Библиотечный каталог авторефератов Украины

         a                                                                       б

Рис. 5. Галуження Paecilomyces lilacinus 1941: а – на сусло-агарі, б – на голодному агарі, ×63

Базуючись на викладках Prosser [1993] з приводу взаємозв’язку ОГР та радіальної швидкості росту, ми поєднали вищевказані два параметри та отримали новий показник – здатність гриба освоювати запропонований субстрат. Порівнюючи значення інтенсивності освоєння субстрату на СА та ГА, в залежності від того, як вони змінювались при перенесенні штаму на лімітоване за основними поживними речовинами середовище, ми робили висновки про характер росту досліджених нами штамів в несприятливих умовах існування.

Більшість вивчених нами штамів (14 з 23) краще освоювала багате середовище (Рис. 4в). Решта (9 штамів) проявила здатність однаково освоювати СА та ГА. Цікаво, що з цих 9 штамів, 6 були виділені з радіоактивних субстратів. Тобто, можна припустити, що такі ізоляти були більш пристосовані до несприятливих умов існування.

При дослідженні інтенсивності освоєння субстрату на початкових етапах онтогенезу (20-24 год.) було відмічено, що у швидкоростучих видів вона була значно меншою, ніж надалі, а у повільноростучих видів – навпаки.

Враховуючи вивчені ростові показники, можна сказати, що освоєння радіоактивних субстратів дослідженими нами грибами відбувається, як мінімум, двома шляхами. Перший реалізують гриби, які характеризуються уповільненим ростом та утворенням великої кількості дрібних конідій, і як наслідок – великої кількості колоній. Другий спосіб реалізують гриби, які мають високу швидкість росту міцелію та слабке конідієутворення. Для першого типу був притаманний уповільнений ріст на початкових етапах онтогенезу та його значне збільшення в процесі подальшого розвитку, і для другого – швидкий ріст на початку, який уповільнюється по мірі росту гриба.

Найбільш характерні представники, які реалізують перший спосіб освоєння субстрату – штами видів C. sphaerospermum та M. isabellina, а види, яким притаманний другий спосіб – A. alternata та U. consortiale. Решта видів поєднує в собі ознаки обох зазначених способів освоєння субстрату. 

РОЗДІЛ 4. Порівняльне вивчення реакцій радіотропізму та фотореакцій мікроскопічних грибів

Процес пошуку штамів з ознакою радіотропізму почався в 90-х роках та продовжується досі. Дослідження цього напрямку розпочались роботами Н.М. Жданової та Т.І. Редчиць. Вони розробили модельну систему для виявлення позитивного радіотропізму, в якій згодом було перевірено 46 видів 25 родів (202 штами). Про ознаку позитивного радіотропізму висновки робили за морфологічним показником – направленим ростом грибних апексів до точкового джерела зовнішнього γ-випромінювання.

Ознаку позитивного радіотропізму виявили у 17 видів 9 родів (38 штамів), що складало 18,8 % від загального числа досліджених культур (Рис. 6, 7).

               a                                                         б

Рис. 6. Реакція радіотропізму Penicillium roseo-purpureum 147 (а – дослід, б – контроль), х280

               а                                                         б

Рис. 7. Реакція радіотропізму Aureobasidium pullulans 2275 (а – дослід, б – контроль), х280

Практично всі штами, що проявили реакцію позитивного радіотропізму, були виділені з радіоактивних субстратів зони відчуження ЧАЕС. Виключення становив лише штам A. pullulans 2275, виділений з місця з фоновим рівнем радіоактивності. Ознака позитивного радіотропізму була притаманна як темногпігментованим, так і світлозабарвленим штамам вивчених грибів (з 18 досліджених видів грибів, представники яких характеризувались ознакою радіотропізму, 9 були темнопігментованими та 9 – світлозабарвленими). Ця ознака відноситься до розряду адаптивних реакцій виду на забрудненість оточуючого середовища та є не видовою, а штамовою ознакою.

Позитивний радіотропізм у більшості штамів відмічали на стадії утворення міцелію та його початкового галуження. Але у окремих штамів він проявлявся на стадії утворення репродуктивних органів (P. spinulosum) або протягом всього життєвого циклу (U. consortiale).

Дослідження фотореакцій грибів (Рис. 7, 8) проводили в модифікованій модельній системі для визначення ознаки радіотропізму, але джерело γ-випромінювання в ній було замінене на джерело слабкого освітлення білим світлом.

