а б
Рис. 3. Динаміка рівня специфічних антитіл у сироватці крові після триразової (а) та п`ятиразової (б) імунізації мишей ліній C57BL та BALB/C кон`югатом овальбумін-тейхоєва кислота стафілокока в дозі 50 мкг.
Узагальнення одержаних результатів свідчить про те, що тейхоєвій кислоті притаманні імуногенні властивості. До її антигенної дії високу чутливість виявили миші лінії С57BL, тоді, як миші лінії ВАLB/C – є низькочутливими.
4. Створення імуноферментної тест-системи на основі тейхоєвої кислоти Staphylococcus аureus для діагностики інфекційного ендокардиту, гаймориту та отиту стафілококової етіології.
За допомогою імуноферментного аналізу вияляли специфічні антитіла у 100% обстежених пацієнтів. Визначення титрів цих антитіл у сироватках показало, що у 25,4% хворих на стафілококовий ендокардит титр специфічних антитіл до тейхоєвої кислоти становив 1:200, у 11,1% – 1:400, у 33,3% - 1:800 та у 20% - 1:1600, у 10,2% - 1:3200 (рис. 4). У контрольній групі у 16,7% обстежених цей титр становив 1:25, у решти - 1:50.
На підставі аналізу вказаних даних було визначено середні титри антитіл у сироватці хворих на стафілококовий ендокардит - 1:1240 та здорових людей - 1:38 (рис. 5), і зроблено висновок, що для діагностики ендокардиту стафілококової етіології мають значення титри від 1:200 і вище.
Рис. 4
Рис. 4 Рис. 5
Рис. 4. Результати аналізу сироваток хворих на ендокардит за допомогою
імуноферментного аналізу.
Рис. 5. Середні титри антитіл до тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus у сироватці крові здорових осіб та хворих на стафілококовий ендокардит.
Досліджували можливість застосування запропонованої тест-системи для діагностики інших захворювань стафілококової етіології, зокрема гаймориту та отиту. При аналізі сироваток хворих на гайморит і отит тільки у 60% обстежених було виявлено специфічні антитіла, та визначено їх титр (рис. 6). Встановлено, що титр специфічних антитіл у 30% обстежених становив 1:100, у 18 % - 1:200 та у 12% - 1:400. У контрольній групі у 16,7% обстежених цей титр становив 1:25, у решти - 1:50. Середній титр антитіл (рис. 7) у контрольній групі становив 1:38, тоді як в групі хворих він сягав 1:233.
Рис. 6 Рис. 7
Рис. 6. Результати аналізу сироваток хворих на гострі гнійні гайморит та отит за допомогою імуноферментного аналізу
Рис. 7. Середні титри антитіл до тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus у сироватці крові здорових осіб і хворих на гайморит та отит стафілококової етіології.
Ці дані свідчать про те, що дана тест-система може бути застосована для діагностики гаймориту та отиту стафілококової етіології лише як допоміжна в комплексі з іншими методами.
Порівняльний аналіз титрів антитіл у різних піддослідних групах дозволив визначити межу чутливості розробленої тест-системи. Титр антитіл до тейхоєвої кислоти у сироватці крові здорових людей (контрольна група) коливався від 1:25 до 1:50 (в середньому - 1:38), а у хворих – в середньому становив 1:400 і коливався в межах від 1:300 до 1:1600. Саме цей рівень ми вважаємо діагностично значимим при захворюванні на ендокардит.
Визначення рівня антитіл до тейхоєвої кислоти в сироватках крові хворих різних груп показало, що діагностично значимі титри (>1: 400) зустрічаються переважно у групі хворих на стафілококовий ендокардит (79,9%), однак виявлені і у частини (12,0%) хворих на гайморит та отит. Низькі значення титрів антитіл до тейхоєвої кислоти (<1: 400) були виявлені у 85% здорових людей та у 43,4% хворих на гайморит та отит.
5. Вплив тейхоєвої кислоти на функціональний стан щитоподібної залози мишей ліній C57BL та BALB/C.
Внаслідок введення інактивованої культури Staphylococcus aureus мишам обох ліній спостерігали виражену гіперемію кровоносних судин та зміни мікрострукрури щитоподібної залози (інфільтрати, які містили лімфоцити, нейтрофіли та інші форменні елементи крові) порівняно з контролем. Фолікули залоз мали гетерогенну структуру; в їх порожнинах зареєстрована резорбція колоїду. Встановлено, що у мишей лінії BALB/С, порівняно з тваринами контрольної групи, вірогідно зменшена висота секреторного епітелію (відповідно 2,90 та 3,97 мкм) і збільшений діаметр фолікулів (відповідно 17,90 та 14,02 мкм ).
