Рис.5. Синтез інтерферону лейкоцитами периферійної крові людини під впливом АЦС.
В культуральному середовищі клітин лейкоцитів периферійної крові людини було виявлено агент з противірусною активністю, температуро- та кислотостійкий, противірусна активність якого усувалась при застосуванні проти-α інтерферонового імуноглобуліну. Це дозволило віднести його до інтерферонів І типу. Противірусна активність препарату АЦС та його інтерфероногенна активність корелювали за часом, але дещо відрізнялись в залежності від дози. Найвищий титр інтерферону спостерігався у розведенні 10-3, яке сприяло підвищенню рівня репродукції ВВС у попередньому експерименті. Пік продукції інтерферону припадав на 24-ту годину, що не заперечує його ролі як певного чинника у знижені титру вірусу, однак його кількість у культуральному середовищі клітин, оброблених АЦС, була досить низька для того, щоб безпосередньо викликати пригнічення цитопатичної дії вірусу в культурі клітин. Отже, хоча отримані дані співпадають з літературними, які свідчать про здатність цитотоксичних сироваток стимулювати виділення клітинами інтерфероноподібного агента (Edelman R., Wheelock E.F., 1968), противірусна дія АЦС має бути пов’язана, в основному, із іншими факторами.
При вивченні впливу АЦС на продукцію інтерлейкінів in vitro було встановлено, що розведення від 10-3 до 10-6 значно підвищують індекс стимуляції синтезу інтерлейкіну-1 (рис.6).
Рис.6. Вплив різних доз АЦС на активність синтезу ІЛ-1 лімфоцитами.
Сироватка у більшій концентрації, навпаки, викликала пригнічення функціональної активності клітин, їх здатність до продукції цитокінів.
Як видно із таблиці 7, синтез інтерлейкіну-2 також значно підвищується під дією досліджуваного препарату і найбільш активно відбувається при застосуванні розведень 10-3, 10-4 та 10-5.
Таблиця 7
Активність синтезу ІЛ-2 моноцитами периферичної крові людини під впливом АЦС
Примітка. *Активність синтезу достовірна, (ІС>3)
При вивченні продукції інтерлейкіну 1 та фактору некрозу пухлин (ФНП) при хронічній стафілококовій інфекції, яка є одним із важливих ускладнень вірусних захворювань внаслідок пригнічення імунних реакцій, та супроводжується значними порушеннями у функціонуванні системи цитокінів, було встановлено, що введення АЦС нормалізує їх співвідношення, сприяючи переходу хронічної інфекції у гостру форму та одужанню інфікованих тварин. При розвитку інфекційного процесу підвищення рівня ІЛ-1 до максимального супроводжується мінімальними значеннями рівня ФНП. Після введення тваринам АЦС спостерігалось підвищення продукції ІЛ-1 та ФНП у першу добу після інфікування, причому їх співвідношення зміщувалось у бік ІЛ-1, прозапального цитокіна.
Активність клітин перитонеального ексудату. Загострення інфекційного процесу, викликаного введенням АЦС, супроводжувалось підвищенням активності клітин перитонеального ексудату (рис.7)
Рис. 7. Влив АЦС на цитотоксичну активність макрофагів при стафілококовій інфекції у мишей.
Активність макрофагів є важливим показником при вірусних та бактеріальних інфекціях, оскільки даний фактор сприяє елімінації збудника із інфікованого організму. Оскільки ІЛ-1 служить для макрофага праймуючим сигналом, що підсилює процес представлення антигену лімфоцитам, а ФНП виконує роль тригерного сигналу, що опосередковує підсилення бактерицидної та цитотоксичної активності фагоцитуючих клітин, було зроблено припущення, що під впливом АЦС відбувається активізація фагоцитуючої активності даних клітин, яке підтвердилось в результаті проведеного експерименту.
ВИСНОВКИ
Дослідження показали, що антиретикулярна цитотоксична сироватка у низьких (розведення 10-4 – 10-6) пригнічує репродукцію вірусу везикулярного стоматиту в культурі лейкоцитів периферичної крові людини in vitro. Однак розведення сироватки 10-3, що не виявляло явного прояву цитотоксичності в даній культурі, стимулює підвищення рівня реплікації вірусу.
Антиретикулярна цитотоксична сироватка дозозалежно впливає на репродукцію вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ-1/BRU) в культурі клітин МТ-4, сприяючи у високих розведеннях зниженню інфекційного титру вірусу та рівня синтезу вірусного білку р24.
При застосуванні антиретикулярної цитотоксичної сироватки коней проти тканин людини при герпетичному енцефаліті, викликаному інтрацеребральним введенням вірусу герпесу простого ІІ типу у мишей, спостерігається видонеспецифічна захисна дія препарату, що виявляється у 50% виживанні інфікованих тварин порівняно з контролем як при профілактичному, так і при терапевтичному застосуванні.
Досліджуваний препарат виявляє дозозалежний вплив на функціональний стан лімфоцитів людини при моделюванні стану імуносупресії in vitro.