                а                                                          б

Рис. 8. Фотостимуляція росту первинного міцелію Penicillium roseo-purpureum 147 (а – дослід, б – контроль), х 63

                   а                                                                б

Рис. 9. Фотостимуляція росту первинного міцелію Aureobasidium pullulans 2275 (а – дослід, б – контроль), х 63

Освітлення проводили протягом 5 год. та в кінці досліду порівнювали освітлений препарат з контрольним препаратом того ж штаму, який весь час знаходився у темряві. До початку експерименту конідіальні суспензії кожного штаму вирощували 17-20 год. (в залежності від виду) в темряві при температурі 25±20С до досягнення ними частоти проростання конідій 10-20% та довжини міцелію 50-100 мкм.

При визначенні фотостимуляції росту грибів найбільш інформативним параметром була стимуляція росту міцелію з галуженням 1-го порядку, яка у штамів різних видів складала від 35% до 167% у порівнянні з контролем (Рис. 10).

Проростання спор стимулювалось таким світлом майже у всіх штамів з ознакою позитивного радіотропізму, тоді як на їх галуження слабке освітлення білим світлом низької інтенсивності практично не впливало.

РОЗДІЛ 5. Дослідження впливу перекису водню на апікальний ріст мікроміцетів

Обидві вищевказані модельні системи – для визначення радіотропізму та фотостимуляції грибів – були створені на основі рідких суспензій грибних конідій. Дія іонізуючого випромінювання на воду призводить до утворення нестабільних продуктів радіолізу, які зазнають подальшого перетворення, формуючи численні активні форми кисню. Одною з найнебезпечніших для клітини та найстабільнішою активною формою кисню є перекис водню.

Вплив дії градієнту концентрацій перекису водню на швидкість росту грибних гіф вивчали на трьох видах – A. alternata, C. сladosporioides та P. lilacinus, кожен з яких був представлений штамами, виділеними з радіоактивних субстратів та контрольними – з відносно чистих за вмістом радіонуклідів місцеіснувань (Рис. 11). Тривалість досліду – 90 хв.

Штами, виділені з радіоактивних субстратів, проявили більшу резистентність до високих концентрацій (10-2 М – 10-1 М) перекису водню, ніж контрольні. Це виражалось, головним чином, в різниці концентрацій перекису водню, які викликали зупинку росту гіф та здатності до відновлення росту після припинення дії таких концентрацій. Так, ріст грибів, виділених з радіоактивно забруднених субстратів, зупинявся при концентрації H2O2 10-2 М (вид A. аlternata – 10-1 М), а контрольних штамів – при 10-3 М (A. аlternata – 10-2 М).

Після припинення дії перекису водню здатність до повного відновлення росту гіф через 3-7 год. мали лише штами, виділені з радіоактивно забруднених субстратів (Рис. 12).

   Рис. 12. Відносна швидкість росту грибних гіф при концентрації 10-2 М Н2О2 та після їх  перенесення на середовище без Н2О2.

*   *   *

Аналізуючи ростові показники штамів, вилучених з зони відчуження ЧАЕС, ми дійшли до висновку, що існування в умовах підвищеної радіоактивності практично не вплинуло на такі консервативні для грибів показники як радіальний ріст та галуження. Крім того, було визначено 2 основних типи освоєння субстрату дослідженими грибами, що може стати у нагоді при створенні екологічних прогнозів щодо зони відчуження ЧАЕС.

Порівнюючи реакції радіотропізму та фотореакції вивчених штамів, ми встановили, що ріст практично всіх ізолятів, що характеризувались чіткими реакціями позитивного радіотропізму, стимулювався слабким білим світлом (1 лк). При цьому ми не спостерігали класичних реакцій фототропізму, а констатували фотостимуляцію міцелію та проростання спор, тобто, вочевидь, реакція радіотропізму не є звичайною реакцією на світло. Оскільки співпадіння цих двох реакцій було повним, можна припустити існування між ними певного зв’язку, який, можливо, пов’язаний з універсальністю фоторецепторних систем у грибів. Метод визначення фотостимуляції грибів як ознаки, сполученої з ознакою позитивного радіотропізму, може знайти практичне застосування для скринінгу штамів, які проявляють ознаку позитивного радіотропізму без використання складних, дорогих та небезпечних радіоактивних джерел. Такі штами, в свою чергу, можуть бути перспективними в подальших розробках по знешкодженню радіоактивних відходів.

На прикладі впливу перекису водню, як продукту радіолізу води, було показано більшу резистентність штамів, вилучених з високорадіоактивних субстратів, до іонізуючого випромінювання.

