LeuLeuGlnAlaArgThrAsnSerAspGlyArgIleThrValArgGlnAspGluValValIleGlyGlnAspLysAla
1560 CTCCTGCAGGCGCGCACGAATAGTGACGGACGCATCACCGTGCGTCAGGATGAAGTGGTGATCGGGCAGGATAAAGCC
ValLysAlaGlyGluMetTyrThrGlnProAlaValLeuLysAspLysSerThrPheGluIleSerPheThrProAla
1638 GTGAAGGCCGGAGAGATGTATACCCAGCCTGCCGTTCTGAAAGATAAAAGCACATTCGAAATTAGCTTCACTCCAGCC
ThrGlyAlaAsnThrLeuThrGlnThrLeuThrValGluGlnSerAlaAsnValThrGlyAsnThrLeuTyrAlaAla
1716 ACCGGCGCAAACACGCTGACCCAAACGCTGACGGTTGAACAGAGCGCCAATGTGACAGGCAATACGCTGTACGCCGCG
ProAspGlyLeuSerGlnAlaLysGlyThrThrAspSerProLeuAspLeuAlaThrAlaValAspLeuValProPro
1794 CCGGATGGGCTGTCGCAGGCTAAAGGGACGACGGACTCGCCGCTGGATTTAGCCACCGCTGTCGACCTCGTTCCCCCT
GlyGlyGlnIleValLeuAlaAlaValIleIleArgLysGlnProSerArgLeuAlaProArgLeuLysAspLysVal
1872 GGCGGGCAAATTGTATTAGCCGCAGTGATTATCCGCAAACAACCATCCCGGTTAGCGCCACGCCTGAAAGACAAAGTC
LysThrLeuLysAlaAspGlyLysAlaValIleHisGlyLeuLeuLeuAspAlaSerTyrTrpHisIleAsnGlyVal
1950 AAAACCCTGAAAGCCGACGGAAAAGCCGTGATTCACGGGCTCCTGCTGGATGCCAGCTACTGGCATATCAATGGAGTA
AspIleThrAspLysSerLeuArgValGlnGlySerHisAsnLeuIleGluAsnValThrAlaTyrArgAsnAspAsp
2028 GACATTACGGACAAGAGCCTGCGCGTACAGGGTAGCCATAACCTGATCGAGAACGTCACCGCGTATCGGAACGATGAT
ThrGlyIleGlnIleSerSerProAlaAspValGlyArgProLeuTrpAlaSerHisAsnArgValValAsnSerGlu
2106 ACCGGCATTCAAATTTCCTCTCCGGCGGATGTCGGACGCCCGCTGTGGGCCAGCCATAACCGGGTGGTGAATTCTGAA
SerPheAsnAsnGluAspProGlyLysIleAsnAlaAspGlyPheAlaValLysMetArgValGlyGluGlyAsnArg
2184 TCCTTTAATAACGAAGATCCGGGTAAAATTAACGCCGATGGCTTTGCGGTGAAAATGCGCGTAGGGGAGGGTAACCGG
LeuGluGlyCysTyrSerHisAspAsnIleAspAspGlyPheAspLeuPheAsnLysIleGluAspGlyAlaAsnGly
2262 CTGGAGGGCTGTTACTCACACGATAATATCGACGACGGCTTCGACCTGTTCAATAAGATTGAGGACGGCGCTAACGGC
ValValValIleGluAsnSerIleAlaArgAsnAsnThrSerAsnGlyPheLysLeuGlyGlyGluGlyGlnProVal
2340 GTTGTGGTGATCGAGAACTCCATTGCCCGCAATAATACCAGCAACGGCTTTAAGCTCGGTGGGGAAGGGCAGCCGGTC
AlaHisGluValArgAsnSerIleAlaIleGlyAsnHisLeuAspGlyPheThrAspAsnPheAsnProGlyLysLeu
2418 GCCCACGAGGTACGCAACAGCATCGCCATCGGCAATCATCTGGACGGTTTTACCGACAACTTCAATCCTGGCAAGCTG
ValValValAsnAsnValAlaValAspAsnGlnArgPheAsnTyrLeuPheArgProSerProTyrGlyAlaProGlu
2496 GTAGTGGTCAATAACGTCGCGGTGGATAACCAGCGCTTTAACTATCTATTCCGCCCAAGCCCGTATGGCGCACCGGAA
ThrGlnGlyThrPheSerAspAsnLeuSerLeuArgSerGlnProGlyLysTyrAspAspAlaValIleGlyAsnIle
2574 ACGCAGGGTACCTTCAGCGATAACCTTTCTCTGCGCAGCCAGCCGGGGAAATATGACGATGCCGTTATCGGGAACATT