АЦС не впливає на експресію поверхневих рецепторів лімфоцитів нормальних донорів у реакції розеткоутворення, однак сприяє їх відновленню до нормального рівня після оброблення протеолітичним ферментом.
Антиретикулярна цитотоксична сироватка дозозалежно стимулює in vitro продукцію клітинами цитокінів, зокрема інтерферону, інтерлейкінів типу 1 та 2.
Досліджена імунна сироватка у вигляді видоспецифічного препарату стимулює продукцію ФНП та ІЛ-1, нормалізуючи їх рівень, а також підвищує цитотоксичну активність макрофагів при стафілококовій інфекції, яка характеризується зниженням активності всіх досліджених в роботі факторів і має значення як супутня інфекція при багатьох вірусних захворюваннях, що підтверджує перспективність використання АЦС при вірусних захворюваннях, які характеризуються частими ускладненнями.
Таким чином, противірусна дія антиретикулярної цитотоксичної сироватки дозозалежно виявляється як на рівні організму через стимуляцію захисних механізмів, так і на клітинно-молекулярному рівні через зміни у метаболізмі клітин та активацію їх функціональної активності, а також за рахунок продукції біологічно активних речовин.
Перелік наукових праць, опублікованих за темою ДИСЕРТАЦІЇ
Співак М.Я., Карпов О.В., Антоненко С.В., Барбашева О.В, Квеленкова К.І. Пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини за допомогою антиретикулярної цитотоксичної сироватки Богомольця//Мікроб. Журнал. – 1997. – Т.59, №5. – С.57-61.
Ganova L., Kvelenkova K., Spivak N. Production of cytokines at staphylococcus infection, interferon and Bogomolets’s cytotoxic serum in corrective effect// Proc. Іnternational regional semin. “Enviroment protection:modern studies in ecology and microbiology”. – Uzhgorod, May 13-16. – 1997. – P.343-345.
Демидов С.В., Квеленкова К.І. Діденко Н.Ю. Дозозалежний вплив антиретикулярної цитотоксичної сироватки (сироватки Богомольця) на репродукцію вірусу везикулярного стоматиту in vitro//Актуальні проблеми клінічної імунології та алергології. – Щорічник. –1998. – №3. – С.72-78.
И.В. Черная, К.И. Квеленкова, С.В. Демидов, К.В. Курищук. Влияние антиретикулярной цитотоксичной сыворотки на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови человека в условиях экспериментального угнетения in vitro//Материалы конф. “Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов”, посвященной 95-летию Уфимского научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. – Часть 1. – Уфа (Республика Башкорстан), 5-7 июня. – 2000. – С. 166-170.
Demidov S., Chornaya I., Kvelenkova K. Reaction of peripheral lymphocytes, inhibited by prednisolon in vitro, on various dozes of antireticular cytotoxic serum//Abstr. Conf. Gen. Mol. Biol. for students and young scientists devoted to 100th anniversary of genetics. L’viv, April 20-22. – 2000. – С. 130.
Рибалко С.Л, Квеленкова К.І., Демидов С.В. Вивчення неспецифічної противірусної дії антиретикулярної цитотоксичної сироватки in vivo//Вісник КНУ імені Тараса Шевченка. – 2002. – Вип.38. – С.75-76.
Спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини за допомогою антиретикулярної цитотоксичної сироватки Богомольця. Пат. 29 770А (Україна), МПК А61К 31/70, А61К 31/66 Співак М.Я., Карпов О.В., Антоненко С.В., Барбашева О.В., Квеленкова К.І., Волощенко Ю.В. -№ 97062685; заявлений 6.06.97; опубл. 15.11.2000, Бюл. “Промислова власність” №6, ч.II.
АНОТАЦІЇ
Квеленкова К.І. Фактори противірусного імунітету під впливом різних доз антиретикулярної цитотоксичної сироватки. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.
Дисертація присвячена вивченню впливу антиретикулярної цитоксичної сироватки на розвиток вірусної інфекції in vivo та in vitro, та зміни клітинних факторів імунітету під дією різних доз препарату.
Показано виражену дозозалежну активність препарату антиретикулярної цитотоксичної сироватки по відношенню до впливу на розвиток вірусної інфекції як in vitro, так і in vivo, викликаної вірусами везикулярного стоматиту, імунодефіциту людини типу 1 та герпесу.
Показано стимулюючу дію препарату на клітинні фактори, які мають значення для створення захисту проти вірусної інфекції.
Показано, що вплив АЦС на розвиток вірусної інфекції відбувається за рахунок безпосереднього впливу на клітини, шляхом активації синтезу інтерферону, інтерлейкінів 1 та 2, а також нормалізації співвідношення рівня цитокінів у організмі, порушеного під впливом інфекції.
Встановлено, що низькі розведення препарату мають яскраво виражену цитотоксичну дію.
Ключові слова: вірусна інфекція, антиретикулярна цитотоксична сироватка, вірус імунодефіциту людини, вірус везикулярного стоматиту, вірус герпесу простого ІІ типу, інтерлейкін-1, інтерлейкін-2, фактор некрозу пухлин, функціональний стан лімфоцитів.