Існування живих організмів в природі відбувається згідно з певними закономірностями, які в екології отримали назву життєвих стратегій [Grime, 1988; Pugh, 1980; Уиттекер, 1980]. За класифікацією Веліканова та Сидорової [Великанов, Сидорова, 1983] практично всі вивчені нами види грибів поєднують в собі ознаки представників r- та K-стратегів – більшість з них характеризується активним та досить швидким ростом; в той же час всі вони є достатньо стійкими до екстремальних умов існування, які, безумовно, склалися в зоні відчуження ЧАЕС. Тобто ці види з великою долею ймовірності можна віднести до групи Р (патієнти). Виключенням можуть бути лише представники видів A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina та P. lilacinus, які ростуть достатньо повільно та характеризуються високою конкурентноздатністю. На нашу думку, вони більш відносяться до крайньої групи С-стратегів.

ВИСНОВКИ

1. Вперше отримані ростові характеристики мікроміцетів 13 видів 8 родів (63 штами), ізольованих з радіоактивних субстратів (ґрунти та лісові підстилки 10-км зони ЧАЕС, приміщення 4-го блоку). Виявлено, що тривале існування міцеліальних грибів на субстратах з підвищеною радіоактивністю слабо впливало на їх радіальний ріст, що може свідчити про консервативність цього показника.
2. На прикладі досліджених мікроскопічних грибів нами вперше застосований інтегральний показник інтенсивності освоєння субстрату (І). В результаті встановлено 2 шляхи його освоєння: перший реалізують гриби, які характеризуються уповільненим ростом та утворенням великої кількості дрібних конідій, і другий – гриби, яким притаманні висока швидкість росту міцелію та слабке конідієутворення. До видів, які реалізують перший спосіб освоєння субстрату можна віднести C. sphaerospermum та M. isabellina, а до видів, яким притаманний другий спосіб – A. alternata та U. consortiale.
3. На основі розробленого раніше експрес-методу визначення ознаки радіотропізму у грибів виявлено, що ця ознака притаманна лише видам, вилученим з радіоактивних субстратів, тобто вона належить до адаптивних реакцій та проявляється не на видовому, а на штамовому рівні. Це послужило основою для співставлення реакцій ряду штамів на іонізуюче випромінювання та слабке освітлення білим світлом (1 лк). Виявлений ефект фотостимуляції проявлявся на рівні проростання спор та утворення міцелію з галуженням 1-го порядку. Фотостимуляція, як і ознака позитивного радіотропізму, була притаманна лише ізолятам з радіоактивних субстратів та проявлялась на штамовому рівні.
4. Вперше виявлено співпадіння реакцій направленого росту до джерела іонізуючого випромінювання (позитивного радіотропізму) та фотостимуляції слабким світлом, що може знайти своє застосування для скринінгу штамів з ознакою позитивного радіотропізму – активних деструкторів важкодоступних радіоактивних субстратів.
5. Виявлено високу резистентність досліджених штамів A. alternata, C. сladosporioides та P. lilacinus до градієнту концентрацій Н2О2, який належить до найбільш стабільних продуктів радіолізу води. Резистентність штамів, виділених з радіоактивних субстратів на порядок перевищувала таку контрольних штамів. Здатність до практично повного відновлення росту після 90-хв. контакту з концентраціями Н2О2, що викликали зупинку росту, мали лише штами, виділені з радіоактивних субстратів.
6. Аналіз отриманих нами даних дозволив визначити тип життєвої стратегії ізолятів грибів, виділених з зони відчуження ЧАЕС. Переважна більшість з них (види родів Acremonium, Alternaria, Aureobasidium, Penicillium, Ulocladium та окремі штами C. сladosporioides) реалізують тип Р (патієнти) життєвої стратегії (поєднують ознаки r- та К-стратегів). Представники видів A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina та P. lilacinus були віднесені нами до С-стратегів.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

Основні результати досліджень опубліковані в 11 наукових працях, з них 6 статей у наукових фахових виданнях та 5 тез.

