Рис. 4. Вплив кріоконсервування на активність акрозину (а), СДГактивність (б) і Г6ФДГ активність(в), вміст ГК (г) в сперміях донорів (1 – нативні спермії; 2 – спермії після експозиції з ГЛЖ; 3 – кріоконсервовані спермії).
При оцінці гіалуронідазної активності було виявлено достовірне зниження кількості ГК після низькотемпературного консервування (рис.4,г). Можливо, це зв'язано з наявністю мікроушкоджень акросомальної мембрани гамет, особливо зовнішньої, на внутрішній стороні якої розташована гіалуронідаза і де, очевидно, найчастіше виникають ушкодження на етапах низькотемпературного консервування. У цьому випадку можуть знижуватися протеолітичні властивості розморожених сперміїв і їхня проникаюча здатність через клітини кумулюса.
Вплив середовищ інкубації на морфокінетичні показники сперміїв. Відомо, що етап відігрівання і створення умов для відновлення після НТК функціональних властивостей біооб’єктів не менш важливий, ніж етап заморожування. У наших подальших експериментах проведено порівняльне вивчення ряду середовищ для підвищення рухливості сперміїв після кріоконсервування по розробленому нами методу (рис.5).
Рис.5.Вплив середовищ відігрівання на рухливість сперміїв людини: а – до кріоконсервування, б – після кріоконсервування.
Після відігрівання до зразків сперми додавали по 5 мл розчину Хенкса (РХ), центрифугували, відбирали супернатант і на осад нашаровували по 0,5-0,7 мл одне з середовищ інкубації:
1)РХ + 2,5 % глюкози;
2)РХ+ 2,4 мкМ цитохрому С;
3)РХ + 3,5 мМ прогестерону;
4)РХ (контроль);
5)РХ+ 15 % сироватки АВ (IV);
6) середовище Menezo B2;
7)РХ + 3,5 мМ пентоксифілину;
8)РХ + 1мМ адреналіну.
Зразки для інкубації поміщали в термостат (37°С) на 40-60 хвилин.
Найбільш високі показники рухливості чоловічих гамет були отримані в середовищах 5, 6, 7 і 8 до- і після заморожування.
При додаванні в зразки адреналіну після НТК рухливість сперміїв групи ”а”+”в” через 15-20 хвилин зростала на 10-15 % стосовно контролю (рис.5,б) у той час, як додавання пентоксифілину збільшувало рухливість через 40-50 хвилин. Цей час необхідно враховувати при підготовці матеріалу до штучної інсемінації.
ВИСНОВКИ
- У дисертації наведені теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми, що стосується поліпшення методу кріоконсервування сперми донорів шляхом розробки нескладної та ефективної технології Ії заморожування, яка не потребує спеціального обладнання.
- Визначення морфокінетичних властивостей та оцінка ферментативної активності сперміїв людини дозволили комплексно оцінити ефективність розробленого методу кріоконсервування чоловічих гамет.
- Найменшу цитотоксичність стосовно сперміїв людини серед досліджених мають середовища гліцерин-лактоза-жовток і Medi-Cult.
- Використання середовища гліцерин-лактоза-жовток в нашій модифікації дозволило в 2 рази знизити концентрацію гліцерину в кріоконсерванті і скоротити час еквілібрації з кріозахисним середовищем при кімнатній температурі.
- Кріоконсервування сперми людини під захистом середовища гліцерин-лактоза-жовток дозволяє зберегти морфофункціональні властивості гамет на рівні зразків, заморожених із фірмовим середовищем Medi-Cult.
- Активність ферментів акрозину, сукцинатдегідрогенази і глюкоза-6-фосфатдегідрогенази в кріоконсервованій спермі по розробленому нами методу кріоконсервування сперми донора зберігається на рівні активності досліджуваних ферментів у нативних зразках.
- Використання у складі середовища інкубації 1мМ адреналіну дозволяє підвищити вміст активнорухливої фракції на 15-20 % після кріоконсервування.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ
- Дунаевская А.В., Чуб Н.Н., Крамар М.И., Родионова В.Л. Активность акрозина в криоконсервированных спермиях человека // Пробл. криобиологии. – 2003. - № 1. – С. 65-70.
- Чуб Н.Н., Родионова В.Л., Крамар М.И. Оптимизация этапа отогрева криоконсервированной спермы человека // Актуальные пробл. медицины и биологии. – 2004. - № 1. – С. 89-92.
- Чуб Н.Н., Крамар М.И., Юрченко Г.Г., Родионова В.Л. Влияние вредных условий производства на сперматогенез // Экология и здоровье человека. – 2004. – Т. 1. – С. 410-412.
- Родионова В.Л., Чуб Н.Н., Щеголева Т.Ю., Тодоров П. Диэлектрическая проницаемость эякулятов человека при нормо- и патоспермии после взаимодействия с криозащитной средой // Пробл. криобиологии. – 2004. - № 3. – С. 45-47.
- Родионова В.Л., Никитченко Ю.В., Чуб Н.Н., Черепанов В.В. Сукцинатдегидрогеназная и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная активности спермы человека на этапах низкотемпературного консервирования // Пробл. криобиологии. – 2005. - № 2. – С. 207-211.
- Родионова В.Л. Искусственная инсеминация криоконсервированной спермой донора // Матер. наук.-практ. конф. “Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології”: Тези доповідей. - Харків, 2005. – С.173.
