Рис. 3. Дозозалежна дія і специфічність ефекту тироксину на утворення 1,2-діацилгліцеролу в гепатоцитах 3-місячних щурів, n=6-10. Примітки: * – вірогідно відносно до контролю (р<0,05); гепатоцити преінкубували з [14С]олеїновою кислотою протягом 90 хвилин.
Рис. 4. Дія тироксину на процес утворення 1,2-діацилгліцерола і вміст фосфоліпідів у печінці щурів (% від контролю). Примітки: ліпіди печінки мітили [14С]ацетатом Na, концентрація L-тироксину в інкубаційному середовищі становила (10 нМ), контроль містив NaOH (100 нМ). Вік щурів 3 міс. (-·-), 24 міс. (-o-).
Нами показано, що інгібітор поліфосфоінозитид cпецифічної ФЛС - неоміцин – знижує, але не блокує ефект тироксину на утворення ДАГ (див. табл. 3). Це може свідчити про активацію гормоном інших, незалежних від гідролізу поліфосфоінозитидів шляхів генерації ДАГ. Для з'ясування питання про шляхи утворення ДАГ при короткочасній дії тироксину на клітини печінки до інкубаційного середовища вносили [3Н]триацилгліцерол або як попередники біосинтезу гліцероліпідів de novo – [14C]глюкозу або [14C]олеїнову кислоту. В цих умовах тироксин не приводив до накопичення 3Н- або 14C-діацилгліцеролів.
Відомо, що утворення ДАГ у гормон-стимульованих клітинах може відбуватися не тільки в результаті гідролізу інозитліпідів, а також при деградації фосфатидилетаноламіну або фосфатидилхоліну [Kiss, Anderson, 1994; Exton, 1997]. Нами встановлено, що процес генерації ДАГ у клітинах печінки є двофазним процесом (див. рис. 4), причому перша фаза накопичення ДАГ супроводжується короткочасним зниженням рівня фосфатидилетаноламіну, тоді як другий пік утворення ДАГ пов'язаний з падінням вмісту фосфатидилхоліну. Тироксин не викликає вірогідних змін рівня відповідних фракцій ліпідів печінки 24-місячних щурів.
Згідно з даними літератури активація ФЛД є імовірним механізмом генерації ДАГ у клітинах під впливом фізіологічних стимулів. Процес відбувається через стадію гідролізу фосфатидної кислоти під дією фосфатидатфосфатази. Інгібітор фосфатидатфосфатази – пропранолол блокує індукований тироксином процес утворення ДАГ у гепатоцитах 3-місячних щурів (див. табл. 3). Отримані результати свідчать, що джерелом ДАГ є фосфатидна кислота. Прямим доказом активації ФЛД під дією L-T4 є накопичення у клітинах фосфатидилетанолу (ФЕТ) – специфічного продукту реакції трансфосфатидилювання етанолу, яку каталізує ФЛД [Billah, Anthes, 1990]. Ця сполука метаболізується більш повільно у порівнянні з ФК, тому швидкість її утворення дозволяє оцінити інтенсивність процесу гідролізу фосфоліпідів за участю ФЛД. Тироксин стимулює накопичення фосфатидилетанолу в суспензії тканини печінки і гепатоцитах 3-місячних щурів і не впливає на рівень цієї сполуки в клітинах печінки 24-місячних щурів (див. табл. 4).