У мишей лінії C57BL розміри фолікулів загалом виявились дуже варіабельними, хоча простежена тенденція до їх збільшення, а виведення колоїду з фолікулів було більш інтенсивним без істотного зростання секреції останнього. Висота тиреоїдних ендокриноцитів (3,80 мкм) та діаметр фолікулів (15,90 мкм) були дещо збільшені порівняно з ендокриноцитами мишей лінії BALB/С та контролем (відповідно 3,24 та 14,07 мкм).
Введення тейхоєвої кислоти суттєво змінило мікроструктуру щитоподібних залоз обох ліній мишей, що проявлялося у вираженій гіперемії судин, змінах у фолікулах, утворенні ділянок інфільтрації тиреоїдної паренхіми сегментоядерними лейкоцитами. Крім того, у мишей лінії BALB/С у фолікулах щитоподібної залози виявили оточені сполучною тканиною некротичні острівці. Висота тиреоїдних ендокриноцитів (3,01 мкм) була меншою, ніж у контролі (3,97 мкм), а діаметр фолікулів (15,70 мкм) - дещо збільшений (14,02 мкм у контролі). Таким чином, стан щитоподібної залози вказує на розвиток її функціонального виснаження. Реакція на введення тейхоєвої кислоти розвивалася аналогічно такої на аутоімунний тиреоїдит.
Після введення тейхоєвої кислоти фолікули щитоподібної залози мишей лінії C57BL збільшились в діаметрі в середньому до 18,3 мкм, що вірогідно більше, ніж у контрольних тварин, мишей лінії BALB/С і тварин, яким вводили інактивовану культуру стафілококів. Висота тиреоїдного епітелію була невелика (у середньому 2,38 мкм) та вірогідно нижча, ніж у мишей контрольних груп. Клітини фолікулярного епітелію мали еліпсоїдну форму та містили гіперхромні ядра, а ядерця не виявлялися. На відміну від цього, фолікули мишей лінії BALB/С були кулястої форми, з більш-менш вираженими ядерцями. У порожнинах фолікулів зареєстровані невеликі кількості колоїду та резорбційні вакуолі.
Таким чином, дослідження щитоподібної залози мишей двох ліній, що відрізнялися ступенем відповіді на введення тейхоєвої кислоти, дозволили виявити різноспрямовані реакції: лінії BALB/C - за типом аутоімунного тиреоїдину, лінії С57BL – гострого гнійного тиреоїдиту.
Висновки.
1. Тейхоєва кислота, виділена з клітинної стінки Staphylococcus aureus штаму Wood 46, проявляє імуногенні властивості. Динаміка гуморальної відповіді піддослідних тварин на вказану кислоту залежить від спадкових властивостей: рівень реакції мишей лінії С57BL був високий, а лінії ВАLB/C – низький.
2. Тейхоєва кислота проявляє дозозалежний модулюючий вплив на цитолітичну активність природних кілерних клітин: за низьких і середніх концентрацій вона чинить стимулюючий вплив, а за високих - пригнічуючий.
3. Встановлено дозозалежну дію тейхоєвої кислоти на функціональну активність макрофагів без прямої токсичної дії на клітини. Показано, що найбільший ефект справляла доза 0,5 мкг/мл.
4. Ступінь та характер відповіді щитоподібної залози мишей на введення тейхоєвої кислоти залежить від спадкових особливостей: у тварин лінії BALB/C реакція на введення тейхоєвої кислоти відбувалася за типом аутоімунного тиреоїдиту, у лінії С57BL - гострого гнійного тиреоїдиту.
5. У сироватках крові хворих на ендокардит, гайморит та отит стафілококової етіології були виявлені різні рівні антитіл до тейхоєвої кислоти. Середній титр цих антитіл у сироватках крові хворих на ендокардит становив 1:1240, на гайморит та отит – 1:233.
6. Розроблена на основі імуноферментного аналізу оригінальна діагностична тест–система виявилась ефективною для визначення специфічних антитіл до тейхоєвої кислоти у сироватках крові хворих на інфекційний ендокардит.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Позур В.К., Сенчило Н.В., Пасічник І.П. Тейхоєві кислоти бактерій та їхні біологічні властивості // Биополимеры и клетка. – 2000. – Т. 16, № 4. – С. 260-269. (Особисто дисертантом здійснені підбір та аналіз даних літератури).
2. Позур В.К., Сенчило Н.В. Вплив тейхоєвих кислот на метаболічну активність макрофагів in vitro за показниками НСТ-тесту // Вісн. Київ. ун-ту ім. Тараса Шевченка. сер. Біологія. – 2002. – Вип. 37. – С. 147-149. (Особисто дисертантом сформульована загальна ідея, здійснені підбір та аналіз даних літератури).
