Результати обліку показали, що для характерних β-есцину піків відносні стандартні відхилення результатів знаходяться в інтервалі 3,4–11,6 %. Для суми піків 5,6,7,8 ця величина становить 2,85 %, тоді як для інших піків ці показники коливаються в інтервалі 20,2 – 626 %.
Розробка методів аналізу препарів на основі амінокислот
Препарати на основі амінокислот, для яких нами були розроблені методи аналізу, можна розділити на 3 групи:
- Препарати, діючими речовинами яких є нові біологічно активні сполуки.
- Препарати, діючими речовинами яких є індивідуальні амінокислоти і їх суміші.
- Препарати, діючими речовинами яких є суміші амінокислот з іншими біологічно активними сполуками.
Аналіз препаратів, які відносяться до першої групи, проводився з використанням методів ТШХ, ВЕРХ, УФ-спектроскопії.
Розроблений метод ТШХ дозволив проконтролювати із однієї хроматограми такі показники якості препаратів на основі байкаліну, як “Ідентичність” і “Сторонні домішки“. Хроматографування проводилось на пластинках Силуфол УФ-366 із використанням хроматографічної системи спирт н-бутиловий - кислота оцтова - вода (2:1:1). Достовірність одержаних результатів була підтверджена методом ВЕРХ на колонці, заповненій сорбентом С18, з рухомою фазою метанол - оцтова кислота - вода і зміною складу метанолу від 50 до 70 % об. Як показали наступні дослідження, розроблена методика ВЕРХ може використовуватись і для контролю препаратів за показником “Кількісний склад”. Підтвердженням цьому є співвідношення результатів, одержаних під час використання метода ВЕРХ і метода УФ-спектроскопії, які свідчать про рівнозначність обох методів.
Аналіз препаратів, умовно віднесених до другої групи, проводився з використанням метода ВЕРХ. Однією з основних проблем при розділенні амінокислот цим методом є велика різниця в їх полярності і низькі коефіцієнти поглинання в УФ-області спектру. Тому на практиці їх обробляють модифіційними реагентами. Це дозволяє отримувати гідрофобні похідні амінокислот, які, по-перше, значно легше розділити методом зворотньо-фазової хроматографії і, по-друге, отримати сполуки, які мають більш вищій коефіцієнт екстинкції, що дозволяє проводити аналіз у більш довгохвильових областях спектру.
Кінетика реакції утворення 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот
Порівняння різних модифікаторів амінокислот показало, що для серійного аналізу амінокислотних препаратів найбільш вдало використовувати 2,4-дінітро-1-фторбензол. Однак одним із основних недоліків цього реагенту є тривалість проходження реакції дериватизації. Одержання ДНФ-похідних амінокислот займало 14 год.
Тому для оптимізації одержання ДНФ-похідних амінокислот нами були проведені дослідження з кінетики утворення похідних амінокислот. Дослідження проводились на основі L-триптофану.
Схема реакції утворення ДНФ-похідної триптофану представлена на рис.3.
Рис.3. Схема реакції утворення 2,4-дінітрофенілтриптофану.
При дослідженні кінетики реакції дериватизації, прове- деної при кімнатній температурі, були одержані результати, співставлені з приведеними в літературі. Для збільшення швидкості реакції її проводили при температурі 40 0С. Це сприяло досягненню скорочення часу реакції до 20 хвилин. Кінетичні криві представлені на рис. 4.
Рис. 4. Кінетика реакції утворення 2,4-дінітрофенілтриптофану.
На основі проведеного експерименту була запропонована загальна методика отримання 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот.
Ця методика була використана при розробці НТД на препарати “Октамін плюс”, який містить 8 амінокислот і “Поліамін – У”, який містить 13 амінокислот.
Метрологічні характеристики, які характеризують запропоновану методику, були роз-глянуті на прикладі найменш подільної пари амінокислот ізолейцину і лейцину (табл. 4).
Таблиця 4.
Метрологічні характеристики, розраховані для амінокислот ізолейцину та лейцину
Хроматограма, одержана при розділенні 13 амінокислот препарату “Поліамін–У”, представлена на рис. 5.
Рис. 5. Хроматограма ДНФ-похідних амінокислот препарату “Поліамін-У”:
1-метіонин, 2-гістидин, 3-гліцин, 4-пролін, 5-2,4-дінітрофенол,
6-аланін,7-аргінін, 8-треонін, 9-лізин, 10-валін, 11-ізолейцин,
12-лейцин, 13-фенілаланін, 14-триптофан.