Квеленкова К.И. Факторы противовирусного иммунитета под влиянием разных доз антиретикулярной цитотоксической сыворотки. – Рукопись.
Диссертация на получение научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 – вирусология. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2003.
Диссертация посвящена изучению влияния антиретикулярной цитотоксической сыворотки на развитие вирусной инфекции in vivo и in vitro, а также изменения клеточных факторов иммунитета под действием разных доз препарата.
Противовирусную активность исследуемого препарата изучали на модели вируса везикулярного стоматита в культуре клеток лейкоцитов периферической крови человека путем оценки степени защиты от цитопатического действия вируса, на модели вируса иммунодефицита человека первого типа (штамм BRU) в культуре лимфобластоидных клеток МТ-4, по угнетению цитопатического действия вируса, а также по уровню содержания антигена р24 в культуральной среде. Влияние на вирусную инфекцию в неспецифическом организме исследовали путем введения антиретикулярной цитотоксической сыворотки до и после интрацеребрального заражения мышей вирусом герпеса простого II типа, вызывающего 100% гибели животных в эксперименте.
Влияние антиретикулярной цитотоксической сыворотки на клеточные факторы противовирусного иммунитета изучали путем исследования способности лимфоцитов человека к спонтанному розеткообразованию, восстановлению рецепторов после обработки трипсином, а также трансформации в бласт в результате действия митогенов, путем оценки уровня включения радиоактивной метки. Определение активности клеток перитонеального экссудата на основе способности клеток мононуклеарного ряда к фагоцитарной активности.
С целью оценки влияния на систему цитокинов определяли продукцию интерферона, интерлейкинов 1 и 2 в культуре клеток, а также фактора некроза опухолей в организме мышей, под действием сыворотки.
Показана выраженная способность низких доз препарата антиретикулярной цитотоксической сыворотки к угнетению репродукции вирусов везикулярного стоматита и иммунодефицита человека в исследуемых культурах клеток, однако выявлено, что сыворотка в определенных разведениях способствует размножению вируса и проявлению его цитотоксического действия. На основе проведенных исследований сделан вывод о перспективности использования препарата в комплексной терапии СПИДа.
Установлено, что антиретикулярная цитотоксическая сыворотка оказывает профилактическое и защитное действие в неспецифическом организме при инфекции, вызванной вирусом герпеса простого ІІ типа in vivo.
Показано дозозависимое действие препарата на клеточные факторы, которые имеют значение для защиты против вирусной инфекции, а именно: способность стимулировать в низких дозах и угнетать в высоких дозах функциональную активность лимфоцитов человека при создании условий, отвечающих состоянию иммуносупрессии, in vitro; способствовать восстановлению рецепторов лимфоцитов при разрушении их протеолитическим ферментом, не влияя на рецепторный аппарат клеток нормальных доноров, а также активировать фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата, угнетенную вследствие развития хронической инфекции in vivo.
Установлено, что влияние АЦС на развитие вирусной инфекции происходит обусловлено, в частности, путем непосредственного влияния на клетки, путем активации синтеза интерферона, интерлейкинов 1 и 2, а также нормализации соотношения уровня цитокинов в организме, затронутого под влиянием инфекции. Показано, что ингибирование репродукции вируса в культуре не имеет непосредственной зависимости от продукции интерферона в культуре клеток лейкоцитов периферической крови человека.
В результате проведенных исследований установлено, что противовирусное действие антиретикулярной цитотоксической сыворотки обусловлено стимуляцией защитных факторов и продукции биологически активных веществ в организме, а также непосредственным влиянием на репродукцию вируса в культуре клеток.
Ключевые слова: вирусная инфекция, антиретикулярная цитотоксическая сыворотка, вирус иммунодефицита человека, вирус везикулярного стоматита, вирус герпеса простого ІІ типа, интерлейкин-1, интерлейкин-2, фактор некроза опухолей, функциональное состояние лимфоцитов.
Kvelenkova K.I. Factors of antiviral immunity under the action of different doses of antireticular cytotoxic serum – Manuscript.
The thesis for obtaining PhD degree by speciality 03.00.06 – virology. – Taras Shevchenko' Kyiv national university, Kyiv, 2003.
The thesis is dedicated to studing of influencing of antireticular cytotoxic serum on viral infection development in vivo and in vitro, and of changing of cellular factors of antiviral immunity under different doses of investigated preparation.
The obvious ability of immune serum to inhibit the development of viral infection, caused by vesicular stomamtitis virus, human immunodeficiency virus and herpes virus II, as in vitro, so in vivo, was shown.
Was revealed that action of ACS in viral infection connected with direct influencing on cells, with inducing of interferon, interleukins 1 and 2 synthesis, and also normalising of ration of cytokines in organism, damaged by infection.
Dose-depending action of antireticular cytotoxic serum on cellular immunity factors responsible for defencing from viral infection was shown.
Key words: viral infection, antireticular cytotoxic serum, human immunodeficiency virus, vesicular stomatitis virus, herpes simplex virus II, interleukin-1, interleukin-2, tumor necrosis factor, lymphocytes functional status.
| 
