ВИСНОВКИ
На ізольованих тимоцитах щура проведено порівняльне дослідження концентрації Са2+ та параметрів Са2+-транспортних систем мітохондрій та ЕПР у контролі та за дії апоптогенних чинників - іонізуючої радіації (4,5 Гр) та Н2О2 (0,1 мМ). Виявлено відмінності у функціонуванні систем підтримання кальцієвого гомеостазу та встановлено можливі причини його порушення на ранньому етапі апоптозу тимоцитів.
Концентрація вільного Са2+ у цитозолі тимоцитів не змінюється упродовж 5-годинної інкубації клітин у контролі та після рентгенівського опромінення. За інкубації тимоцитів у присутності 0,1 мМ Н2О2 відбувається значне підвищення [Ca2+]i, яке виявляється через 15 хв після дії чинника, перевищує контрольний рівень у 6 разів через 3 год інкубації і залишається у 3,5 рази вищим порівняно з контролем через 5 год.
Через 3 год після дії досліджуваних чинників виявлено зростання вмісту продуктів міжнуклеосомного розщеплення ДНК у тимоцитах. У випадку зниження концентрації Са2+ у цитозолі клітин (інкубація у номінально безкальцієвому середовищі) фрагментація ДНК, спричинена дією Н2О2, запобігається, а у опромінених тимоцитах - послаблюється
Вхід Са2+ через плазматичну мембрану тимоцитів не є причиною підвищення [Ca2+]i на ранньому етапі дії Н2О2 (до 1 год), оскільки пасивний вхід катіона у клітини не посилюється, а внесення у середовище інкубації блокаторів Са2+-каналів плазматичної мембрани верапамілу та ніфедіпіну, так само як і заміна Na+ на холін для пригнічення Na+/ Са2+-обмінника не впливають на спричинене дією Н2О2 підвищення [Ca2+]i.
Виявлено, що внесення Н2О2 у суспензію тимоцитів, попередньо інкубованих у номінально-безкальцієвому середовищі та оброблених тапсигаргіном з метою спустошення Са2+-депо ЕПР, викликає додаткове підвищення [Ca2+]i.
За інкубації тимоцитів у присутності 5 мкМ циклоспорину А спричинене дією H2O2 підвищення [Ca2+]і у період до 15 хв інкубації повністю попереджається, а у подальшому рівень [Ca2+]i виявляється зниженим у 2 рази, що вказує на внесок Са2+-пулу мітохондрій у дисбаланс кальцієвого гомеостазу.
Пермеабілізовані дигітоніном тимоцити здатні накопичувати Са2+ з середовища інкубації. Визначено активність Са2+-транспортних систем мітохондрій і ЕПР та встановлено, що початкова швидкість акумуляції Са2+ (V0 ) є значно вищою у мітохондріях, ніж у ЕПР ( 106 ± 9 та 14 ± 2 пмоль Ca2+/хв на 106 клітин відповідно).
Активність Са2+-акумулюючої системи мітохондрій тимоцитів значно пригнічується через 15 хв після дії Н2О2, акумуляція катіону в ЕПР знижується меншою мірою, таким чином, домінуюча роль мітохондрій у накопиченні Са2+ з цитозолю втрачається.
Після опромінення тимоцитів функціональна активність Са2+-транспортної системи ЕПР зберігається, однак акумуляція катіону мітохондріями пригнічується. Таке пригнічення є менш значним і виявляється пізніше, ніж після дії Н2О2.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Борисов С. І., Гребіник Д. М., Матишевська О. П. Са2+-АТФазна активність та АТФ-залежне накопичення Са2+ у ядрах лімфоцитів селезінки Х-опромінених тварин // Вісник Київського університету. Серія Біологія. – 2001. – № 33. – С. 21-23. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури за темою досліджень, виділення лімфоїдних клітин з селезінки щурів)
Матишевська О. П., Борисов С. І., Гребіник Д. М. Особливості регуляції концентрації Са2+ у ядрі // Український біохімічний журнал. – 2002. – Т. 74, №5. – С. 5-11. (Особистий внесок здобувача – участь у опрацюванні, аналізі та інтерпретації літературних даних, написання окремих частин огляду).
Гребіник Д.М., Артеменко O.Ю., Семенов Ю.В., Зима В.Л., Матишевська О.П. Вплив рентгенівського опромінення і пероксиду водню на концентрацію вільного цитозольного Са2+ у тимоцитах // Вісник Київського університету. Серія Біологія. – 2003. – № 38. – С. 16-18. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури, виділення тимоцитів, навантаження клітин зондом, підготовка клітин до вимірювання концентрації Са2+).
