Библиотечный каталог авторефератов Украины

Вплив коферментів на активність очищеного 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу. 2оксоглутаратдегідрогеназний комплекс був виділений за методом Роше і Кейт [Roche I.E., Cate R.J., 1977] з питомою активністю 315 нмоль / хв · мг білку із 50 статевозрілих щурів лінії Wistar. Вимірювання активності ферментного комплексу проводили за тестом Варбурга [Островский Ю.М., 1979].

Додання in vitro окремих коферментів в інкубаційне середовище до очищеного 2-ОГДК призводило до помітного збільшення активності ферменту тільки у випадку ліпоєвої кислоти (50 %), а ТПФ, НАД і особливо ФМН навіть пригнічували активність 2-ОГДК (рис. 12).

При додаванні до середовища інкубації коферментів попарно у різних сполученнях найбільш ефективними були: (КоА+ТПФ), (КоА+ЛК), (КоА+НАД) – відповідно збільшення активності ферменту відносно контролю в середньому складало: 204 %, 108 %  і 30 % (рис. 13). ФМН у сполученні з ТПФ і навіть з ЛК пригнічував активність ферменту на 52 % і 11 %, відповідно.

Суміш коферментів, які додавали у сполученні, характерному для дегідрогеназ 2-оксокислот, збільшувала активність 2-ОГДК більш ніж у 10 разів.

Отримані дані демонструють, на наш погляд, різноспрямованість дії окремих коферментів на активність очищеного комплексу і можуть свідчити, з одного боку, про часткову їх втрату в більшій чи меншій мірі по ходу виділення ферментного комплексу, з іншого боку, ТПФ, НАД, ФАД – міцно зв’язані із субодиницями ферментного комплексу, і додаткове внесення їх до комплексу призводить до дисбалансу і, як наслідок, до зниження активності 2-ОГДК.

Особливої уваги заслуговує ЛК, стимулюючий ефект якої не можна пояснити тільки з позиції втрачання коферменту при виділенні ферментного комплексу. Очевидно, через її специфічне розташування і функціонування на рівні трансацетилазного і ліпоїлдегідрогеназного компонентів у комплексі визначається найважливіша роль ЛК у особливому – коферментному типі регуляції досліджуваного мультиензимного ансамблю.

Суміш усіх коферментів, які додавали у співвідношеннях, що характерні для 2-ОГДК, характеризувалася найбільшим ефектом. Цей факт свідчить не тільки про коферментну регуляцію мультиензимного комплексу, але й демонструє можливість реасоціації субодиниць з відповідними коферментами в активний поліферментний 2-оксоглутаратдегідрогеназний комплекс.

Роль мітохондріальних мембран у реасоціації субодиниць 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу в функціональний поліферментний комплекс. Для вивчення ролі мітохондріальних мембран у процесах взаємодії субодиниць 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу з відповідними коферментами застосовували очищений препарат 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу. Поліферментеий комплекс обробляли сухим KBr до 0,5 М насичення, потім розділяли його на субодиниці фракціонуванням сульфатом амонію. Отримані субкомплекс (Е1+Е2) і компонент Е3 діалізували для видалення KBr.

Для з’ясування ролі мітохондріальних мембран у процесах самозбирання 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу і взаємодії субодиниць і коферментів визначали активність 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу в присутності “виснажених” мембран мітохондрій, отриманих з печінки щурів шляхом холодної одногодинної інкубації в K-Na-фосфатному буфері, і без них. Ферментативну активність визначали після 60-хвилинної інкубації субодиниць сумісно з коферментами і “виснаженими” мітохондріями тестом Варбурга.

При введенні в інкубаційне середовище “виснажених” мітохондрій і субкомплексів відмічено збільшення активності 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на 21 % по відношенню до варіанта, де “виснажені” мітохондрії були відсутні (рис. 14).