При порівнянні часу утримання 2,4-ДНФ-похідних амінокислот, представлених у табл. 5, було помічено, що час утримання похідних амінокислот зростає із збільшенням ланцюжка амінокислот.
Таблиця 5.
Час утримання ДНФ-похідних амінокислот
Треба зазначити, що з ряду дещо випадають лізин і метіонин, можливо це пов`язано з наявністю в їх ланцюжку додаткового атому азоту (лізин) і сірки (метіонин).
Дещо іншу картину представляють багатокомпонентні амінокислотні препарати, які умовно відносяться до третьої групи препаратів і, як вже говорилось, є сумішшю амінокислот і іншіх активних речовин. Якщо контроль активних речовин у препараті Таблетки Аспалінат вдалося провести з використанням методів УФ-спектроскопії (L-лізину байкалінат, по байкаліну), неводного титрування (калій аспарагінат, іони калію) і комплексометричного титрування (магній аспарагінат, іони магнію), то контроль активних речовин препаратів Байкамін і Факовіт без використання методу ВЕРХ неможливий.
Визначення складу препарату Факовіт, один різновид таблеток якого містить гліцин, глутамінову кислоту і піридоксин, а другий – цистеїн і аскорбінову кислоту, проводили при довжині хвилі 210 нм на рідинному хроматографі Міліхром. Вибір довжини хвилі 210 нм обгрунтовано тим, що амінокислоти мають значне поглинання в інтервалі 200-220 нм і це дає можливість отримувати необхідні результати без використання дериватизаційного реагента, реакція якого з іншими компонентами препаратів маловивчена і тому важкоконтрольована.
Активні речовини, які входять до складу препарату, завдяки своїм фізико-хімічним властивостям, мають достатньо різний час утримання. Це дозволило провести розділення цих речовин в ізократичному режимі з використанням колонки, заповненої сорбентом С8 (рис. 6 і 7).
Рис.6. Хроматограма препарату Факовіт, таблетки №1:
1-кислота глутамінова, 2-гліцин, 3-піридоксин г/х.
Рис.7. Хроматограма препарату Факовіт, таблетки №2:
1-аскорбінова кислота, 2-цистеїн
Розділення активних речовин препарату “Байкамін” у ізократичному режимі проводилось на рідинному хроматографі фірми Waters, на заповненій сорбентом С18 колонці, при довжині хвилі 210 нм. Результати хроматографування представлені у вигляді хроматограми на рис.8.
Рис.8. Хроматограма препарату Таблетки Байкамін.
1–гістидин, 2–аргінін, 3–L-лізину байкалінат.
ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ
- Вивчені фізико-хімічні властивості і встановлена будова та склад нових сполук у ряду похідних амінокислот, які мають широкий спектр біологічної дії:
- 4-α,ε-дiамiнокапронової кислоти-5,6,7-триоксифлавон-7-0-β -0–глюкуронiдат (L-лізину байкалінат);
- 4-α-амiно-β-iмiдазолiлпропiонової кислоти-5,6,7-триокси- флавон - 7 - 0 - β - 0 – глюкуронiдат (L-гістидину байкалінат);
- 4 - α, ε - дiамiнокапронової кислоти - 28 - (3 - ацетокси - 2 - метилбутират) - есцигенiн, - 4 - 0 - β - 0 - глюкопiронозин)– глюкуронiдат (L-лізину есцинат);
- Суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів.
- Вперше, з використанням методу ВЕРХ, вивчений якiсний i кiлькiсний склад флавонових глюкуронiдiв надземноi частини шоломниці байкальської та їх хроматографiчна поведiнка. Показано, що основними сполуками суміші є скутелярін–7-О-β-D-глюкуронід (25,8%), апігенін–7-О-β-D-глюкуронід (17,2%) і хрізин–7-О-β-D-глюкуронід (36,9%). Встановлено, що iз збiльшенням ступеня гiдроксилювання флавонових глюкуронiдiв, час утримання речовин зменшується, причому при рiвнiй кiлькостi гiдрокси-груп менший час утримання мають тi флавоновi глюкуронiди, у яких гідрокси- група знаходиться у В - колi флавону.
- Показано, що тритерпеновий глікозид есцин є комплексом із 14 сполук, які представляють собою поліоксітритерпенові глікозиди, етеріфіковані різноманітними карбонови- ми кислотами, до того ж так званому “β-есцину” належать 4 піка. Встановлено, що місткість “β-есцину” в різних серіях субстанції залишається практично постійною і становить 77,39%, тоді як місткість інших компонентів коливається в широких межах.