Відомо, що в механізмі активації ФЛД у різних типах клітин під впливом численних агоністів бере участь ПКС [Gustavsson et al., 1994] . Було показано [Кавок и др., 2000], що під впливом L-тироксину, але не його менш активного в метаболічному відношенні D-аналогу, в клітинах печінки 3-місячних щурів відбувається перерозподіл ПКС між цитозолем та мембранами. Нами встановлено, що зростає також загальна активність ферменту у відповідь на дію L-тироксину з 2629 ± 65 (контроль) до 10200 ± 686 пмоль/хв на 1 мг білка (дослід). Активність ферменту не змінюється під впливом D-тироксину і складає 1802±185 пмоль/хв на 1 мг білка. Отже, не виключається, що Пкс опосередкує дію тироксину на активність ФЛД. Оскільки інгібітор ПКС – сполука Н7 знижує, проте не блокує стимулюючу дію L-тироксину на утворення фосфатидилетанолу і ДАГ в гепатоцитах 3-місячних щурів (див. табл. 4), можна припустити, що активація ФЛД здійснюється не лише ПКС-залежним шляхом, але також за участі інших механізмів. Тироксин не викликає вірогідних змін рівня фосфатидилетанолу і ДАГ у гепатоцитах 24-місячних щурів як у відсутності, так і в присутності Н7 (див. табл. 4).
З огляду на важливу роль Са2+ в регуляції активності ФЛД гепатоцитів [Gustavsson, et al, 1994] , а також враховуючи Са2+-мобілізуючу дію тиреоїдних гормонів [Hummerich, Soboll, 1989; Segal et al, 1989] можна передбачити, що в клітинах печінки утворення ДАГ під впливом тироксину теж є Са2+ - залежним процесом. Для з'ясування ролі Са2+ у механізмі активації ФЛД під дією тироксину був застосований хелатор внутрішньоклітинного Са2+ - ТМВ-8. Експерименти свідчать, що ця сполука викликає пригнічення стимулюючої дії гормону на процес утворення ДАГ в гепатоцитах 3-місячних щурів (див. табл. 3). Таким чином, в механізмі регуляції цього процесу підвищення рівня внутрішньоклітинного Са2+ є необхідним етапом.
Встановлено, що падіння рівня ФХ у клітинах печінки 3-місячних щурів, яке пов'язане з активацією L-тироксином ФЛД у подальшому змінюється підвищенням вмісту цього ліпіду (контроль – 65,4±2,7, дослід 74,6±3,4% від рівня загальних фосфоліпідів, рконтроль-дослід <0,05). При цьму спостерігається зменшення кількості ДАГ: 75,1±10,3% від контролю по 5-й хвилині експерименту. Таким чином, гормон контролює не тільки процес утворення ДАГ, але й термінацію цього процесу. Оскільки відомо, що ПКС залучена до механізму регуляції синтезу ФХ [Kiss, 1999], не виключається, що активація під дією L-тироксину ресинтезу ФХ є ПКС залежним процесом.
ВИСНОВКИ
1. L-тироксин викликає швидке, накопичення ДАГ у клітинах печінки 3-місячних щурів, яке спостерігається в перші хвилини дії гормону, і не впливає на рівень цих сполук у клітинах печінки 24-місячних тварин. Ефект тироксину на утворення ДАГ є короткочасним, дозозалежним і високоспецифічним.
2. Накопичення ДАГ під дією гормону носить характер двофазного процесу і супроводжується перебудовами у вмісті окремих фосфоліпідних фракцій клітин печінки 3-місячних щурів. Перший пік накопичення ДАГ супроводжується падінням рівня ФЕА, тоді як другий – ФХ.
3. Специфічний інгібітор ФЛС – неоміцин не відміняє ефект L-тироксину на утворення ДАГ, тоді як пропранолол – інгібітор фосфатидатфосфатази – повністю блокує його, що служить доказом утворення ДАГ у процесі дефосфорилювання ФК.
4. Накопичення фосфатидилетанолу в присутності 300 мМ етанолу свідчить про активацію тироксином ФЛД за умов короткочасного впливу гормону на гепатоцити 3-місячних щурів. Тироксин не впливає на утворення цієї сполуки в гепатоцитах 24-місячних щурів.
5. Ефект L-тироксину на утворення фосфатидилетанолу у клітинах печінки знижувався під дією інгібітора ПКС – сполуки Н7, що свідчить про залучення ПКС до регуляції тироксином активності ФЛД.