AspAspSerAsnTyrPheIleHisGlyGlyArgSerIleAsnAlaGlnGlyLysSerIleHisSerAlaAspTyrGln
2652 GATGATAGCAACTACTTTATCCACGGTGGCCGAAGCATCAACGCCCAGGGAAAGAGCATTCACAGCGCCGACTATCAG
ThrLeuThrLeuProAspProLeuThrArgGluAlaAspGlySerPheAsnThrGlyAsnPheLeuSerArgAsn
2730 ACTCTGACGCTGCCGGATCCGCTGACGCGTGAGGCCGACGGCAGCTTTAACACCGGTAACTTCCTTAGCCGCAATTAA
2808 CCAGGGACACGCTAAAAACATAAAGGTCGCCCTCGGGCGACCTTTTTACTTCCTTTCCTGCTTCACACCGCATGTGTT
2886 GTCGTTTTAGTTAGCGGTACAGCGCATAAGCAGTCTGGNGAGCGGCTTCTTAGTGGTTGACGTAC
Рис. 2. Визначена нуклеотидна послідовність AgeI- EcoRV фрагмента плазміди pLC28Р та виведена амінокислотна послідовність первинного рelX- транслянту. Старт - та стоп - кодони, а також поліТ - ланцюг виділено жирним шрифтом. Підкреслено GC- багату паліндромну послідовність. Підкреслено початок ВРЗ, що транскрибується по протилежному ланцюгу ДНК
В межах секвенованого фрагмента виявлено початок ще однієї ВРЗ, що гомологічна glmU-гену E. coli та направлена протилежно до напрямку транскрипції pelX-гена (див. рис.2). В хромосомі E. chrysanthemi 3937 аналогічна ВРЗ має таке ж, як і у K. oxytoca VN13 розташування та орієнтацію стосовно pelX- гена, який кодує екзопектатліазу (Shevchik et al., 1999). Ці дані
можуть свідчити на користь спільного походження pelX-генів вказаних бактерій.
Отриману нуклеотидну послідовність було порівняно з нуклеотидними послідовностями споріднених генів, які розміщені в електронному банку генів. Єдиною знайденою гомологією були незначні ділянки ДНК гена екзопектатліази (pelX) Erwinia chrysanthemi (рис.3).
Рис. 3. ДНК- гомологія повних послідовностей pelX- генів K. oxytoca VN13 та E. chrysanthemi. Kl - K. oxytoca VN13, Erw - E. chrysanthemi. Жирна лінія відповідає гомологічним ділянкам, штрихова- ділянкам, де гомологія відсутня
Для пошуку потенційного промотору pelX- гена було використано програму NNPP, за допомогою якої знайдено два таких промотори з високим рейтингом за критеріями, що враховуються програмою (рис.4). Можливо, що у K. oxytoca VN13 обидва визначених промотори є функціональними, транскрипція з яких відбувається в різних умовах.
Рис. 4. Промоторна ділянка pelX- гена. Послідовності потенційних промоторів підкреслено чорними лініями. Вказано рейтинг. Потенційні точки ініціації транскрипції позначено “+1”, відповідні нуклеотиди вказано великими літерами. Потенційні операторні ділянки для KdgR- репресора виділено сірим.