- Вивчена кiнетика реакцiї утворення 2,4-дiнiтрофенiлпохiдних амiнокислот. З метою оптимізації реакції одержання ДНФ-похідних запропоновано проводити її при температурі 400С, що дозволило скоротити час реакції в 40 раз. Вивчена також хроматографiчна поведiнка тринадцяти 2,4–дінiтро-фенiлпохiдних амiнокислот та показано, що час утримання їх зростає із збільшенням вуглеводневого ланцюжка.
- Вибрано оптимальні умови хроматографічного розділення та розроблені хроматографічні методики (методи ТШХ і ВЕРХ) контролю якості нових біологічно активних сполук.
- Розроблена методика кiлькiсного визначення 2,4-дінiтрофенiлпохiдних амiнокислот, яка придатна для аналізу лікарських препаратів, що представляють собою суміші індивідуальних амінокислот. Розроблені також методики контролю якості препаратів, що представляють собою суміш амінокислот з лікарськими препаратами різних класів ор- ганічних сполук.
- Проведена обробка метрологiчних характеристик запропонованих методик кiлькiсного визначення діючих речовин у препаратах.
- Всі розробленi методики аналiзу запроваджені в нормативно-технічну документацію на лікарські препарати:
ТФС 42У-115/37-252-96. L-лізину байкалінат; проект ТФС 42У-... . L-гістидину байкалінат; ТФС 42У-11/37-160-95. L-лізину есцинат; проект ТФС 42У-... . Розчин L-лізину байкалінату 20 % для ін`єкцій; проект ТФС 42У-... . Таблетки “Гістинат”, вкриті оболонкою; ТФС 42У-11/37-1085-99. Розчин L-лізину есцинату 0,1 % для ін`єкцій; проект ТФС 42У-... . Таблетки “Сперм-Амін”; проект ТФС 42У-... . Капсули “Октамін плюс”; проект ТФС 42У-... . Поліамін–У; ТФС 42У-15/37-253-96. Таблетки “Аспалінат”, вкриті оболонкою; проект ТФС 42У-... . Таблетки “Байкамін-КМП”, вкриті оболонкою; проект ТФС 42У-... . Таблетки “Фа-ковіт”.
Основний зміст дисертації викладено в публікаціях:
- Применение метода ВЭЖХ для определения аминокислотного состава препарата Октамин плюс / Шовковый А.В, Зинченко А.А., Шеин А.Т., Ковалев И.П. // ФАРМАКОМ. – 1998. - № 6. – С. 54-57.
- К выбору методов определения нового биологически активного соединения – L-лизина байкалината – в субстанции и некоторых лекарственных формах / Шовковый А.В., Черныш Л.Я., Шеин А.Т., Ковалев И.П. // ФАРМАКОМ. – 1999. - № 2.- С. 32-35.
- Использование метода ВЭЖХ для анализа флавоновых глюкуронидов в надземной части шлемника байкальского / Шовковый А.В., Шеин А.Т., Попова Т.П. и др. // Провизор. – 1999. - № 10. – С. 36-38.
- Шовковый А.В., Шеин А.Т. Исследование состава биологически активного природного вещества эсцин. // Провизор. – 1999. - № 12. – С. 42-43.
- Шовковий А.В., Лапкіна Ю.І.,Ковальов І.П. Кількісне визначення L-лізину есцинату у субстанції та ін`єкційній лікарській формі // Фармацевтичний журнал. – 1999. - № 4. – С. 74-77.
- Анализ препаратов на основе аминокислот и флавоноидов /Лапкина Ю.И., Черныш Л.Я., Абрамова М.М., Шеин А.Т., Шостенко Ю.В., Ковалев И.П., Шовковый А.В. // Научные достижения и проблемы производства лекарственных средств: Тез. докл. респ. научно-практич. конф. Харьков, 1995. - С.262-264.
- Високоефективна рідинна хроматографія амінокислот / Шовковий А.В., Зінченко О.А., Шеін А.Т., Ковальов І.П. // Всеукр. конф. з аналітичної хімії: Тез.доп. – Ужгород, 1998. -С.64.
- Шовковый А.В. Применение метода ВЭЖХ в анализе комбинированного препарата “Таблетки Байкамин” // Фармация ХХI века: инновации и традиции: Тез. докл. научно-практич. конф. – С.-Петербург, 1999. - С. 115.