3. Сенчило Н.В., Романюк С.І., Колибо Д.В., Позур В.К. Гуморальна імунна відповідь на тейхоєву кислоту стафілокока у мишей ліній C57BL та BALB/C // Доп. Нац. акад. наук України. – 2002. – № 3. – С. 171-174. (Особисто дисертантом сформульована загальна ідея, здійснені підбір та аналіз даних літератури, проведені експериментальні дослідження з одержання тейхоєвої кислоти, розробки ТІФА, дослідження рівнів антитіл до ТК, серологічні дослідження сироваток, статистична обробка та аналіз отриманих даних, сформульовані висновки).
4. Позур В.К., Данілова О.В., Сенчило Н.В. Вплив тейхоєвої кислоти золотавого стафілокока на секреторну активність щитоподібної залози мишей // Вісн. Київ. ун-ту ім. Тараса Шевченка. сер. Біологія. – 2002. – Вип. 38. – С. 68 – 71. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їхні статистична обробка, аналіз та узагальнення, сформульовані висновки роботи).
5. Сенчило Н.В., Олішевський С.В., Позур В.К. Вплив тейхоєвої кислоти стафілокока на цитолітичну активність природних кілерних клітин // Биополимеры и клетка. – 2003. – Т.19, № 3. – С. 238-241. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їхні статистична обробка, аналіз та узагальнення, сформульовані висновки роботи).
6. Позур В.К., Сенчило Н.В. Тейхоєві кислоти бактерій та їхні біологічні властивості. В кн.: // Структура і біологічна активність бактер. біополімерів (під ред. Позура В.К.). – К.: ВПЦ Київ. ун-тет, 2003. – С. 51- 82. (Особисто дисертантом здійснені підбір та аналіз даних літератури).
7. Олішевський С.В., Сенчило Н.В. Позур В.К. Модулюючий вплив тейхоєвої кислоти стафілокока на цитолітичну активність природних кілерних клітин // Тези 2-ї Всеукр. конф. студ. та аспір. „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні (23-25 квітня, Київ).” – 2002. – Вип.1. – С. 36-37. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їхні статистична обробка, аналіз та узагальнення, сформульовані висновки роботи).
8. Senchylo N.V., Pozur V.K. The dynamic of the humoral immunity on the staphylococcus Teichoic acid in the mouse lines C57BL and BALB/C // Conf. for students, PhD students and young scientists on molecul. biol. and genetics (20-22, 2001, Kyiv, Ukraine). – Abstracts book. – 2001. – P.61.(The general idea formulacion as well as selection and analisis of the relevant references were performed personally by the dissertant).
9. Сенчило Н.В., Олішевський С.В., Позур В.К. Модифікаційний вплив тейхоєвої кислоти з клітинної стінки Staphylococcus aureus Wood 46 на протипухлинну активність природних кілерних клітин // Мат-ли 8-го Укр. біохім. з`зду ( 1-3 жовтня 2002 р., м. Чернівці, Україна). – Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 4б (додаток 2). – С. 168. (Особисто дисертантом проведений аналіз результатів експериментів, сформульовані висновки роботи).
АНОТАЦІЯ
Сенчило Н.В. Тейхоєва кислота стафілокока та її імунобіологічна активність. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю – 03.00.09 – імунологія. – Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, Київ 2004.
У дисертаційній роботі представлено результати вивчення тейхоєвої кислоти клітинної стінки Staphylococcus aureus штаму Wood 46 та її імунобіологічної активності.
Показано, що тейхоєва кислота здатна викликати явище “метаболічного вибуху” в перитонеальних макрофагах мишей. Встановлено, що ця кислота за низьких і середніх концентрацій стимулює, а за високих – інгібує цитолітичну активність природних кілерних клітин, тобто чинить дозозалежний модулюючий вплив.
Отримано нові дані по вивченню динаміки гуморальної імунної відповіді на тейхоєву кислоту стафілокока у мишей різних генетичних ліній. Встановлено, що миші лінії BALB/C мають низький, а лінії С57BL – високий ступінь специфічної імунної реакції. Це сприяє розширенню уявлень про імуногенність тейхоєвої кислоти, свідчить про можливість її використання для удосконалення серологічної діагностики стафілококових захворювань.
Досліджено вплив тейхоєвої кислоти на щитоподібну залозу мишей. Отримані дані можуть бути використані при розробці технологій лікування багатьох захворювань, викликаних грампозитивними бактеріями, а також для встановлення етіології ряду аутоімунних захворювань щитоподібної залози.
Розроблено та апробовано ефективну діагностичну тест-систему на основі імуноферментного аналізу для визначення специфічних антитіл до тейхоєвої кислоти в сироватках хворих на інфекційний ендокардит стафілококової етіології.
