оскільки на жодному з цих тест-фагів не було зареєстровано таких високих результатів.
Аналіз ефективності екстрактів у дослідах з фагами l+, l+ ІІІ пас. та l-4 дозволив відмітити явну залежність сили захисного ефекту від фонового рівня інактивації. Так, у точці 1 год захисний ефект екстрактів був більш вираженим на фагах l+ та l-4, ніж на фагу l+ ІІІ пас. (рис. 3 а). Зауважимо, що дещо менший вплив екстрактів на фаг l+ ІІІ пас. у цій точці відповідає слабшій його інактивації порівняно з іншими фагами (рис. 1). Захисний ефект рослинних екстрактів на фагах l+ ІІІ пас. та l-4 підвищувався у точці 2 год порівняно з попередньою точкою (1 год), тоді як у випадку фага l+ дія екстрактів не посилювалась і навіть виявилась ще слабшою, ніж у попередній точці (рис. 3 б). В цілому, це відповідає зниженню втричі темпу інактивації фага l+ протягом другої години процесу (рис. 1).
Що торкається різниці між самими екстрактами, то порядок їх розташування за силою захисного ефекту був наступним: U.victoris > P.ginseng > P.filicifolia (рис. 4).
Не зважаючи на те, що для фагів l+, l+ ІІІ пас. та l-4 екстракт P.filicifolia був найслабшим, для фага l-4 І пас. його захисний ефект був виражений дуже сильно (рис. 2). Очевидно, це свідчить про те, що фаг l-4 І пас. можна розцінювати як найбільш чутливий тест-об'єкт, а попередню мутагенізацію тест-об'єкту – як цікавий підхід до підвищення чутливості тест-системи в цілому.
Отже, пов'язуючи чутливість фага до дії екстрактів та його інактивацію, можна припустити, що на фоні сильнішого інактивуючого ефекту захисна дія екстрактів виявляється більш вираженою. Однак, простежена відповідність не завжди носила такий чіткий характер для фагів l+ ІІІ пас. та l-4 (рис. 3).
У наступній серії експериментів вивчали вплив екстрактів на ефективність реалізації потенційних летальних ушкоджень, індукованих мутагеном у позаклітинного фага, тобто антимутагенні властивості екстрактів. Для цього екстракти вносили на етапі висіву на чашку проб фага, обробленого азотистою кислотою за умов in vitro. Вплив екстрактів реєструвався як коливання ефективності посіву інактивованого фага при вирощуванні його без та у присутності екстрактів.
Серед випробуваних тест-об'єктів (l+, l+ ІІІ пас., l-4 І пас.) найбільш виражений ефект спостерігали при використанні фага l-4 І пас. Як можна бачити із рис. 5, вирощування цього фага, інактивованого попередньо впродовж однієї години, у присутності екстрактів Rh.rosea та P.filicifolia забезпечувало зростання порівняно з контролем загального титру фага у 7,7 та 2,9 разів відповідно.
Це свідчить про те, що екстракти знижували ефективність реалізації потенційних летальних ушкоджень. Зовсім протилежний ефект виявляв екстракт Rh.rosea нат. Він не тільки не сприяв репарації ушкоджень, індукованих мутагеном, але й знижував у 4 рази виживання обробленого фага (рис. 5 б).
Захисна активність рослинних екстрактів в аналогічних експериментах з використанням як тест-об'єктів фагів l+ та l+ ІІІ пас. була значно нижчою і не завжди досягала достовірного рівня. Загалом, застосування фагів l+ та l+ ІІІ пас., порівняно з фагом l-4 І пас., було менш ефективним для вивчення антимутагенності.
Таким чином, чутливість системи E.coli – бактеріофаг l залежить від стану об'єкту тестування, а саме: делетована форма бактеріофага (l-4), а також попередньо мутагенізований бактеріофаг (вирощений на середовищі з мутагеном) сильніше піддавались мутагенному та антимутагенному впливам, ніж нативний бактеріофаг дикого типу (l+).