Гребинык Д. М., Коваль Т. В., Матышевская О. П. Исследование кальциевого гомеостаза в тимоцитах при апоптозе. I. Повышение концентрации цитозольного Са2+ на ранней стадии апоптоза, индуцированного пероксидом водорода // Український біохімічний журнал. – 2004. – Т. 76,№ 6. – С. 63 – 69. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури, виділення тимоцитів, опромінення суспензії клітин, інкубація та навантаження клітин зондом, вимір концентрації Са2+ у цитозолі тимоцитів).
Гребинык Д. М., Гринюк И. И., Матышевская О. П. Исследование кальциевого гомеостаза в тимоцитах при апоптозе. II. Аккумуляция Са2+ митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77,№ 2. – С. 78 – 81. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури за темою досліджень, виділення тимоцитів, інкубація клітин та їх пермеабілізація дигітоніном, визначення швидкості Са2+-транспортних процесів радіоізотопним методом).
Borysov S., Matyshevska O., Semenov J., Grebinyk D., Kucherenko M.. ATP-dependent Ca2+ accumulation in rat spleen lymphocyte nuclei and its increasing during radiation-induced apoptosis // Abstracts of EMBO Workshop on Signal Transduction-Mediated Regulation of Nuclear Transport (August, 11-14, 2001). – Strasbourg,2001. - P. 57.
Koval T. V., Dvorshchenko K. O., Grebinik D. M.. Complex study of DNA lesions during radiation- and H2O2-induced apoptosis in cells population // Conference for students, PhD-students and young scientists on molecular biology and genetics (September, 20-22, 2001). –– Kyiv,2001. - P. 46.
Гребіник Д. М., Борисов С. І., Семьонов Ю. В. Транспорт Ca2+ в ядрах лімфоцитів селезінки х-опромінених щурів // Український біохімічний журнал. Спеціальний випуск. – Т. 74,№ 4б(додаток 2). Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду (1-3 жовтня, 2002). – Чернівці, 2002. - С. 217.
Koval T. V. Grebinyk D. M., Gerasimenko O. O. Changes in GSH level and free cytosolic Ca2+-concentration preceed DNA fragmentation during H2O2-induced thymocyte apoptosis // Conference for young scientists, PhD-students and students on molecular biology and genetics (September, 25-27, 2003). – Kyiv, 2003. – P. 87.
Grebinyk D., Semenov Y., Matyshevska O.. Increased level of free cytosolic Ca2+ in H2O2-treated rat thymocytes is the result of Ca2+ depots depletion // Blackwell publishing. Abstracts of the 29th meeting of the federation of the European biochemical societies (26 June – 1 July, 2004). – Warsaw, 2004. - P. 190-191.
Grebinyk D., Semenov Y., and Matyshevska O. Increased level of free cytosolic Ca2+ in H2O2-treated rat thymocytes is the result of Ca2+ depots depletion // Abstracts of the Forum of young scientists of 29th meeting of the federation of the European biochemical societies (June 24-26, 2004). – Warsaw, 2004. - P. 23.
Grebinyk D. M., Koval T. V., Grynyuk I. I., Matyshevska O. P. Oxidative stress and increase in cytosolic Ca2+ precedes DNA fragmentation during H2O2-induced thymocyte apoptosis // Український біохімічний журнал. Спеціальний випуск. –– Т. 77,№2. Abstracts of 5th Parnas conference “Molecular mechanisms of cellular signalling” (April, 27-29, 2005). - Kyiv, 2005.- P. 109.
АНОТАЦІЯ
ГРЕБІНИК Д.М. Кальцієвий гомеостаз на ранніх етапах апоптозу тимоцитів щура. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – Біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ. - 2005.
Дисертація присвячена порівняльному дослідженню концентрації Са2+ в цитозолі та активності Са2+-транспортних систем мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму тимоцитів на ранніх етапах апоптозу, викликаного іонізуючою радіацією у дозі 4,5 Гр або пероксидом водню у концентрації 0,1 мМ.
Виявлено, що після рентгенівського опромінення ізольованих тимоцитів концентрація Са2+ у цитозолі не змінюється, тоді як за дії Н2О2 - значно підвищується у період, що передує міжнуклеосомній фрагментації ДНК. Спричинена дією Н2О2 фрагментація ДНК запобігається у випадку зниження концентрації Са2+ у цитозолі. Визначено активність та розраховано кінетичні параметри Са2+-акумулюючих систем мітохондрій та ЕПР пермеабілізованих дигітоніном тимоцитів у контролі та за дії досліджуваних апоптогенних чинників. Встановлено, що провідна роль Са2+-акумулюючої системи мітохондрій у накопиченні Са2+ з цитозолю на ранньому етапі після дії Н2О2 втрачається, знижується накопичення катіону в ЕПР. Менш значне пригнічення Са2+-акумулюючої системи мітохондрій виявлено у опромінених клітинах.