Ключові слова: тейхоєва кислота, антигенні властивості, імунобіологічна активність, стафілококова інфекція, природні кілерні клітини.
АННОТАЦИЯ
Сенчило Н.В. Тейхоевая кислота стафилококка и ее иммунобиологическая активность. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности – 03.00.09 – иммунология. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2004.
Инфекционные заболевания человека и животных стафилококковой этиологии принадлежат к наиболее распространенным и опасным [Bone, 1999]. Заболевания, вызванные Staphylococcus аureus, сопровождаются высокой летальностью и характеризуются разнообразными проявлениями в виде сепсисов, пневмоний, гнойных заболеваний кожи, пищевых отравлений. Качество лечения этих заболеваний в значительной степени зависит от своевременной диагностики. К сожалению предлагаемые ранее методы диагностики стафилококкового сепсиса недостаточно надежны вследствие относительно низкой чувствительности и специфичности. Поэтому разработка методов ранней и надежной диагностики стафилококковой инфекции сегодня очень актуальна.
Диссертация посвящена изучению особенностей иммунного ответа на тейхоєвую кислоту Staphylococcus аureus, выяснению роли наследственного фактора в ее формировании, а также определению диагностических возможностей разработанной тест-системы.
Установлено, что тейхоєвая кислота, выделенная с клеточной стенки Staphylococcus aureus штама Wood 46, проявляет иммуногенные свойства.
Показано, что тейхоевая кислота способна вызывать эффект “метаболического взрыва” в перитонеальных макрофагах мышей. Установлено, что эта кислота при низких и средних концентрациях стимулирует, а при высоких – угнетает цитолитическую активность естественных киллерных клеток, то есть оказывает дозозависимое модулирующее влияние.
Получены новые данные по изучению динамики гуморальной имунной реакции на тейхоєвую кислоту стафилококка у мышей разных генетических линий. Установлено, что мыши линии BALB/C имеют низкую, а линии С57BL – высокую степень специфической иммунной реакции. Это расширяет уровень знаний об иммуногенности тейхоєвой кислоты, свидетельствует о возможности ее использования для усовершенствования серологической диагностики стафилококковых заболеваний.
Исследовано влияние тейхоєвой кислоты на щитовидную железу мышей. Полученные данные могут быть использованы при разработке технологий лечения многих заболеваний, вызванных грамположительными бактериями, а также для определения этиологии ряда аутоиммунных заболеваний щитовидной железы.
В сыворотках крови больных на эндокардит, гайморит и отит стафилококковой этиологии были определены разные уровни антител к тейхоєвой кислоте. Средний титр этих антител в сыворотках крови больных на эндокардит был равен 1:1240, на гайморит и отит – 1:233.
Разработана и апробирована эффективная диагностическая тест-система на основе иммуноферментного анализа для определения специфических антител к тейхоевой кислоте в сыворотках больных на инфекционный эндокардит стафилококковой этиологии.
Ключевые слова: тейхоевая кислота, антигенные свойства, иммунобиологическая активность, стафилококковая инфекция, естественные киллерные клетки.
ABSTRACT
N.V. Senchylo. Staphylococci teichoic acid and its immunobiological activity. – Manuscript.
Thesis for obtaining a degree of candidate of biological sciences. Speciality: 03.00.09 – immunology. Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, 2004.
The thesis presents the results of an investigation of the cell wall teichoic acid of Staphylococcus aureus of the strain Wood 46 and its immunobiological activity.
The teichoic acid is shown to be capable of provoking "metabolic explosion" in the peritoneal macrophages of mice. The acid is found to stimulate under low and medium concentrations, and inhibit under high concentrations, the cytolytic activity of the natural killer cells, i. e. produces a dose-dependant modulating effect.
New data on the dynamics of humoral immune response to staphylococci teichoic acid in mice of various genotypes have been obtained. It has been demonstrated that the rate of specific immune response of mice of the line BALB/C is low, whereas those of mice of the line С57BL is high. This fact helps expand our knowledge of the immunogenity of teichoic acid and determine possibilities of its application for the purpose of improving of serological diagnostics of staphylococcus-caused diseases.
The influence of teichoic acid on the thyroid gland of mice has been revealed. The data obtained can be useful in developing technologies of treatment of different infective diseases caused by gram-positive bacteria, as well as in tracing the ethiologies of a set of autoimmune diseases of the thyroid gland.
An effective diagnostic test-system based on ELISA has been developed and tested. The system allows defining specific antibodies to teichoic acid in the serum of patients suffering from infective endocarditis caused by staphylococci.
Key words: teichoic acid, antigenic properties, immunobiological activity, staphylococcus infection, natural killer cells.
| 