Рис. 14. Активність 2-ОГДК при інкубації з коферментами і мітохондріальними мембранами (нмоль НАДН /хв · мг білку)

Примітка:        1 – 2-ОГДК (до розділення) + суміш коферментів; 2 – (Е1 + Е2) + Е3 + суміш коферментів;

3 – (Е1 + Е2) + Е3 + суміш коферментів + мембрани “виснажених” мітохондрій.

Ці дані свідчать про взаємодію субодиниць 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу, відповідних коферментів на мітохондріальних мембранах і реасоциацію мультиензимного комплексу.

ВИСНОВКИ

1. Дослідження взаємодії тіаміну з сумішшю вітамінів реалізуються in vivo та in vitro на тканинному, субклітинному рівнях, а також на рівні очищеного 2­-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу. В основі цих взаємодій полягають різні міжвітамінні взаємовідносини, але особливе місце серед них належить самосборці мультиензимних комплексів з коферментів і апоферментних білків.
2. Фазність динаміки включення 35S-тіаміну у тканини дванадцятипалої кишки і печінки характерна для молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24 міс.) щурів, причому строки настання максимумів співпадають з такими у мітохондріях.
3. Відмічено суттєве збільшення вмісту мічених метаболітів тіаміну в гепатоцитах, клітинах дванадцятипалої кишки і мітохондріях з них після сумісного введення 35S-тіаміну з вітамінами у молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24 міс.) щурів.
4. Найбільшою швидкістю оновлюваності тіаміну характеризувались у порядку зменшення: мітохондрії печінки, дванадцятипала кишка, печінка як у молодих (1-1,5 міс.), так і старих (22-24 міс.) щурів.
5. Максимуми накопичення 35S-тіаміну у тканинах печінки та дванадцятипалої кишки щурів співпадають з періодами максимальної його відносної оновлюваності.
6. Збільшення швидкості окиснення 2оксоглутарату в гепатоцитах і мітохондріях печінки відмічено в обох вікових групах тварин як після введення 35S-тіаміну, так і, особливо, після його сумісного застосування з вітамінами.
7. Виражений стимулюючий ефект на окиснення 2оксоглутарату в мітохондріях печінки і на рівні очищеного фермента спричиняли ліпоєва кислота, коензим ацилювання і особливо суміш всіх коферментів у щурів усіх вікових груп.
8. Реасоціація мультиензимного 2оксоглутаратдегідрогеназного комплексу потребує присутності як усіх коферментів, що входять до його складу, так і фрагментів мітохондріальних мембран.
9. Збільшення вмісту мічених метаболітів тіаміну і активності 2оксоглутаратдегідрогеназного комплексу при його виділенні та очищенні, а також стимулюючий ефект введених вітамінів in vivo і добавлених in vitro у відповідному 2оксоглутаратдегідрогеназному співвідношенні відповідних коферментів до очищеного ферментного комплексу, вказує на існування реасоціації субодиниць у функціональний поліферментний комплекс.

