клітин здійснювати за допомогою сахарози ступеневим способом.
3. Результати досліджень можуть бути використані при викладанні лекцій з біотехнології, генетики, криобіології, біології розвитку та відтворення сільськогосподарських тварин у ВУЗах країни.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.
1. Троцький П.А., Гузеватий О.Є. Застосування різних концентрацій вітрифікаційного розчину при заморожуванні ооцитів корів //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 1997.- Вип.3.- Ч.1.- С. 291-294.
2. Оптимальний термін спільного інкубування гамет великої рогатої худоби при заплідненні in vitro /В.А. Яблонський, Е.А. Свідерська, О.Є. Гузеватий, П.А. Троцький //Тваринництво України.- 1998.- №7.- С. 13.
3. Гузеватий О.Є., Троцький П.А. Вплив різних способів виведення кріопротекторів після розморожування та їх вплив на дозрівання ооцитів корів //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 1999.- Вип.8.- Ч.2.- С. 60-63.
4. Гузеватий О.Є., Троцький П.А. Культивування і запліднення in vitro деконсервованих ооцитів корів, що були заморожені на різних стадіях їх мейотичного дозрівання //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 2000.- Вип.12.- С. 34-37.
5. Гузеватий О.Є., Троцький П.А. Оцінка розвитку деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів //Вісник агроекологічної академії.- Житомир, 2000.- С. 140-141.
6. Гузеватий О.Є., Троцький П.А. Кріоконсервування ооцитів корів з різним кумулюсом //Розведення і генетика тварин.- Київ, 2001.- Вип.34.-
С. 126-128.
7. Троцький П.А., Гузеватий О.Є. Порівняльний аналіз різних концентрацій вітрифікаційного розчину при заморожуванні ооцитів корів //Біотехнологічні, селекційні та організаційні методи відтворення, зберігання і використання генофонду тварин.- Київ, 1997.- С. 148-149.
8. Свидерская Э.А., Троцкий П.А., Гузеватый О.Е. Влияние времени совместного инкубирования сперматозоидов и яйцеклеток на получение эмбрионов крупного рогатого скота вне организма //Тезисы докладов региональной конференции молодых ученых и специалистов.- Оренбург, 1997.- Ч.2.- С. 107-108.
9. Троцкий П.А., Гузеватый О.Е. Влияние различных концентраций криопротекторов в витрифицирующем растворе при замораживании ооцитов коров //Интенсификация производства продукции животноводства в Республике Беларусь.- Жодино, 1998.- С. 114.
10. Гузеватый О.Е., Троцкий П.А. Некоторые особености криоконсервирования ооцит-кумулюсных комплексов коров //Актуальные проблемы биологии в животноводстве.- Боровск, 2000.- С. 394-396.
11. Троцький П.А. Вплив різних способів виведення кріопротекторів на життєздатність і дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів //Молоді вчені – тваринництву.- Київ, 2000.- С. 92-93.
Троцький П.А. Кріоконсервування ооцит-кумулюсних комплексів корів на різних стадіях мейотичного дозрівання та оцінка їх життєздатності після деконсервування.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія.- Інститут тваринництва УААН, Харків, 2001.
Викладено експериментальний матеріал з кріоконсервування ооцит-кумулюсних комплексів корів різних стадій їх мейотичного дозрівання. Запропоновані підходи підвищення життєздатності деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів з наступним їх дозріванням і заплідненням in vitro. Досліджено вплив різних концентрацій гліцерину і пропандіолу у вітрифікаційному розчині при заморожуванні ооцит-кумулюсних комплексів корів. Визначена ефективність різних способів виведення кріопротекторів за допомогою сахарози після розморожування гамет корів. Встановлена різна чутливість ооцитів корів до дії низьких температур в залежності від характеру оточуючих їх клітин кумулюсу. Проведено морфологічний і цитогенетичний аналіз незрілих і зрілих гамет корів, ранніх зародків великої рогатої худоби отриманих з деконсервованих, дозрілих і запліднених in vitro яйцеклітин корів.
Ключові слова: біотехнологія, кріоконсервування, яєчники, ооцит-кумулюсні комплекси, гліцерин, пропандіол, сахароза, дозрівання і запліднення in vitro, ембріони.
Троцкий П.А. Криоконсервирование ооцит-кумулюсных комплексов коров на различных стадиях мейотического созревания и оценка их жизнеспособности после деконсервирования. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 – биотехнология.- Институт животноводства УААН, Харьков, 2001.