1. Блажеєвська Ю.В.*, Вембер В.В. Порівняльне вивчення радіальної швидкості росту мікроміцетів, виділених із забруднених радіонуклідами та чистих регіонів // Науковий вісник Ужгородського університету. – Серія “Біологія”. – №10. – Ужгород, 2001. – С. 155-158.
2. Блажеевская Ю.В.*, Вембер В.В., Жданова Н.Н. Сравнительный анализ скорости радиального роста микромицетов, выделенных из различных экотопов // Микробиол. журн. – 2002. – Т. 64, № 3. – С. 3-13.
3. Блажеевская Ю.В.*, Вембер В.В., Жданова Н.Н. Изучение некоторых ростовых и трофических особенностей грибов, способных активно расти в условиях 4-го блока ЧАЭС // Збірник наукових праць Інституту ядерних досліджень. – 2002. – Т. 8, №2. – С. 145-151.
4. Блажеєвська Ю.В.*, Редчиць Т.І. Реакції радіотропізму та фотореакції мікроміцетів, виділених із зони відчуження ЧАЕС // Збірник наукових праць Інституту ядерних досліджень. – 2003. – Т. 10, №2. – С. 85-93.
5. Блажеевская Ю.В.* Ростовые характеристики микроскопических грибов, активно растущих в условиях 4-го блока ЧАЭС // Микробиол. журн. – 2003. – Т. 65, № 3. – С. 30-34.
6. Иванова А.Е., Блажеевская Ю.В.*, Белозерская Т.А., Жданова Н.Н., Асланиди К.Б. Резистентность микроскопических грибов к окислительному стрессу // Доклады Российской Академии Наук. – 2003. – в друці.
7. Жданова Н.Н., Захарченко В.А., Редчиц Т.И., Вембер В.В., Блажеевская Ю.В.*, Краснов В.А., Пазухин Э.М. Распостранение признака позитивного радиотропизма среди грибов, изолированных из высокорадиоактивных субстратов // Вісник ОНУ. По матеріалам конференції. Серія “Біологія” (Одеса, 2001). – 2001. – 6, № 4, С. 109-112.
8. Блажеевская Ю.В.*, Вембер В.В. Изучение ростовых процессов грибов, растущих в условиях 4-го блока ЧАЭС // I съезд микологов России. Тез. Докл.: Москва, 2002 . – С. 44-45.
9. Блажеевская Ю.В.*, Жданова Н.Н. Изучение некоторых ростовых особенностей грибов, способных активно расти в условиях 4-го блока ЧАЭС // Материалы международной конференции ”Микробиология и биотехнология XXI столетия“ (Минск, 2002). – 2002. – С. 14-15.
10. Блажеевская Ю.В.*, Редчиц Т.И. Сравнительное изучение реакций радиотропизма и фотореакций грибов, выделенных из мест повышенного радоактивного загрязнения. Сборник тезисов 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2003). – 2003. – С. 266.
11. Tatiana A. Belozerskaya, Yuliya V. Blazheevskaya*, Konstantin B. Aslanidi, Anna E. Ivanova, Nelly N. Zhdanova. H2O2 resistance of microfungi isolated from regions of various radioactivity. 22nd Fungal Genetics Conference at Asilomar (Pacific Grove, California, 2003). – 2003. (http://www.fgsc.net)

* Прізвище Блажеєвська змінено на Карпенко.

АНОТАЦІЯ

Карпенко Ю.В. Екологічна характеристика мікроміцетів, що виявили ознаку позитивного радіотропізму. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена вивченню мікроскопічних грибів, що були виділені з зони відчуження ЧАЕС та проявили ознаку позитивного радіотропізму. На основі вивчення ряду ростових показників таких мікроміцетів було визначено, що навіть тривале існування на високорадіоактивних субстратах слабо впливало на їх ростові показники – радіальну швидкість росту та галуження міцелію. Вивчення узагальнюючого показника І дозволило нам за способом освоєння субстрату віднести вивчені види грибів до двох груп.   

При визначенні ознаки позитивного радіотропізму було показано, що вона відноситься до розряду адаптивних реакцій виду на забрудненість оточуючого середовища, та є не видовою, а штамовою ознакою.

Вивчення реакцій фотостимуляції мікроміцетів показало, що ріст молодого міцелію штамів, які характеризувались ознакою позитивного радіотропізму, стимулювався слабким освітленням білим світлом. Тобто, можна припустити існування взаємозв’язку між цими реакціями, який, можливо, полягає в універсальності фоторецепторних систем грибів.

При дослідженні впливу градієнту перекису водню на гіфальний ріст грибів виявилось, що найбільш резистентними до такого впливу були штами, виділені із зони відчуження ЧАЕС.

Аналізуючи отримані дані, ми прийшли до висновку, що практично всі вивчені види грибів поєднують в собі ознаки представників r- та K-стратегів та можуть бути віднесені до групи Р (патієнти). Виключення становили лише деякі штами видів A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina та P. lilacinus, які більш відносяться до крайньої групи С-стратегів.

Ключові слова: мікроміцети, зона відчуження ЧАЕС, радіальний ріст, радіотропізм, фотостимуляція.