Оскільки більшість пектиназних генів бактерій роду Erwinia контролюється KdgR- репресором, ми шукали потенційні KdgR- оператори в
промоторній ділянці pelX- гена. KdgR- оператор є послідовністю AATRAAAYRNYRTTTYATT, де R- пурин, Y- піримідин, N- будь-який нуклеотид. Було знайдено два потенційні KdgR- оператори, де 15 з 18 та 16 з 18 нуклеотидів збігаються з консенсусом (див. рис.4). Розташованість KdgR- операторів всередині промоторної ділянки pelX вказує на зарепресованість оперону в разі відсутності індукторів. У E. chrysanthemi індукторами експресії пектиназних генів є проміжні продукти катаболізму пектину, в даному випадку- 5-кето-4-дезоксиуронат, 2,5- дикето-3- дезоксиглюконат та 2- кето- 3- дезоксиглюконат (КДГ). Варто зазначити, що Е. coli має здатність катаболізувати гексуроніди, і головним регулятором транскрипції задіяних генів є також KdgR. Регуляція експресії пектиназних генів E. chrysanthemi в E. coli зберігається.
Аналіз виведеної амінокислотної послідовності первинного транслянту pelX- гена. Первинний транслянт pelX-гена, визначений програмою “Generunner”, містить 732 амінокислотні залишки та має вираховану ізоелектричну точку pI 6,34 (див. рис. 2). Цей поліпептид було порівняно з іншими спорідненими білками, які депоновані в електронному банку генів. Було виявлено високий рівень гомології даного поліпептиду за амінокислотною послідовністю щодо екзополігалактуронатліази Erwinia chrysanthemi та відсутність суттєвої гомології з бактеріальними ендопектатліазами (рис.5).
Найбільший рівень гомології як з екзо- так і з ендопектатліазами спостерігається в певній ділянці послідовності в межах 484-623 амінокислотних залишків РelX. Вказана консервативна ділянка може відповідати реакційному центру ферменту. Ще одна ділянка з високим рівнем гомології виявлена тільки для екзопектатліаз і розташована в діапазоні від 38 до 121 амінокислотного залишку РelX K. oxytoca VN13, вона може відповідати центру зв'язування ферменту із субстратом.
Оскільки більшість пектатліаз ервіній є секреторними білками, то ми шукали потенційний сигнальний пептид на N- кінці первинного pelX- транслянту. Для цього використовували програму “SignalP prediction 2.0”. Згідно висновків програми, існує ймовірність рівна 95%, що послідовність з 32 амінокислотних залишків, яка транслюється з першого ATG даної ВРЗ, є сигнальним пептидом (див. рис.2). Ці дані дозволяють зробити висновок про ймовірну периплазматичну або позаклітинну локалізацію зрілого РelX- білка, що узгоджується з даними щодо РelX E. chrysanthemi, який є периплазматичним білком (Shevchik et. al., 1999).
Рис.5. Порівняння амінокислотних послідовностей. K.ox- Klebsiella oxytoca VN13, E.chr.- Erwinia chrysanthemi, B.hal.- Bacillus halodurans, B.sp.- Bacillus sp., Cl.cel- Clostridium cellulovorans PelX- екзопектатліази, PelН, PelА – ендопектатліази
Створення мутантного штаму K. oxytoca VN13 з інактивованим pelX-геном. З метою створення мутанту спочатку інактивували pelX-ген на плазміді. Для цього клонували ЕсоRI фрагмент плазміди рНР45ΩСm, розміром 3,6 тис. п. н., що містить послідовність саt–гена та кодує резистентність до хлорамфеніколу (CmR), в унікальний ЕсоRI сайт плазміди pLC28P, який знаходиться в кодуючій частині pelX-гена. Отримана плазміда рLC28P::Сm мала розмір 9,3 тис. п. н. і містила cat- ген у структурній частині pelX- гена (рис.6).
Рис. 6. Схема інактивації pelX- гена на плазміді
Нездатність штамів E.coli з плазмідою рLC28P::Сm до продукції пектатліази підтвердила факт інактивації pelX-гена.
Для перенесення мутантного гена в хромосому K. oxytoca VN13 було використано плазміду рJP5603, що реплікується тільки в спеціальних штамах E.coli, які синтезують допоміжний π-білок. Ця плазміда може бути мобілізована з штаму E. coli S17-1λpir завдяки наявності в її послідовності mob-сайта плазміди RP4. Було створено плазміду pFU101, що містить два фрагменти pelX- гена, розділених геном стійкості до хлорамфеніколу в складі вектора рJP5603. Плазмідою pFU101 було трансформовано мобілізуючий штам E.coli S17-1λpir для її кон’югативного перенесення в K. oxytocа VN13.