Анотація
Шовковий А.В. Розробка методів аналізу нових біологічно активних сполук у ряду похідних амінокислот для стандартизації лікарських засобів на їх основі. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.03 – стандартиза- ція та організація виробництва лікарських засобів.– Державний науковий центр лікарських засобів, Харків, 1999.
Проведені дослідження будови нових біологічно активних сполук: L-лізину байкалі-нату, L-гістидину байкалінату, L-лізину есцинату, суміші L-лізинових солей флавонових глю-куронідів надземної частини шоломниці байкальської, які являють собою водорозчинні солі.
Вивчено якісний та кількісний склад фракції флавонових глюкуронідів надземної час-тини шоломниці байкальської і їх хроматографічну поведінку. Дослідження есцину методом ВЕРХ показали, що вміст β-есцину, основного компоненту природньої речовини есцин, залишається практично постійним, тоді як вміст інших компонентів значно змінюється.
Вивчена кінетика реакції і запропонована методика отримання 2,4-динітрофенілпохід-них амінокислот, яка використана для аналізу амінокислотних препаратів. Методика вико-ристана при розробці НТД. Вивчена хроматографічна поведінка похідних амінокислот.
Розроблено ряд методик, які дозволяють проводити контроль основних показників якості як у препаратах, одержаних на основі нових субстанцій, так і в препаратах на основі індивідуальних амінокислот і їх сумішей з іншими діючими речовинами.
Розроблені методики аналізу препаратів увійшли в 12 НТД.
Ключові слова: стандартизація, контроль, якість, біологічно активні сполуки, будова, амінокислоти, ВЕРХ, лікарські засоби, шоломниця байкальська, склад.
Аннотация
Шовковый А.В. Разработка методов анализа новых биологически активных соединений в ряду производных аминокислот для стандартизации лекарственных средств на их основе. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.03 – стандартизация и организация производства лекарственных средств. Государственный научный центр лекарственных средств, Харьков, 1999.
Проведены исследования строения новых биологически активных соединений: 4-α,ε-диаминокапроновой кислоты-5,6,7-триоксифлавон-7-0-β-0–глюкуронидат (L-лизина байка-лината), 4-α-амино-β-имидазолилпропионовой кислоты-5,6,7-триоксифлавон-7-0-β-0–глюку-ронидат (L-гистидина байкалината), 4-α,ε-диаминокапроновой кислоты-28-(3-ацетокси-2- метилбутират)-эсцигенин,-4-0-β-0-глюкопиронозин)–глюкуронидат (L-лизина эсцината), смеси L-лизиновых солей флавоновых глюкуронидов надземной части шлемника байкальского.
Установлено, что полученные соединения представляют собой водорастворимые соли. В исследованиях использовались методы ИК-, УФ-, ПМР-спектроскопии и ВЭЖХ.
Впервые, с использованием метода ВЭЖХ, изучен качественный и количественный состав флавоновых глюкуронидов надземной части шлемника байкальского и их хроматографическое поведение. Показано, что в состав смеси входят восемь флавоновых глюкуронидов, пять из которых: лютеолин-7-О-β-D-глюкуронид, скутеллярин-7-О-β-D-глюкуронид, апигенин-7-О-β-D-глюкуронид, байкалеин-7-О-β-D-глюкуронид, хризин-7-О-β-D-глюкуронид удалось идентифицировать. По результатам изучения количественного состава смеси установ- лено, что основными ее компонентами являются скутеллярин-7-О-β-D-глюкуронид (25,8%), апигенин-7-О-β-D-глюкуронид (17,2%) и хризин-7-О-β-D-глюкуронид (36,9%).
Установлено, что с увеличением степени гидроксилирования флавоновых глюкуро-нидов, время их удерживания уменьшается, причем при равных количествах гидрокси-групп меньшим временем удерживания обладают те флавоновые глюкурониды, у которых гидрок-си-группы находятся в В-кольце флавона.
Показано, что тритерпеновый гликозид эсцин является комплексом 14 соединений, представляющих собой полиокситритерпеновые гликозиды, этерифицированные различны-ми карбоновыми кислотами, причем так называемому “β-эсцину” принадлежат 4 пика. Ана-лиз эсцина показал, что состав β-эсцина от серии к серии изменяется в пределах от 76,35 % до 79,29 % и в среднем составляет 77,39 %. Более глубокая оценка состава вещества эсцин проведена на основе расчета величин относительного стандартного отклонения результатов эксперимента. Результаты расчета показали, что для характерных β-эсцину пиков относительное стандартное отклонение результатов находится в интервале 3,4 % – 11,6 % (отно-сительное стандартное отклонение суммы четырех пиков 2,85 %), тогда как для других пиков эти показатели колеблются в интервале 20,2 % – 626 %. Приведенные данные свидетельствуют о том, что содержание основного вещества эсцина – β-эсцина от серии к серии изменяется незначительно, тогда как содержание других компонентов смеси колеблется в широких пределах.