Диссертационная работа посвящена изучению вопросов криоконсервирования ооцит-кумулюсных комплексов коров различных стадий их мейотического созревания, культивирования и оплодотворения in vitro деконсервированных гамет коров.
Данная работа основана на том факте, что современная биотехнология воспроизведения сельскохозяйственных животных, в том числе и крупного рогатого скота, предполагает интенсивное использование гамет самок на различных стадиях их мейотического созревания, а также зигот и эмбрионов различных стадий их развития, полученных при помощи технологии оплодотворения in vitro. Кроме того, создание криобанков гамет самок - это современный и перспективный путь сохранения генетических резервов пород.
В значительной мере успех замораживания гамет самок сельскохозяйственных животных, в том числе и коров, зависит от правильности выбора защитных веществ – криопротекторов. Нашими исследованиями изучено применение различных концентраций глицерина и пропандиола в витрифицирующем растворе при замораживании ооцит-кумулюсных комплексов коров и установлено, что увеличение концентрации данных криопротекторов с 50 до 70% от общего объема витрифицирующего раствора не приводит к увеличению количества жизнеспособных и созревших вне организма до метафазы-2 мейоза деконсервированых гамет.
Проведен сравнительный анализ использования различных способов выведения криопротекторов после размораживания ооцит-кумулюсных комплексов коров. Выявлено преимущество использования ступенчатого способа выведения криопротекторов из гамет коров при помощи раствора сахарозы по сравнению с вариантами одноступенчатого способа (с использованием 1,0 М; 0,75 M; 0,5 M сахарозы) по таким показателям как жизнеспособность и созревание вне организма.
Установлено, что наиболее перспективны для криоконсервирования ооциты коров с плотнным многослойным кумулюсом. Из общей популяции гамет, пригодных для культивирования, 19,5% (5,8 ± 2,2 клетки/яичник) ооцит-кумулюсных комплексов соответствует данному морфологическому типу, 55,3% из них после деконсервирования и созревания вне организма достигает метафазы-2 мейоза, количество полученых эмбрионов после оплодотворения in vitro cоставляет 15,4%.
Показано, что чувствительность ооцит-кумулюсных комплексов коров к воздействию низких температур зависит от стадии их мейотического созревания. Криоконсервирование гамет коров на метафазе-2 мейоза повышает выход жизнеспособных и созревших клеток после размораживания и краткосрочного культивирования на 8,0%, а уровень получения эмбрионов после оплодотворения in vitro деконсервированных яйцеклеток коров выше при использовании для замораживания гамет на метафазе-2 мейоза и составляет 21,1%.
Проведен морфологический и цитогенетический анализ незрелых и зрелых гамет коров, ранних эмбрионов крупного рогатого скота, полученных из деконсервированных, созревших и оплодотворенных in vitro яйцеклеток коров.
Ключевые слова: биотехнология, криоконсервирование, яичники, ооцит-кумулюсные комплексы, глицерин, пропандиол, сахароза, созревание и оплодотворение in vitro, эмбрионы.
Trotskiy P.A. Cryopreservation of bovine oocyte-cumulus complexes at various stages of in vitro maturation and evaluation their viable after thawing.- Manuscript.
Dissertation on completion of the scientific degree of the candidate of agricultural sciences on the speciality 03.00.20 – biotechnology.- Institute of Animal Science of UAAS, Kharkiv, 2001.
Experimental material on cryopreservation of bovine oocyte-cumulus complexes of various stages of their in vitro maturation is account. Method of approach for viable increasing of bovine oocyte-cumulus complexes after thawing with their following maturation and fertilization in vitro are proposed. The influence of different glycerol and propandiol concentrations in vitrification solution at bovine oocyte-cumulus complexes freezing is investigated. The effective of various methods for cryoprotectors dilution after thawing with the assist of sucrose is reveal. Differend sensibility of bovine oocytes about low temperatures depending on characteristics of environment them cumulus cells is established. Morfological and cytogenetic analysis of unmatured and matured bovine gametes, early embryos of cattle produced from frozen/thawed, matured and fertilized in vitro bovine oocytes.
Key words: biotechnology, cryopreservation, ovaries, oocyte-cumulus complexes, glycerol, propandiol, sucrose, maturation and fertilization in vitro, embryos.
Підписано до друку 11.11.2001 р. Формат 60Х90/16
Ум.друк.арк.0,9. Обл.вид.арк. 0,9
Тираж 100. Зам.96
Київ, вул.Кіквідзе, 20 "Мрія" 295-70-38
| 