Було відібрано два клони транскон’югантів, які мали стійкість до хлорамфеніколу та не мали стійкості до канаміцину, що може свідчити про втрату плазміди та інтеграцію мутантної копії pelX-гена в хромосому K. oxytoca VN13.
Для перевірки даного припущення використовували метод ДНК-ДНК блот-гібридизації. Тотальну ДНК мутантних клонів, а також K.oxytoca VN13 дикого типу гідролізували окремо рестриктазами BglII, для якої відсутній сайт рестрикції в межах гена з інсерцією, та HindIII, гідроліз якою вищеплює cat- ген з pelX-гена (рис.6). Для виявлення гена стійкості до хлорамфеніколу як зонд використовували HindIII-фрагмент плазміди рНР45Ω-Сm розміром 3,6 тис. п. н. Для ідентифікації гена pelX гібридизацію проводили з SacI-XbaI фрагментом pLC28P розміром 3,0 тис. п. н., що містить всю послідовність pelX.
Гібридизація з pelX-зондом показала, що клони мутантів, які були гідролізовані BglII, представлені однією гібридизаційною смугою, що відповідає цілому pelX-гену, теж саме спостерігається для ДНК K. oxytoca дикого типу (рис. 7А). На рисунку видно, що гібридизаційні смуги, які відповідають фрагменту ДНК мутантних клонів, що містить pelX-ген, мають більшу молекулярну масу через вставку cat- гена, ніж аналогічна смуга ДНК K. oxytoca VN13 дикого типу. ДНК клонів мутантів, розщеплена рестриктазою HindIII (рис. 7А) представлені двома гібридизаційними смугами. Це пояснюється тим, що фермент HindIII, вищеплює вставку з cat-геном, і, таким чином, розбиває фрагмент з pelX- геном на дві частини, з кожною з яких і гібридизувався зонд. У варіанті з ДНК K. oxytoca VN13 дикого типу, також обробленою HindIII, спостерігається тільки одна смуга, що є результатом відсутності сайта рестрикції для даної рестриктази всередині pelX K. oxytoca VN13.
Гібридизація з cat-зондом показала, що обидва мутанти мають цей ген в хромосомі (рис. 7Б). З рисунка видно, що cat-ген представлений у цих мутантів однією копією. Гібридизаційна смуга у ДНК клонів мутантів, розщеплена рестриктазою HindIII (рис. 7Б) відповідає розміру фрагмента вставки cat-гена в pelX, що вищеплюється даною рестриктазою.
Рис.7. А- Гібридизація з зондом “pelX”. З- зонд; Д.Т.- ДНК K. oxytoca VN13дикого типу, М1 та М2- ДНК мутантних клонів. Б- Гібридизація із зондом “Cm”. З- зонд; Д.Т.- ДНК K. oxytoca VN13 дикого типу, М1 та М2- ДНК мутантних клонів. Вказано рестриктази, якими проводився гідроліз
Результати гібридизаційного аналізу свідчать, що перевірені клони транскон’югантів є мутантами з інактивованим за рахунок інсерції cat-гена геном pelX, а також, що K.oxytoca VN13 має одну копію pel-гена з даною нуклеотидною послідовністю в геномі.
Для того, щоб перевірити наявність у K. oxytoca VN13 інших пектатліазних генів було проведено перевірку пектатліазної активності мутантного клону. Отримані результати наведено в таблиці 2.
Таблиця 2
Пектатліазна активність K. oxytoca VN13 дикого типу та мутантного штаму з інактивованим pelX-геном у хромосомі
Дані, наведені в таблиці дозволяють стверджувати, що K. oxytoca VN13 має в геномі більше ніж один ген, який кодує пектатліазу.
Створення гібридної конструкції, що містить кодуючу частину lacZ-гена під pelX-промотором. Для вивчення характеру експресії клонованого гена було створено гібридну конструкцію, яка містить кодуючу частину гена в-галактозидази lacZ під pelX-промотором. Для створення вказаної конструкції було використано плазміду pCB192 з безпромоторним lacZ-геном. Полілінкер pCB192 розташований таким чином, що між ним та початком кодуючої частини lacZ знаходяться три стоп-кодони, які термінують трансляцію за трьома рамкам зчитування (рис. 8), а також сайт зв’язування з рибосомами, що дозволяє тран-
| 