На найбільш чутливому тест-об'єкті – фаг l-4 І пас. – екстракти Rh.rosea та P.filicifolia виявили високу протекторну та дещо слабшу антимутагенну активності. Порівняльний аналіз активності екстрактів Rh.rosea та P.filicifolia свідчить про те, що за величиною протекторного ефекту вони рівні, тоді як антимутагенна дія більш виражена для екстракту Rh.rosea. Можливо, певні клітинні системи, зокрема репаративна, більш ефективно активуються у присутності екстракту Rh.rosea порівняно з екстрактом P.filicifolia.
На інших об'єктах тестування (фаги l+, l+ ІІІ пас., l-4) показано значні протекторні властивості екстрактів, котрі за силою захисного ефекту можна розташувати в ряд U.victoris > P.ginseng > P.filicifolia. Тут ефект екстракту U.victoris виявився найвищим, хоча і не досягав величин, зареєстрованих для екстрактів Rh.rosea та P.filicifolia при використанні фага l-4 І пас. При вивченні антимутагенності дані тест-об'єкти були мало ефективними, оскільки зареєстрована активність екстрактів була низькою.
Слід відзначити, що протекторна активність екстрактів виглядала більш вираженою порівняно з їх антимутагенною дією. Серед можливих механізмів протекторного ефекту, насамперед, слід виділити безпосередню взаємодію, можливо хімічну, мутагену з рослинним препаратом, що дезактивує мутагенні властивості. Наступним механізмом протекторного ефекту є взаємодія компонентів рослинного екстракту з білковою оболонкою фага. Поєднання цих властивостей екстрактів, очевидно, забезпечує більш ефективний захист тест-об'єкту від впливу мутагену, ніж це спостерігається при відновленні ушкодженої структури на рівні ДНК.
ВИСНОВКИ
1. Водно-спиртові екстракти біомаси культивованих клітин женьшеня справжнього Panax ginseng, полісціасу папоротелистого Polyscias filicifolia, родіоли рожевої Rhodiola rosea та унгернії Віктора Ungernia victoris не впливали на спонтанний рівень мутантів та пригнічували хімічно індукований мутагенез у тесті Еймса та системі Escherichia coli – бактеріофаг ll.
2. У тесті Еймса найсильніший антимутагенний ефект щодо ряду мутагенів прямої дії виявили екстракти Rh.rosea та P.filicifolia (65-93% пригнічення мутагенності). Дію промутагенів знижували екстракти P.ginseng та Rh.rosea (на 30-50%).
3. Показана можливість використання системи E.coli – бактеріофаг ll для вивчення впливу рослинних препаратів на рівень індукованих маркерних та летальних ушкоджень. Найбільш чутливим тест-об'єктом був варіант бактеріофага l, отриманий при попередньому вирощуванні його делетованої форми (l-4) на середовищі з мутагеном.
4. Обробка тест-фага мутагеном за умов in vitro (поза клітиною) дає змогу розмежувати протекторну та антимутагенну активності досліджуваних препаратів. Протекторна дія вивчених екстрактів була значно вищою, ніж їх антимутагенна активність. Найвищий протекторний ефект мав екстракт U.victoris, антимутагенний – екстракт Rh.rosea; екстракт натурального кореня Rh.rosea демонстрував антивірусну активність.
5. Для первинного скринінгу препаратів на антимутагенну активність у прокаріотичних системах доцільно обмежитись вивченням їх впливу на інактивацію тест-об'єкту, обробленого мутагеном за умов in vitro.
6. Антимутагенна активність екстрактів у використаних системах (тест Еймса та система E.coli – бактеріофаг ll) проявилась різною мірою як у кількісному, так і в якісному відношеннях, причому більш чіткі кількісні результати одержані при використанні системи E.coli – бактеріофаг ll.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Дворник А.С., Дуган О.М., Кунах В.А. Антимутагенна дія екстрактів із біомаси культивованих клітин деяких лікарських рослин // Доповіді НАН України. – 1999. – № 7. – С. 166-169.