Ключові слова: кальцій, тимоцити, пероксид водню, іонізуюча радіація, апоптоз, мітохондрії, неспецифічна проникність мітохондріальних мембран, циклоспорин А, дигітонін.
АННОТАЦИЯ
ГРЕБИНЫК Д.Н. Кальциевый гомеостаз на ранних этапах апоптоза тимоцитов крысы. – Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - Биохимия. — Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев. - 2005.
Диссертация посвящена сравнительному исследованию концентрации Са2+ в цитозоле и активности Са2+-траспортирующих систем митохондрий и эндоплазматического ретикулума тимоцитов на ранних этапах апоптоза, индуцируемого ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр или пероксидом водорода в концентрации 0,1 мМ.
Выявлено, что после рентгеновского облучения изолированных тимоцитов концентрация Са2+ в цитозоле не изменяется, в то же время после добавления пероксида водорода к суспензии тимоцитов было зарегистрировано значительное повышение цитозольной концентрации катиона, предшествующее межнуклеосомному расщеплению ДНК. Показано, что вызванная действием Н2О2 фрагментация ДНК предотвращается при условии снижения концентрации Са2+ в цитозоле тимоцитов. Вход катиона в клетки через плазматическую мембрану на раннем этапе (до 1 ч) после облучения не усиливался по сравнению с контролем, а в обработанных Н2О2 тимоцитах - угнетался. Внесение селективных блокаторов Са2+-каналов верапамила и нифедипина в инкубационную среду, а также инкубация тимоцитов в безнатриевой среде для блокирования Na+/Ca2+-обменника в плазматической мембране, не влияли на вызванное действием Н2О2 раннее повышение уровня Са2+, что свидетельствует о роли внутриклеточных Са2+-депо в его обеспечении. Добавление Н2О2 к предварительно обработанным тапсигаргином тимоцитам индуцировало дополнительное повышение уровня Са2+ в цитозоле, добавление же циклоспорина А к обработанным Н2О2 клеткам приводило к предотвращению повышения уровня Са2+ в цитозоле в первые 15 мин инкубации и, впоследствии, к снижению этого уровня в 2 раза. На модели пермеабилизованных дигитонином тимоцитов с использованием специфических блокаторов изучена активность и рассчитаны кинетические параметры Са2+-транспортных систем митохондрий и ЭПР, установлена ведущая роль Са2+-аккумулирующей системы митохондрий в накоплении Са2+ из цитозоля тимоцитов. Выявлено значительное угнетение Са2+-аккумулирующей системы митохондрий, снижение накопления катиона в эндоплазматический ретикулум тимоцитов на раннем этапе действия пероксида водорода и менее выраженное падение Са2+-аккумулирующей способности митохондрий в облученных клетках.
Ключевые слова: кальций, тимоциты, пероксид водорода, ионизирующая радиация, апоптоз, митохондрии, неспецифическая проницаемость митохондриальных мембран, циклоспорин А, дигитонин.
ANNOTATION
GREBINYK D.M. Calcium homeostasis at the early stages of rat thymocyte apoptosis. – The manuscript.
Dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.04 — Biochemistry. Kyiv Taras Shevchenko National University, Kyiv. - 2005.
The dissertation covers the comparative studies of cytosolic calcium concentration and activity of thymocyte energy-dependent Ca2+-transporting systems of mitochondria and endoplasmic reticulum at the early stages of apoptosis induced by ionizing radiation in a doze of 4,5 Gy or 0,1 mM hydrogen peroxide.
It was shown that in the period which precedes internucleosomal DNA fragmentation there were no changes of cytosolic Ca2+-concentration in x-irradiated thymocytes, while in peroxide-treated thymocytes an early and sustained increase of cytosolic calcium was observed. It was shown that the internucleosomal DNA fragmentation in peroxide-treated thymocytes is inhibited when the level of cytosolic calcium concentration is decreased. The activity and kinetic parameters of Ca2+-transporting systems in mitochondria and endoplasmic reticulum of control and x-irradiated or peroxide-treated thymocytes permeabilized with digitonin were measured. It was revealed that the ability of mitochondria to uptake calcium from cytosol is lost during the early period after H2O2 action, and the accumulation of calcium to ER is inhibited too. The less evident inhibition of Ca2+-transporting system in mitochondria of x-irradiated cells was observed.
Key words: calcium, thymocytes, hydrogen peroxide, X-irradiation, apoptosis, mitochondria, non-specific mitochondrial permeability transition, cyclosporin A, digitonin.
| 