АННОТАЦИЯ

Карпенко Ю.В. Экологическая характеристика микромицетов, проявивших признак позитивного радиотропизма. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению микроскопических грибов, которые были выделены из зоны отчуждения ЧАЭС и проявили признак позитивного радиотропизма. На основе изучения ряда ростовых показателей таких микромицетов мы сделали вывод, что даже их длительное пребывание на высокорадиоактивных субстратах слабо повлияло на их ростовые показатели – радиальную скорость роста и ветвление мицелия. Изучение обобщающего коэффициента І позволило нам, в зависимости от способа освоения субстрата, отнести изученные виды грибов к двум группам: к первой группе относились виды, которые характеризовались медленным ростом и образованием большого количества конидий, и ко второй – грибы с высокой скоростью роста и слабым конидиобразованием.

Признак позитивного радиотропизма отмечали у 17 видов 9 родов (38 штаммов) микромицетов, что составляло 18,8% от общего числа исследованных штаммов (202). Было показано, что это свойство относится к разряду адаптивных реакций вида на загрязненность окружающей среды и является не видовым, а штаммовым признаком.

Реакции фотостимуляции роста грибов изучали, используя источник освещения белого света, интенсивность которого приближалась к интенсивности светового потока (1 лк), сопровождающего γ-излучение, применяемое при определении реакций позитивного радиотропизма. Было показано, что наибольшее влияние такой свет оказывал на рост молодого мицелия (стимуляция по сравнению с контролем составляла 35-167%). Прорастание спор стимулировалось на 10-50% практически у всех штаммов, характеризующихся признаком позитивного радиотропизма, тогда как на их ветвление слабое освещение практически не влияло. Контрольные штаммы, у которых не наблюдали признака позитивного радиотропизма, не реагировали на использованное в эксперименте освещение.  

При исследовании влияния градиента перекиси водорода на гифальный рост грибов обнаружили, что штаммы, выделенные из зоны отчуждения ЧАЭС, были более резистентными к воздействию высоких концентраций H2O2 (10-2 М – 10-1 М). Это проявлялось, главным образом, в разнице концентраций H2O2, вызывающих остановку роста грибных гиф и способности к восстановлению после окончания воздействия такими концентрациями. Так, рост грибов, выделенных из радиоактивно загрязненных субстратов, останавливался при концентрации H2O2 10-2 М (вид A. аlternata – 10-1 М), а у контрольных штаммов – при 10-3 М (A. аlternata – 10-2 М).

После прекращения воздействия перекиси водорода способность к практически полному восстановлению роста через 3-7 час проявили только резистентные штаммы, выделенные из зоны отчуждения ЧАЭС.

Анализируя полученные данные, мы сделали вывод, что, по классификации Великанова и Сидоровой, практически все изученные нами виды грибов объединяют в себе признаки представителей r- та K-стратегов – большинство из них характеризуется активным и достаточно быстрым ростом, в то же время все они являются достаточно устойчивыми к экстремальным условиям существования, которые сложились в зоне отчуждения ЧАЭС. Таким образом, эти виды с большой долей вероятности можно отнести к группе Р (патиенты). Исключение составляли только представители видов A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina и P. lilacinus, которые растут достаточно медленно и характеризуются высокой конкурентоспособностью, т.е. скорее относятся к крайней группе С-стратегов.

Ключевые слова: микромицеты, зона отчуждения ЧАЭС, радиальный рост, радиотропизм, фотостимуляция.

ABSTRACT

Karpenko Yu.V. Ecological characteristic of micromycetes with positive radiotropism feature. – Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.07 – microbiology. – Institute of microbiology and virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

The work is devoted to investigation of the micromycetes with positive radiotropism feature, isolated from ChNPP alienation zone. It was defined on the base of some growth indexes of such fungi that even long-term stay on high-radioactive substrates have poor effect to their growth parameters – radial growth velocity and mycelium branching. Resumptive index I study let us divide all studied fungi into two groups in accordance with substrate settling manner.

Positive radiotropism feature is not specific but strain feature and belongs to environmental pollution adaptive response.

Study of micromycetes photostimulation reaction showed that young mycelium growth of strains with positive radiotropism feature was stimulated by weak white light. Thus, we can presume these two reactions correlation that consists in fungal photoreceptor systems universality.

During the investigation of hydrogen peroxide gradient influence on fungi hyphal growth we discovered that strains isolated from ChNPP alienation zone were most resistant to such effect.

Analyzing all obtained data we concluded that almost all investigated fungi species have features of r- and K-types of the life strategy and can be concerned to group Р (patient). Species A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina and P. lilacinus that concern to С-type of the life strategy were the exception.

Key words: micromycetes, ChNPP alienation zone, radial growth, radiotropism, photostimulation.