6. У присутності хелатора внутрішньоклітинного кальцію – ТМВ-8 стимулюючий ефект тироксину на утворення ДАГ у гепатоцитах щурів 3-місячного віку пригнічується, що свідчить про важливу роль іонів кальцію в короткотерміновій регуляції цього процесу тироксином.
7. Зниження рівня ФХ і збільшення вмісту ДАГ у перші хвилини впливу L-тироксину супроводжується в подальшому зменшенням ДАГ на тлі підвищення кількості ФХ, що може свідчити про термінацію процесу активації ФЛД і ресинтез ФХ.
8. Короткочасний вплив тироксину на організм тварин стимулює обмін ліпідів печінки молодих і старих тварин, однак якісні характеристики та динаміка процесу у 3- та 24-місячних щурів суттєво відрізняються. Швидке накопичення фосфоліпідів у печінці 3-місячних щурів під впливом тироксину відбувається при одночасному підвищенні рівня холестеролу і триацилгліцеролу. В печінці 24-місячних щурів зростання вмісту фосфоліпідів відбувається більш повільно, на тлі падіння рівня ДАГ та жирних кислот. На відміну від двофазного підвищення рівня холестеролу в печінці 3-місячних щурів у старих тварин накопичення ліпіду не спостерігається. Серед вивчених фракцій фосфоліпідів найбільш різких змін на ранньому етапі дії тироксину на організм зазнають СФМ и ФІ печінки 3-місячних та ФХ – 24-місячних щурів.
ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Kavok N. The role of thyroid hormones in the regulation of protein kinase C activity of rat liver // School of Fundamental Medicine Journal.-1997.-Vol. 3, № 1.- P. 24-26.
2. Кавок Н.С., Красильникова О.А., Бабенко Н.А. Роль тиреоидных гормонов в регуляции обмена полифосфоинозитидов и фосфатидилхолина в печени крыс // Вісник Харківського університету.- 2000.- №456,ч 2.-С.99-101.
3. Кавок Н.С., Красильникова О.А., Сидоркина О.М., Бабенко Н.А. Быстрый эффект тироксина на процесс накопления диацилглицерина и активацию протеинкиназы С в клетках печени // Биохимия.- 2000.- Т.65, №11.- С.1577-1583.
4. Кавок Н.С.Возрастные особенности регуляции тиреоидными гормонами ацилирования фосфолипидов в печени крыс // Вісник Харківського університету.- 2001.- № 506.-С.270-272.
5. Kavok N.S. Krasilnikova O.A., Babenko N.A. Thyroxine signal transduction in liver cells involves phospholipase C and phospholipase D activation. Genomic independent action
of thyroid hormone //BMC Cell Biology.-2001. - Vol. 2. – P. 5. Available HTTP: //www.biomedcentral.com/1471-2121/2/5.
6. Бабенко Н.А., Кавок Н.С., Красильникова О.А., Гафт М.Х. Возрастные особенности влияния L- и D-тироксина на образование диацилглицеринов в печени белых крыс // Биологические механизмы старения. Симпозиум: Тез. докл. 12-14 мая 1994 г. – Харьков, 1994. – C. 14.
7. Кавок Н.С. Влияние тиреоидных гормонов на обмен сфингомиелина и фосфатидилхолина печени крыс // Біологічні механізми старіння. Міжнародний симпозіум. Тез. доп. – Харків, 1996. – C.58.
8. Кавок Н.С. Участие тиреоидных гормонов в регуляции активности фосфолипазы Д в клетках печени // Матеріали наукової конференції молодих вчених біологічного факультету та науково-дослідного інституту біології. – Харків: ХДУ, 1996. – С.24.
9. Кавок Н.С. Вікові особливості впливу тироксину в умовах in vitro на обмін ліпідів печінки білих щурів // VII Український біохімічний з?їзд. Тез. доп. 4.1 – Київ, 1997. – С.96-97.
10. Бабенко Н.А., Кавок Н.С., Красільнікова О.А., Натарова Ю.А. Особливості регуляції обміну ліпідів та функціональної активності печінки в старості // Тези доповідей XV з?їзду Українського фізіологічного товариства – Фізіологічний журнал – 1998. – Т.44, №3. – С.307.