Проведенный литературный анализ модификаторов аминокислот показал, что наиболее приемлемым реактивом для контроля препаратов на основе аминокислот является 2,4-динитро-1-фторбензол, который использовался для введения метки в α-аминогруппы аминокислот. Основным недостатком этого реагента являлась продолжительность полу-чения 2,4-динитрофенилпроизводных аминокислот. Поэтому нами была изучена кинетика реакции образования 2,4-динитрофенилпроизводных аминокислот. С целью оптимизации реакции получения ДНФ-производных, предложено проводить ее при температуре 40 0С, что позволило сократить время реакции в 40 раз. Предложена методика получения 2,4-динитро-фенилпроизводных аминокислот.
С использованием предложенной методики были проанализированы два препарата, содержащие восемь и тринадцать аминокислот.
Изучено хроматографическое поведение тринадцати 2,4-динитрофенилпроизводных аминокислот и показано, что время их удерживания возрастает с увеличением цепи аминокислот.
Выбраны оптимальные условия хроматографического разделения и разработаны хроматографические методики (методы ТСХ и ВЭЖХ) контроля кочества новых биологически активных соединений. Разработанная методика, основанная на методе тонкослойной хроматографии, позволила контролировать такие показатели качества лекарственных веществ, как “Подлинность” и “Посторонние примеси” из одной хроматограммы. Правильность полученных результатов подтверждена методом ВЭЖХ.
Разработана методика количественного определения 2,4-динитрофенилпроизводных аминокислот, пригодная для анализа лекарственных препаратов, представляющих собой смеси индивидуальных аминокислот. Разработаны методики контроля качества препаратов, представляющих собой смеси аминокислот с лекарственными препаратами различных классов органических соединений.
Проведен расчет метрологических характеристик разработанных методик количественного определения действующих веществ в различных препаратах.
Разработанные методики анализа включены в нормативно-техническую документацию на 12 препаратов.
Ключевые слова: стандартизация, контроль, качество, биологически активные соединения, строение, аминокислоты, ВЭЖХ, лекарственные средства, шлемник байкальский, состав.
Resume
Shоvkoviy A.V. Development of methods of the analysis of new biologically active connections in a number of derivatives amino acids for standartization of medicinal tools on their basis.
Thesis for Candidate of pharmaceutical science degree in speciality 15.00.03 - Standardisation and Organisation of Drug Production. – State Scientific Drug Center, Kharkov, 1999.
Researches of a structure of new biologically active connections are spent: L-lisini baicalinas, L-histidini baicalinas, L- lisini aescinas, mixture L-lisinis of salts flavone glucuronides the undegraunt of a part Scutellariae baicalensis, representing water-soluble of salt. In researches such physico-chemical methods, as IR-, UV-, NMR-spectrometry and HPLC were used.
Qualitative and quantitative structure of flavone glucuronides the undegraund of a part Scutellariae baicalensis and them chromatography behaviour is investigated. Researches aescinum by a method HPLC have shown, that the content of main substance of this connection - aescinum, remains practically to the constants, whereas the content of other substances of the subserver much varies.
The kinetics of response is investigated and technique of obtaining 2,4-dinitrophenyl derivatives of amino acids is offered which can be used for the analysis amino acids of preparations. A technique approvement on 2-th preparations. Chromatography behaviour of derivatives amino acids is investigated.
Number of techniques, allowing to carry out a control of main metrics of quality of preparations as in preparations obtained on the basis of new subservers, and in preparations on the basis of individual amino acids and their mixtures with other operating substances, is developed.
The developed techniques of the analysis have come in 12 STD.
Key words: standartization, control, quality, biologically active connections, structure, amino acids, HPLC, medicinal means, Scutetellariae baicalensis, structure.
Формат 60 × 84 1/16. Бумага офсетная. Офсетная печать. Усл. печ.л. 1,9
Тираж 100 экз. Заказ № 6930
ООО фирма “Стас” 310002 г. Харьков, ул. Дарвина,8
тел.: 19-44-55
|