СПИСОК ОПУБЛIКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦIЇ

79. Розанов А.Я., Федорко Н.Л., Петров С.А. Онтогенетические особенности накопления и обновления тиамина в органах пищеварительной системы белых крыс. // Физиологич. журн. – 1989. – Т. 35, № 1. – С. 68-71. (Федорко Н.Л. Виконала експеримент щодо визначення тіаміну та оновлення його у тканинах та мітохондріях печінки білих щурів різного віку, частковий аналіз і узагальнення отриманих результатів, підготовка статті до друку)
80. Петров С.А., Федорко Н.Л., Семерюк І.А. Вивчення зв’язування тіаміна та його метаболітів клітинами крові і мітохондріями печінки білих щурів. // Укр. біохім. журн. – 1991. – Т. 63, № 3. – С. 109-113. (Федорко Н.Л. провела експериментальну роботу по включенню тіаміну та його метаболітів в мітохондрії печінки білих щурів, частковий аналіз і узагальнення отриманих результатів, підготовка статті до друку)
81. Абдулла Саммак Ахмед, Карпов Л.М., Федорко Н.Л., Васильева Т.В. Возрастные особенности протекторного действия комплекса витаминов при аллоксановом диабете крыс. // Вістник Одеського національного університету імені І. І. Мечникова. – 2002. – Т. 7, вип. 1. – С. 207-211. (Федорко Н.Л. проведено експериментальні роботи по визначенню активності дегідрогеназ 2-оксокислот: ПДК, 2-ОГДК, частковий аналіз і узагальнення отриманих результатів, підготовка статті до друку)
82. Федорко Н.Л. Вітамінно-коферментна корекція активності піруватдегідрогеназного комплексу в органах щурів в онтогенезі. // Вісник Одеського національного університету імені І. І. Мечникова. – 2003. – Т. 8, вип. 1. – С. 28-33.
83. Федорко Н.Л., Петров С.А. Взаємодія коферментів 2-оксоглутаратдегідрогенази на рівні мультиензимного комплексу та в мітохондріях печінки. // Вісник Одеського національного університету імені І. І. Мечникова. – 2004. – Т. 9, вип. 1. – С. 47-57. (Федорко Н.Л. проведено єксперименти по виділенню загальної фракції мітохондрій печінки статевозрілих щурів та
    2-ОГДК, частковий аналіз і узагальнення отриманих результатів, підготовка статті до друку)
84. Розанов А.Я., Гандірук Н.Г., Петров С.А., Шаталова Н.Л., Запорожченко О.В., Цепколенко В.О., Кравченко Н.О. Надходження і трансформація 35S-ліпоєвої кислоти у тканини та мітохондрії травної системи в геронтогенезі при гіпоксії та наркозі // Мат. ІV Українського біохім. з’їзду. – Київ: Наукова думка, 1982. – Ч. 2. – С. 160.
85. Розанов А.Я., Федорко Н.Л. Транспорт, метаболизм и рецепция митохондриями в пищеварительной системе коферментных пируватдегидрогеназе витаминов в геронтогенезе // Мат. ІV Всесоюз. съезда геронтологов и гериатров. – Кишинев: Штиинца, 1982. – С. 33.
86. Федорко Н.Л. Субклеточное распределение α-кетоглутаратдегидрогеназы печени крысы. // Тр. Итоговой науч. конф. молодых ученых Одесского государственного университета имени И.И. Мечникова. – Одесса: Одесского государственного университета имени И.И. Мечникова, 1984. – С. 45
87. Федорко Н.Л. Взаимодействие 14С-тиамина с инъецированными функционально связанными витаминами при окислении 2-оксоглутарата митохондриями печени крыс в геронтогенезе. // Тр. XI отчетной науч. конф. профессорско-преподавательского состава Одесского государственного университета имени И.И. Мечникова. – Одесса: Одесский государственный университет имени И.И. Мечникова, 1985.– С.38.
88. Розанов А.Я., Федорко Н.Л., Кравченко Н.О., Карпов Л.М. Активність 2-оксоглутаратдегідрогенази та піруватдегідрогенази у цитозолі, рибосомах та мітохондріях печінки щурів як показник можливої міграції їх субодиниць у клітини. // Мат. V Укр. біохім. з’їзду. – Київ: Інститут біохімії АН УССР, 1987. – Ч. 2. – С. 184.
89. Rozanov A.Ya., Petrov S.A., Kravchenko N.A., Fedorko N.L. Reconstruction of α-ketoacid dehydrogenase complexes as a regulation mechanism of the cells energy metabolism.// Proc. 14-th Intern. Congress of Bioch. – Prague (Chechoslovakia), 1988. – P. 187.
90. Petrov S.A., Kravchenko N.A., Fedorko N.L. Coenzymic and noncoenzymic regulation of pyruvate metabolism by thiamine metabolites // Proc. FEBS’89. 19th meeting. – Rome (Italia), 1989. – Abstract Book. – TU. – Р. 218.
91. Кравченко Н.А., Федорко Н.Л., Хотько А.И., Петров С.А. Применение комплекса витаминов и их метаболитов для коррекции нарушений энергетики клетки при старении // Тр. Всесоюз. конф. “Продолжительность жизни: механизмы, прогнозы, пути увеличения”. – Киев: Институт геронтологии АМН СССР, 1991. – С. 66.
92. Розанов А.Я., Петров С.А., Запорожченко О.В., Кравченко Н.О., Федорко Н.Л., Елькіна В.О., Погба С., Абу Асалі І.І. Транспорт у головний мозок і біохімічні функції в нейроструктурах вітамінно-метаболітних препаратів при екстремальних умовах. // Мат. VI Укр. біохім. з’їзду. – Київ: вид. УСГА, 1992. – Ч. 1. – С. 140.
93. Карпов Л.М., Запорожченко О.В., Розанов А.Я., Тищенко Д.В., Савлучинська Л.Г., Федорко Н.Л. Вітаміни та їх похідні як потенційні геропротектори. // Пр. конф. “Геропротектори у попередженні прискореного старіння”. – Одеса: Астропрінт, 1996. – С. 2.
94. Федорко Н.Л., Карпов Л.М., Кравченко Н.О., Савлучинська Л.Г. Структурно-функціональна перебудова мітохондрій з органів білих щурів за умов їх старіння. // Пр. Симп. “Біологічні механізми старіння”. – Харків: Харківський державний університет імені В. Н. Каразіна, 1996. – С. 133.
95. Карпов Л.М., Савлучинская Л.Г., Федорко Н.Л., Сорокин А.В., Будняк А.К., Кокошкина О.А., Шландакова В.Г. Коферментзависимые ферменты и старение. // Тр. V междунар. симп. “Биологические механизмы старения”. – Харьков: Харьковский национальный университет имени В. Н. Каразина,   2002. – С. 32.
96. Прокопчук Т.Г., Федорко Н.Л. Активность ПДК и 2-ОГДК из печени крыс разного возраста. // Тр. конф. молодых ученых “Актуальные проблемы естествознания – 2003”. – Симферополь: Крымский национальный университет, 2003. – С. 73.

