a:b, c:d- P< 0,001
Таким чином, нами встановлений позитивний ефект використання клітин гранульози у поживному середовищі на етапі дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Найкращі результати за показниками кількості клітин з неушкодженим хромосомним апаратом і дозрілих до метафази-2 мейозу отримані при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок у середовищі 199 з додаванням клітин гранульози в концентрації 1–3х106 клітин/мл.
Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза організмом в різних поживних середовищах. Дослідження з дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок в середовищах DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12 виявили різну ефективність використання цих середовищ. Але найбільш об'єктивним критерієм повноцінного дозрівання ооцитів поза організмом, безумовно, є їх запліднення in vitro. Результати експериментів наведені в таблиці 7.
Таблиця 7
Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли у різних культуральних середовищах
a:b, a:c, b:c- P< 0,001
Аналіз результатів досліджень виявив різний рівень дроблення гамет свиноматок після їх запліднення in vitro і культивування протягом 72 годин (в 1, 2, 3, 4 варіантах досліду відповідно 2,1; 22,2; 12,7; 17,2%). Звертає на себе увагу й той факт, що в варіантах досліду 2 і 4 не тільки вищий показник дроблення клітин порівняно з варіантами 1 та 3, але й вищий показник подальшого дроблення ембріонів (від 2-х клітинних), відповідно 58,3 і 42,9% проти 33,3 та 35,3%.
Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза організмом змішаною спермою від різних кнурів. Проблема підвищення запліднення in vitro яйцеклітин, що дозріли поза організмом за рахунок використання змішаних еякулятів сперми в біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин не нова. Інтерес до цієї проблеми пов'язаний не тільки завдяки підвищенню ефективності запліднення in vitro, а й в першу чергу з питанням презиготичного відбору на рівні гамет. Ряд авторів (Кузьмина Т.И. и др., 1994.; Бабушкина И.А., 1995) спостерігали підвищення ефективності запліднення in vitro яйцеклітин корів.
В наших дослідах з запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза організмом використовували свіжі еякуляти трьох кнурів (Кроссі 123/7093, Теккі 13/107, Руссо 299) та змішану сперму, виготовлену перед капацитацією злиттям рівних об'ємів. Дані експериментів наведені в таблиці 8.
Таблиця 8
Використання змішаної сперми від різних кнурів при заплідненні in vitro яйцеклітин свиноматок
a:b, b:c- P< 0,01; a:c- P< 0,001
Аналіз результатів досліджень свідчить, що при використанні змішаної сперми від різних кнурів (групи А+В+С; А+В; А+С; В+С) дроблення яйцеклітин після запліднення in vitro було вірогідно вищим (відповідно 10/32, 31,3%; 8/38, 21,1%; 11/47, 23,4%; 8/41, 19,5%) порівняно з індивідуальним (групи А, В, С) використанням сперми цих кнурів (відповідно 9/52, 17,3%; 5/57, 8,8%; 8/54, 14,8%). Привертає увагу й те, що подальший розвиток ембріонів (більше 2-х бластомерів) також був вищим (7,3-21,9%) після 72-х годинного культивування в групах А+В+С; А+В; А+С; В+С ніж у групах А, В, С (0-9,6%).
ВИСНОВКИ
1. Використання поживних середовищ DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12 як базових для приготування культуральних середовищ дозволяє в умовах in vitro у гамет свиноматок відновити і завершити їх мейотичне дозрівання та отримати після запліднення in vitro і подальшого культивування зародки свиней.
2. Культуральні середовища, виготовлені на основі поживних середовищ DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12, зумовлюють різну ефективність дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Рівень дозрівання гамет свиноматок до метафази-2 мейозу в середовищах М-199 (66,1%) і Ham-F-10 (60,3%) був вищим (P<0,05), а кількість клітин з хромосомними порушеннями (відповідно 14,3 і 12,1%) нижчою (P<0,001), ніж у середовищах DME/Ham-F-12 (56,2 і 23,3%) і DMEM (43,8 і 29,7%).
3. Культивування гамет свиноматок поза організмом в середовищі М-199, поповненому клітинами гранульози в концентрації 1-3х106 клітин/мл, забезпечує більш оптимальні умови для їх дозрівання.