11. Babenko N.A., Kavok N.S., Natarova U.A., Filenko V.A. Age-peculiarities of sphingolipids metabolism regulation / IV European Congress of Gerontology. Abstracts July 7-11, 1999. Berlin, Germany- Р11/223.
12. Бабенко Н.А., Кавок Н.С., Красільнікова О.А. Вікові особливості реалізації гормонального сигналу в тканинах-цілях // IV Международный симпозиум. Биологические механизмы старения. Тез.докл. – 24-27 мая 2000 г. – Харьков, 2000. – С.101.
13. Babenko N.A., Kavok N.S., Krasilnikova O.A. Age peculiarities of the thyroid hormone signal tranduction in the liver cells. // 2nd European Congress on biogerontology. From molecules to humans. Abstracts. August 25-28, 2000. Saint Petersburg, Russia-Advances in Gerontology-2000.-Vol.5.-P.33-34.
АНОТАЦІЯ
Кавок Н.С. “Вікові особливості метаболізму ліпідів печінки щурів на ранньому етапі дії тиреоїдних гормонів”. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. - Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, Харків, 2001.
Вивчали вікові особливості та механізми короткотермінової регуляції тиреоїдними гормонами метаболізму ліпідів печінки щурів. Встановлено, що тироксин протягом перших хвилин дії стимулює в клітинах печінки 3-місячних щурів процес деградації фосфоліпідів, який супроводжується швидким та короткочасним накопиченням у клітинах ліпідних вторинних месенджерів – діацилгліцеролів. Показано, що утворення цих сполук пов`язано з активацією фосфоліпази Д. Регуляція ферменту під впливом тироксину здійснюється по механізму, до якого залучені ПКС і Са2+. Отримані результати свідчать про існування взаємозв'язку між порушенням утворення ліпідних медіаторів сигнальної трансдукції і змінами у характері метаболічної відповіді клітин печінки на гормональний сигнал у старості.
Ключові слова: печінка, тироксин, діацилгіцероли, фосфоліпаза Д, протеїнкіназа С.
АННОТАЦИЯ
Кавок Н.С. "Возрастные особенности метаболизма липидов печени крыс на раннем этапе воздействия тиреоидных гормонов". – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2001 г.
В работе изучали краткосрочное действие тиреоидных гормонов на обмен липидов печени крыс разного возраста.
Установлено, что введение экзогенного тироксина в организм 3- и 24-месячных крыс вызывает быстрые изменения в содержании индивидуальных липидов печени у животных обеих возрастных групп, однако качественные характеристики ответа и динамика процесса у молодых и старых животных существенно различаются. Накопление фосфолипидов и триацилглицерола в печени 3-месячных крыс обнаруживается уже к 15-й минуте воздействия гормона на организм, тогда как повышение уровня фосфолипидов в клетках печени 24-месячных крыс выявляется после более длительного, чем у молодых животных, лаг-периода, причем метаболический ответ имеет качественно иные характеристики.
Стимулирующий эффект тироксина на метаболизм липидов печени 3-месячных крыс воспроизводится также при действии гормона в условиях in vitro. Под влиянием гормона происходит быстрое (к 15-й минуте эксперимента) накопление фосфолипидов, образованных из различных меченых предшественников, а также усиливается включение жирных кислот в триацилглицерол. В клетках печени 24-месячных крыс в данных экспериментальных условиях тироксин не вызывает достоверных изменений в содержании липидов и их отдельных фракций.
Выявлены существенные возрастные различия в регуляции метаболизма сфингомиелина и холестерола при кратковременном воздействии тироксина на организм. Быстрое повышение уровня сфингомиелина в печени 3-месячных крыс сопровождается увеличением содержания холестерола (15 минута эксперимента), тогда как накопление холестерола при более продолжительном действии гормона (60 и 120 минут) происходит на фоне значительного подъема уровня жирных кислот, которое, по-видимому, является результатом активации липолитических процессов. У старых животных подобные изменения не выявлены. Показано, что фазе накопления глицеролипидов в клетках печени молодых животных при действии тироксина в условиях in vitro предшествует этап деградации фосфолипидов с образованием липидных вторичных посредников – диацилглицеролов. Данный эффект развивается в течение первых минут воздействия гормона и является кратковременным, дозозависимым и высокоспецифичным.