2. Дуган О.М., Бариляк І.Р., Нестер Т.І., Дворник А.С., Кунах В.А. Дослідження антимутагенної активності екстрактів із біомаси культивованих клітин деяких лікарських рослин у тесті Еймса // Цитология и генетика. – 1999. – 33, № 6. – С. 19-25.
3. Дворник А.С., Перерва Т.П., Мойса Л.М., Кунах В.А. Використання системи Escherichia coli – бактеріофаг l для вивчення антимутагенної дії рослинних екстрактів // Биополимеры и клетка. – 2000. – 16, № 1. – С. 69-74.
4. Дворник А.С., Перерва Т.П., Кунах В.А. Антимутагенна дія рослинних екстрактів у тест-системі Escherichia coli - бактеріофаг l в умовах in vitro // Доповіді НАН України. – 2000. – № 7. – С. 188-190.
5. Дворник А.С. Антимутагенна активність рослинних екстрактів у системі Escherichia coli - бактеріофаг l // Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології. – 2000. – № 7. – С. 15-16.
6. Можилевская Л.П., Кунах В.А., Дворник А.С., Музыка В.И. Получение и результаты изучения культуры тканей Ungernia victoris // IV Міжнародна конференція з медичної ботаніки. Тези доп. – Вересень, Київ. – 1997. – С. 337-338.
7. Dvornyk A.S., Dugan A.M., Mozhylevs'ka L.P., Kunakh V.A. Estimation of antimutagenic activities of the extracts from the biomass of cultured cells of some medicinal plants // II International Symposium on Plant Biotechnology. Abstracts. – 4-8 October, Kyiv (Ukraine) . – 1998. – P. 35.
АНОТАЦІЇ
Дворник А.С. Дослідження антимутагенних властивостей екстрактів біомаси культивованих клітин деяких лікарських рослин. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2001.
Дисертацію присвячено вивченню антимутагенних властивостей водно-спиртових екстрактів біомаси культивованих клітин лікарських рослин – женьшеня справжнього Panax ginseng C. A. Mey., полісціасу папоротелистого Polyscias filicifolia Bailey, родіоли рожевої Rhodiola rosea L. та унгернії Віктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko. У тесті Еймса досліджені екстракти не впливали на рівень спонтанних мутантів штамів S.typhimurium ТА 98 і ТА 100 та ефективно пригнічували хімічно індукований мутагенез. Найсильніший антимутагенний ефект виявили екстракти Rh.rosea та P.filicifolia щодо мутагенів прямої дії. Дію промутагенів інгібували лише екстракти P.ginseng та Rh.rosea.
Для виявлення антимутагенних ефектів препаратів запропоновано використовувати систему Escherichia coli – бактеріофаг l. Показано, що найбільш чутливим тест-об'єктом був варіант бактеріофага l, отриманий при попередньому вирощуванні його делетованої форми (l-4) на середовищі з мутагеном. Обробка тест-фага мутагеном за умов in vitro (поза клітиною) дає змогу розмежувати протекторну та антимутагенну активності екстрактів. Протекторна дія вивчених екстрактів була значно вищою, ніж їх антимутагенна активність. Найвищий протекторний ефект мав екстракт U.victoris, антимутагенний – екстракт Rh.rosea; екстракт натурального кореня Rh.rosea демонстрував антивірусну активність.
Обгрунтовано, що для первинного скринінгу препаратів на антимутагенну активність у прокаріотичних системах доцільно обмежитись вивченням їх впливу на інактивацію тест-об'єкту, обробленого мутагеном за умов in vitro.
Ключові слова: антимутагенез, лікарські рослини, біомаса культивованих клітин, прокаріотичні тест-системи.
Дворник А.С. Исследование антимутагенных свойств экстрактов биомассы культивируемых клеток некоторых лекарственных растений. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 – генетика. – Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2001.