АНОТАЦІЯ

Федорко Н.Л. Вікові особливості вітамінної і коферментної регуляції 2оксоглутаратдегідрогеназного комплекса в печінці і дванадцятипалій кишці щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.04 – біохімія. Харківський  національний університет імені В. Н. Каразіна, Харків,  2005.

Дисертацію присвячено вивченню механізмів взаємодії суміші вітамінів при фіксації тіаміну в тканинах, його фосфатів в мітохондріях і реасоціації мультиензимного 2оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на мітохондріальних мембранах.

В результаті проведених досліджень вперше були отримані дані про онтогенетичні особливості впливу суміші вітамінів в “2-оксоглутаратдегідрогеназному співвідношенні” на динаміку розподілу тіаміну в тканинах і мітохондріях печінці та дванадцятипалої кишки. Оцінено оновлення тіаміну, що віддзеркалює особливості накопичення і утримування вітаміну в тканинах печінки і дванадцятипалої кишки щурів різного віку. Досліджено взаємодію коферментів дегідрогеназ 2-оксокислот у мітохондріях на рівні фіксації тіаміндифосфату і окиснення 2-оксоглутарату. Вперше отримано дані, які підтверджують існування реасоціації мультиензимного 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на мітохондріальних мембранах.

Ключові слова: 2-оксоглутаратдегідрогеназа, коферменти, мітохондрії, тіамін, вітаміни.

АННОТАЦИЯ

Федорко Н.Л. Возрастные особенности витаминной и коферментной регуляции 2оксоглутаратдегидрогеназного комплекса в печени и двенадцатиперстной кишке крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. Харьковский национальный университет имени В. Н. Каразина, Харьков, 2005.

Диссертация посвящена изучению механизмов взаимодействия тиамина с витаминами, коферментные формы которых входят в состав 2оксоглутаратдегидрогеназного комплекса на уровне его фиксации в тканях печени и двенадцатиперстной кишки, его фосфатов в митохондриях и реасоциации ферментного комплекса на митохондриальных мембранах.