4. Стадії метафази-2 мейозу через 42-45 годин культивування досягають 58,3-62,1% ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Збільшення терміну культивування не призводить до збільшення кількості дозрілих клітин.
5. Метод надрізу видимих антральних фолікулів яєчників свиноматок порівняно з методом аспірації дозволяє отримувати з яєчника більшу (P<0,001) загальну кількість ооцитів (73,1-76,4 проти 17,7-19,8) та кількість ооцит-кумулюсних комплексів придатних для культивування (33,2-36,9 проти 12,1-13,4).
6. Рівень дроблення зародків (22,2%) і їх подальшого розвитку (58,3%) після запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок вищий (P<0,001) при використанні середовища М-199 для дозрівання гамет самиць.
7. Застосування при заплідненні in vitro змішаної сперми від різних кнурів підвищує (P<0,01) дроблення клітин на 3,8-22,5%.
ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ
1. Для вдосконалення методу дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок рекомендуємо використовувати поживні середовища M-199 і Ham-F-10 як базові культуральні середовища та додавати до них клітини гранульози в концентрації 1-3х106 клітин/мл.
2. Для підвищення запліднення яйцеклітин свиноматок рекомендуємо застосовувати змішану сперму від різних кнурів на товарних фермах та в наукових установах, що займаються питаннями біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин.
3. Результати досліджень можуть бути використані при викладанні лекцій з біотехнології, генетики, морфології, біології розвитку та відтворення сільськогосподарських тварин у ВУЗах країни.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ
ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.
1. Гончарук О.П., Собко Ю.М., Гузеватий О.Є. Деякі морфологічні особливості яєчників і ооцитів свиноматок// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 1997.- Вип.2.–Ч.1.- С.146-149.
2. Гончарук О.П., Гузеватий О.Є. Використання різних поживних середовищ при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб.наук. праць.- 1997.- Вип.3.- Ч.1.- С.228-231.
3. Гузеватий О., Гончарук О., Собко Ю. Динаміка дозрівання in vitro ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок// Тваринництво України.-1998.- N 1.- С.12-13.
4. Гузеватий О.Є., Гончарук О.П. Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли в різних культуральних середовищах// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.-1999.- Вип.8.- Ч.2.- С.53-57.
5. Гузеватий О.Є., Гончарук О.П. Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок змішаною спермою від різних кнурів //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 2000.- Вип.14.- С.28-31.
6. Гончарук О.П. Временные параметры мейотического созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок// Тезисы региональной конференции молодых ученых и специалистов.- Оренбург.- 1997.- Ч.2.–С.85-86.
7. Гончарук О.П., Гузеватый О.Е. Некоторые особенности культивирования in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок// Интенсификация производства продукции животноводства в Республике Беларусь.- Жодино, 1998.- С.94.
8. Гончарук О.П. Використання клітин гранульози при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок //Молоді вчені – тваринництву.- К.: Аграрна наука, 2000.- С.95-97.
9. Гузеватый О.Е., Собко Ю.М., Гончарук О.П. Некоторые особености созревания и оплодотворения in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок //Актуальные проблемы биологии в животноводстве.- Боровск, 2000.- С.393-394.
Гончарук О.П. Вплив різних культуральних середовищ на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок з наступним їх заплідненням in vitro.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія.- Інститут тваринництва УААН, Харків, 2001.
Викладений експериментальний матеріал з використання різних поживних середовищ (DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12) для дозрівання і наступного запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок. Запропоновані підходи підвищення повноцінності мейотичного дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок з використанням клітин гранульози. В процесі мейотичного дозрівання встановлені інтервали часу проходження ооцит-кумулюсними комплексами свиноматок різних стадій мейозу. Виявлена залежність кількості і якості ооцитів свиноматок від способу отримання їх з яєчників забитих тварин.
Ключові слова: біотехнологія, яєчники, ооцит-кумулюсні комплекси, ембріони, дозрівання і запліднення in vitro.
Гончарук О.П. Влияние различных культуральных сред на мейотическое созревание ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок с последующим их оплодотворением in vitro.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 - биотехнология.- Институт животноводства УААН, Харьков, 2001.