Диссертация посвящена изучению антимутагенных свойств экстрактов биомассы культивируемых клеток некоторых ценных лекарственных растений – женьшеня настоящего Panax ginseng C. A. Mey., полисциаса папоротниколистного Polyscias filicifolia Bailey, родиоли розовой Rhodiola rosea L. и унгернии Виктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko. Установлено, что в тесте Еймса экстракты P.ginseng, P.filicifolia, Rh.rosea и U.victoris не владеют генотоксическими свойствами и показали антимутагенное действие. Наиболее сильный эффект исследуемые экстракты показали относительно мутагенов прямого способа действия, в первую очередь экстракты Rh.rosea и P.filicifolia. Действие промутагенов ингибировали только экстракты P.ginseng и Rh.rosea.
Для изучения антимутагенных эффектов препаратов предложено использовать систему Escherichia coli – бактериофаг l. Показано, что наиболее чувтсвительным тест-объектом был вариант бактериофага l, полученный при предварительном выращивании его делетированной формы (l-4) на среде с мутагеном. Обработка фага мутагеном в условиях in vitro (вне клетки) даёт возможность разграничить протекторную и антимутагенную активности экстрактов. Протекторное действие изученных экстрактов было более существенным, чем их антимутагенная активность. Наивысший протекторный эффект был у экстракта U.victoris, антимутагенный – у экстракта Rh.rosea, экстракт натурального корня Rh.rosea демонстрировал антивирусное действие.
Обоснованно, что для первичного скрининга препаратов на антимутагенную активность в прокариотических системах целесообразно ограничиться изучением их влияния на инактивацию объекта, мутагенизированного в условиях in vitro.
Ключевые слова: антимутагенез, лекарственные растения, биомасса культивируемых клеток, прокариотические тест-системы.
Dvornyk A.S. Studies on the antimutagenic properties of the extracts from the biomass of some medicinal plants' cultured cells. – Manuscript.
Thesis for a candidate's degree by the specialty 03.00.15 – genetics. Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.
Antimutagenic properties of aqua-alcoholic extracts from the biomass of some valuable medicinal plants' cultured cells, those of Panax ginseng C. A. Mey., Polyscias filicifolia Bailey, Rhodiola rosea L. and Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko, have been studied in two prokaryotic systems. In Ames test the extracts under study failed to affect the level of spontaneous mutants of S.typhimurium TA 98 and TA 100 and effectively inhibited the chemically induced mutagenesis. Most extensive antimutagenic effect (over 90 % of mutagenicity inhibition) showed Rh.rosea and P.filicifolia extracts relative to the mutagens of direct effect. Promutagens effect was counteracted only by P.ginseng and Rh.rosea extracts (around 40 % of mutagenicity inhibition).
To reveal the antimutagenic effects of the preparations use of Escherichia coli – bacteriophage l system, in which bacteriophage would act as a test-object, was proposed. The extracts activity was evaluated by their contribution to inactivation of the test-phage to be treated by the mutagen in conditions in vitro (extracellularly). Test-phage treatment by mutagen in conditions in vitro would allow to discriminate between the protective and antimutagenic extracts activities. The protective effects of the extracts involved significantly exceeded their antimutagenic activities.
Most responsive test-object was shown to be the variant of bacteriophage l to be generated as a result of the bacteriophage deleted form (l-4) maintenance on the medium added with mutagen. In this test-object Rh.rosea and P.filicifolia extracts exhibited extensive protective and somewhat slighter antimutagenic activities, Rh.rosea natural root extract displayed antiviral effect. Other variants of phage l being used as test-objects demonstrated extracts protective activities, which by the intensity of the protective effect could be arranged in a row as follows U.victoris > P.ginseng > P.filicifolia.
It was substantiated, that to ensure the starting screening of preparations for antimutagenic activity in prokaryotic systems it is worth while to restrict oneself by estimation of their contribution to inactivation of the test-object to be exposed to mutagen in conditions in vitro.
Key words: antimutagenesis, medicinal plants, biomass of cultured cells, prokaryotic test-sysytems.
| 