Было показано, что включение 35S-тиамина в ткани и митохондрии печени и двенадцатиперстной кишки крыс разного возраста характеризуется двухфазной динамикой, но в большей степени это выражено у молодых крыс. В тканях двенадцатиперстной кишки меченый тиамин удерживался более продолжительно у старых крыс, вплоть до 24 часового срока исследования. Максимумы накопления 35S-тиамина в митохондриях печени и двенадцатиперстной кишки синхронны с таковыми в тканях у обеих возрастных групп крыс.

Введение меченого тиамина совместно со смесью витаминов существенно увеличивало содержание меченых метаболитов тиамина как в тканях, так и в митохондриях печени и двенадцатиперстной кишки у обеих возрастных групп животных, но в большей мере у старых крыс.  

Расчет относительной обновляемости тиамина в исследуемых тканях и митохондриях показал, что она наибольшая в митохондриях печени, затем в двенадцатиперстной кишке и печени как у молодых, так и у старых крыс, но у молодых крыс этот процесс протекал интенсивнее. Эти результаты показали, что только первые максимумы накопления тиамина в исследуемых тканях и митохондриях совпадают с периодами его относительной обновляемости у обеих возрастных групп животных, что косвенно свидетельствует о том, что первый максимум накопления может быть связан с усиленной обновляемостью тиамина.

Изучение окисления 2оксоглутарата в исследуемых тканях и митохондриях подтвердило взаимосинергичные взаимоотношения витаминов.

Исследование влияния отдельных коферментных форм витаминов и их смеси на окисление 2оксоглутарата показало, что существенній стимулирующий эффект на 2оксоглутаратдегидрогеназный комплекс in vitro оказывали КоА, ЛК и смесь коферментов, взятых в соотношении, характерном для 2оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, для обеих возрастных групп животных, однако в большей мере - у старых крыс.

Введение меченого тиамина и особенно совместно со смесью витаминов приводило к увеличению суммы меченых его метаболитов и увеличению активности 2оксоглутаратдегидрогеназного комплекса по этапам выделения ферментного ансамбля.

На очищенном ферментном препарате показано увеличение его активности после  добавления in vitro смеси коферментов с наибольшим вкладом липоевой кислоты. Показана реассоциация субъединиц 2оксоглутаратдегидрогеназного комплекса и смеси коферментов в присутствии “истощенных” митохондриальных мембран в активный ферментный ансамбль.

Полученные результаты исследований свидетельствуют не только о витаминной и коферментной регуляции мультиэнзимного комплекса, но и возможной реассоциации 2- оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из субъединиц в присутствии всех пяти необходимых коферментов на митохондриальных мембранах.

Ключевые слова: 2-оксоглутаратдегидрогеназа, коферменты, митохондрии, тиамин, витамины.

SUMMARY

Fedorko N.L. Age features of vitamin and other coenzyme regulation of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex in rat liver and duodenum. - Manuscript.

The thesis for a degree of candidate of science in biology by speciality – 03.00.04 – biochemistry. Kharkov National University by V.N. Karazin. Kharkov, 2005.

Thesis is devoted to investigation of interaction mechanisms of mixture of vitamins under fixation of thiamine in tissues and its phosphates in mitochondria and multienzyme 2-OGDH on mitochondrial membranes.

As the result of prospected investigations there was first obtained data about age features of mixture of vitamins influence on dynamics of thiamine distribution in digestive system tissues. It was evaluated thiamine renewal that reflects character of accumulation and holding of the vitamin in tissues of digestive system of different age rats. It was researched the interaction of 2-oxoacid dehydrogenases coenzymes in mitochondria on the level of thiamindiphosphate fixation and 2-oxoglutarate oxidizing. It was first obtained data that affirm the reassociation of multienzyme 2-oxoglutarate dehydrogenase complex on mitochondrial membranes.

Key words: 2-oxoglutarate dehydrogenase, coenzymes, mitochondria, thiamine, vitamins.