Диссертация посвящена изучению вопросов получения, оценки, культивирования и оплодотворения in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок, использования различных базовых питательных сред и добавок на этапе созревания гамет до метафазы -2 мейоза.
Данная работа основана на том факте, что современные биотехнологии воспроизведения сельскохозяйственных животных предполагают интенсивное использование ооцитов на различных стадиях их мейотического созревания, зигот, эмбрионов различных стадий их развития. Кроме того, разработка методов созревания и оплодотворения in vitro - это прямой путь к расширению возможности использования популяций гамет самок, подавляющее большинство из которых на протяжении жизни животных подвергается атрезии.
В значительной мере успех созревания вне организма ооцит-кумулюсных комплексов сельскохозяйственных животных, в том числе и свиноматок, зависит от правильности выбора базовой питательной среды. Разные исследователи используют для культивирования гамет самок разнообразные среды, такие как Menezo, SOF, Parker, BWW, RPMI, BMOC и другие. Нашими исследованиями изучена эффективность применения питательных сред DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12 для созревания ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок до метафазы-2 мейоза и последующего их оплодотворения in vitro.
Одним из важных моментов при проведении исследований по оплодотворению in vitro яйцеклеток свиноматок есть точное знание сроков их созревания вне организма до метафазы-2 мейоза. Перезревание клеток, точно как и недозревание, существенно уменьшает их способность к оплодотворению. Выявлено, что для проведения исследований по оплодотворению in vitro яйцеклеток свиноматок необходимо их предварительное культивирование в стандартных условиях на протяжении 42-45 часов, когда подавляющее их большинство достигает стадии метафазы-2. Дальнейшее продление сроков культивирования приводит к увеличению количества клеток с дегенерацией хромосомного материала.
Модификация культуральных сред путем добавления в них различных биологических веществ и соединений позволяет значительно увеличивать получение яйцеклеток пригодных для оплодотворения. Введение в культуральную среду клеток гранулезы позволило добиться снижения нарушений хромосомного аппарата клеток при их созревании вне организма. Определена оптимальная концентрация (1-3х106 клеток/мл) применения гранулезных клеток в культуральной среде.
Установлена зависимость количества и качества ооцитов свиноматок от способа получения их из яичников убитых животных.
Наиболее объективным критерием полноценности созревания вне организма ооцит-кумулюсных комплексов является их оплодотворение. Выявлена различная частота дробления яйцеклеток свиноматок после оплодотворения in vitro, которая вызвана использованием различных культуральных сред на этапе созревания гамет до метафазы -2 мейоза. Использование при оплодотворении in vitro смеси спермы от разных хряков позволило увеличить дробление клеток на 3,8-22,5%.
Ключевые слова: биотехнология, яичники, ооцит-кумулюсные комплексы,
эмбрионы, созревание и оплодотворение in vitro.
Goncharuk O.P. Use of various culture medium for maturation and fertilization of pig oocyte-cumulus complexes.- Manuscript.
Dissertation on completion of the scientific degree of the candidate of agricultural sciences on the speciality 03.00.20 - biotechnology.- Institute of Animal Science, UAAS, Kharkiv, 2001.
Experimental material on use of various culture medium (DMEM, Ham-F-10,
M-199, DME/Ham-F-12) for maturation and subsequent fertilization in vitro of porcine oocyte-cumulus complexes has been accounted. It had been suggested on point of view increasing for maturation quality of porcine oocyte-cumulus complexes with using granulosa cells. Times intervals of cultivation to different meiotic stage has been fixed. It had been revealed on depending porcine oocytes quantity and quality from method of obtain slaughtered pigs ovaries.
Key words: biotechnology, ovaries, oocyte-cumulus complexes, embryos, maturation and fertilization in vitro.
Підписано до друку 12.11.2001 р. Формат 60х90/16.
Ум.друк.арк. 0,9. Обл.-вид.арк. 0,9
Тираж 100. Зам. 83.
Видавництво "Науковий світ"
Свідоцтво ДК № 249 від 16.11.2000 р.
03150, м.Київ - 150, вул.Горького, 51, оф. 1211.
227-01-89, 419-38-44
| 