Ингибитор полифосфоинозитид специфичной фосфолипазы С-неомицин снижает, однако не отменяет, действие тироксина на образование диацилглицеролов в гепатоцитах 3-месячных крыс, что доказывает вовлечение независимых от обмена полифосфоинозитидов путей генерации диацилглицерола под влиянием тироксина. Установлено, что источниками данных соединений в гормонактивированных клетках являются фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин.
Ингибитор фосфатидатфосфатазы – пропранолол блокирует стимулирующий эффект гормона на образование диацилглицеролов, это доказывает, что их накопление происходит в ходе дефосфорилирования фосфатидной кислоты. Показано, что накопление диацилглицерола в клетках печени молодых животных опосредовано активацией фосфолипазы Д. Об активации фермента судили по образованию фосфатидилэтанола в реакции трансфосфатидилирования этанола, которую катализирует фосфолипаза Д. Обнаружено, что тироксин стимулирует накопление данного соединения в гепатоцитах 3-месячных крыс и не влияет на его уровентв гепатоцитах 24-месячных крыс. Эффект гормона на образование фосфатидилэтанола в клетках печени молодых животных является дозозависимым и специфичным.
Установлено, что тироксин регулирует активность фосфолипазы Д по механизму, в который вовлечены протеинкиназа С и Са2+. Показано, что под влиянием L- , но не
D-тироксина происходит увеличение активности протеинкиназы С клеток печени. Подавление активности фермента ингибитором Н7 снижает также эффект тироксина на образование фосфатидилэтанола в гепатоцитах 3-месячных крыс. Ингибитор не влияет на уровень данного соединения в гепатоцитах 24-месячных животных как в присутствии, так и в отсутствии гормона. Хелатор внутриклеточного Са2+ соединение ТМВ-8 значительно подавляет стимулирующее действие тироксина на образование диацилглицерола. По-видимому, для полной активации фосфолипазы Д под влиянием L-тироксина необходимо синергичное взаимодействие протеинкиназа С-зависимых и Са2+-зависимых регуляторных механизмов. Нарушение в старости этапа образования диацилглицеролов при кратковременном воздействии тироксина на клетки печени может являться одной из возможных причин наблюдаемых возрастных изменений характера клеточного ответа на гормональный сигнал.
Ключевые слова: печень, тироксин, диацилглицеролы, фосфолипаза Д, протеинкиназа С.
Summary
Kavok N.S. Age specifity of thyroid hormones rapid effects on lipid metabolism in rat liver.-Manuscript.
Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – biochemistry.-V.N.Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2001.
The age specifity and the mechanism of rapid regulation by thyroid hormones of lipid metabolism in rat liver has been studied. It was found that L-thyroxine stimulation of the 3-month old rats liver cells resulted in a rapid rise in 1,2-diacylglycerol (DAG).
L-T4 activates the DAG production in a concentration-and time-dependent manner. DAG formation in a stimulated cell is biphasic: the initial phase of L-T4 generated DAG is accompanied by phosphatidylethanolamine level decrease while the second phase is accompanied by phosphatidylcholine content drop. The results obtained provide the first demonstration of phospholipase D activation by L-T4 in liver cells and implication of the enzyme in L-T4 induced DAG formation.
In liver cells of 24-month old rats, 1,2-diacylglycerol and individual phospholipids content are unaffected by hormones. The present data indicate the existence of relation between deficiency of lipid second messengers generation and age-dependent changes in formation of cellular responses.
Key words: liver, thyroxine, diacylglycerol, phospholipase D, protein kinase C.
| 