- Пат.№70803А Україна, МПК А01N1/00. Спосіб низькотемпературного консервування сперми донорів / В.І. Грищенко, Н.Н.Чуб, М.І.Крамар, В.Л. Родіонова. (ІПКіК НАН України) №20031212833; Заявлено 29.12.2003; Опубл.15.10.2004, Бюл.№10. – С. 3.15.
АНОТАЦІЇ
Родіонова В.Л. Ферментативна активність і морфокінетичні властивості сперміїв людини до і після низькотемпературного консервування. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2005.
Дисертацію присвячено вивченню впливу факторів низькотемпературного консервування на ферментативну активність і морфокінетичні властивості сперміїв людини з розробкою доступного, не потребуючого спеціального обладнання метода кріоконсервування чоловічих гамет. Отримані в роботі результати дозволяють зробити наступний висновок: після кріоконсервування за допомогою нескладної технології активність основних ферментів і морфокінетичні властивості сперміїв людини не знижуються в порівнянні з нативними зразками, що свідчить про ефективність розробленого метода.
Використання у складі середовища інкубації адреналіну у кінцевій концентрації 1мМ дозволяє підвищити вміст активнорухливої фракції на 15- 20 %.
Ключові слова: кріоконсервування, кріозахисне середовище, сперма людини, акрозин, гіалуронідаза, сукцинатдегідрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа.
Родионова В.Л. Ферментативная активность и морфокинетические свойства спермиев человека до и после криоконсервирования. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 – криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков 2005.
Диссертация посвящена изучению влияния факторов низкотемпературного консервирования на ферментативную активность и морфокинетические свойства спермиев человека при разработке доступного, не требующего специального оборудования метода криоконсервирования мужских гамет.
Показано, что наименьшей цитотоксичностью по отношению к спермиям человека среди изученных сред обладают среда глицерин-лактоза–желток и коммерческая среда Medi-Cult. Предложенная модификация способа приготовления и добавления среды глицерин-лактоза–желток позволила в 2 раза снизить концентрацию глицерина в образце и сократить время эквилибрации с криозащитной средой при комнатной температуре. Лучшие показатели подвижности сохранялись при продолжительности экспозиции спермиев в криозащитной среде, не более 30 мин.
Определено значение предельной температуры для первого этапа (охлаждение и гипотермическое хранение), охлаждение ниже которой приводит к повреждению спермиев за счет температурного шока. На основе полученных данных, нами выбрана температура 9±1°С, при которой показатели сохранности подвижной фракции спермиев были наиболее высокими. Теоретически обоснована и подтверждена экспериментально оптимальная скорость охлаждения спермы человека на втором этапе, от начала кристаллизации во внеклеточном растворе до его эвтектической области. На основании проведенной теоретической оценки охлаждение спермы в области температур от 8-90С до –700С мы осуществляли со скоростью около 800С/ мин, а затем погружали образцы непосредственно в жидкий азот.
В результате сравнительного изучения степени сохранности морфокинетических свойств спермиев, криоконсервированных по разработанному нами методу и с помощью программного замораживателя УОП-2 с аналогичными программами замораживания, достоверных различий обнаружено не было.
С помощью визуального наблюдения и компьютерного анализа установлено достоверное увеличение активно-подвижной фракции через 60 минут после размораживания. Можно предположить, что восстановление подвижности спермиев группы „а” происходит за счет увеличения подвижности спермиев группы „в”. На основании полученных результатов можно рекомендовать для практической репродуктивной медицины использовать криоконсервированную сперму не ранее, чем через 40-60 минут после размораживания.
Криоконсервирование спермы человека по разработанному методу под защитой среды глицерин-лактоза–желток позволяет сохранить морфофункциональные свойства гамет на уровне образцов, замороженных на фирменной криозащитной среде Medi-Cult. Активность ферментов акрозина, сукцинатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в образцах, криоконсервированных по разработанному нами методу криоконсервирования спермы донора, сохраняется на уровне активности исследуемых ферментов в нативных образцах.
Использование в составе среды инкубации адреналина в конечной концентрации 1мМ позволяет повысить содержание активно-подвижной фракции на 15-20 %.
Ключевые слова: криоконсервирование, криозащитная среда, сперма человека, акрозин, гиалуронидаза, сукцинатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.
Rodionova V.L. Enzymatic activity and morphokinetic properties of human sperm before and after cryopreservation. - Manuscript.
Thesis for obtaining the degree of candidate of medicine sciences on the specialty 14.01.35 – cryomedicine. – Institut for problems of cryobiology and cryomedicine of the National academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2005.
The thesis is devoted to the study of low-temperature preservation influence on enzymatic activity and morphokinetic properties of human sperm when developing a simple method of donor sperm cryopreservation that doesn't demand any special equipment. The obtained results allow us to make the following decision that enzymatic activity and morphokinetic properties of human sperm after cryopreservation with the help of the simple technology remain at the level of native samples.
It suggests the effectiveness of the developed method. Addition to a washing medium of adrenalin in the final concentration 1µM allows to increase the motile fraction by 15-20 %.
Key words: cryopreservation, cryoprotective medium, human sperm, acrosin, gialuronidase, succinatdehydrogenase, glucose-6-phosphatdehydrogenase.
Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук
Підписано до друку 12.12.2005 р. Формат 60х84 1/16
Наклад 100 прим. Умов. друк.арк. 0,9. Друк на ризографі.
ПП Степанов В.В. м. Харків, вул.. Ак. Павлова, 311
| 
