Таблиця 4
Динаміка збереження інфекційності вірусів Коксакі В-3
та Коксакі В-6 при ліофілізації в різних умовах
Примітки: I – вірусовмісний матеріал не звільнений від клітинного детриту; II – вірусовмісний матеріал звільнений від клітинного детриту. Цифри в таблиці означають титр вірусів в -lg10.
Таблиця 5
Вплив бентоніту на тривалість збереження інфекційності ліофілізованих вірусів Коксакі В-3
Примітки: зразок 1 – віруси не сорбовані на бентоніті, зразок 2 – віруси сорбовані на бентоніті. Титр виражений у -log10.
Таким чином, проведені нами дослідження, спрямовані на з’ясування властивостей вірусів Коксакі В та їх бентонітових варіантів, дозволили встановити, що віруси після репродукції і виходу з клітини здатні зберігати зв’язок з клітинними компонентами, які підвищують їх стійкість до різних фізичних, хімічних та біологічних впливів і, тим самим, сприяють збереженню інфекційності у період позаклітинного існування. Ця закономірність для простих вірусів має безумовно важливе значення, і, не виключено, що у порівнянні з складними вірусами, які включають компоненти мембран клітини до складу суперкапсидної оболонки, ентеровіруси в процесі своєї еволюції сформували більш спрощену свою організацію, але не втратили здатності до асоціації з мембранними компонентами і, таким чином, забезпечили собі більш виражену стійкість до зовнішніх впливів.
ВИСНОВКИ
В дисертаційній роботі розв’язано актуальну наукову задачу – встановлено, що на поверхні вірусів Коксакі В, після їх репродукції залишаються клітинні компоненти ліпідної природи, які підвищують стійкість віріонів до фізичних, хімічних та біологічних впливів і тим самим сприяють збереженню їх інфекційності під час позаклітинного існування. Вдосконалена методика електронно-мікроскопічного дослідження вірусів та розроблений спосіб ліофілізації з метою довготривалого збереження вірусів Коксакі В.
1. Електронно-мікроскопічними методами встановлено, що на поверхні капсиду вірусів Коксакі В знаходяться надкапсидні компоненти, представлені ліпідвмісними залишками мембран хазяйських клітин. Виявлені компоненти не входять до структури капсиду, їх зв’язок з білковою оболонкою може бути перерваний при центрифугуванні.
Показано, що надкапсидні компоненти контрастуються 1% осмієвою кислотою, а віріони звільняються від них після обробки органічними розчинниками, що підтверджує їх ліпідну природу. Здатність до асоціації з залишками клітинних мембран характерна лише для ентеровірусів з високим афінітетом до бентоніту (варіант Абент+).
2. Доведено, що клітинні компоненти на поверхні вірусів Коксакі В підвищують їх стійкість до різних фізичних, хімічних та біологічних впливів. Це підтверджується тим, що віруси значно довше не втрачають інфекційності при зберіганні в різних температурних режимах та після ліофілізації, зменшується ефективність їх нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками. Після обробки органічними розчинниками, навпаки, зменшується термін збереження їх інфекційності та підвищується ефективність нейтралізації антитілами (на 36-79%), що свідчить про захисний характер поверхневих надкапсидних структур.
3. Вдосконалено методику електронно-мікроскопічного дослідження поверхневих структур вірусів Коксакі В. Досліджено ефективність використання різних типів контрастерів та їх комбінацій. Розроблено спосіб підготовки зразків для електронної мікроскопії з використанням формварових плівок-підложок, оброблених бентонітом, що дозволило вивчати морфологію вірусів в неконцентрованому стані, безпосередньо після завершення їх репродукції.
4. Встановлено, що бентонітові дисоціанти (Абент+ та Абент-) вірусів Коксакі В-6 відрізняються за здатністю до агрегації. Показано, що варіант Абент- агрегує лише при кислих значеннях рН, на відміну від варіанту Абент+, у якого дані властивості виражені при кислих, нейтральних та слаболужних рН. Виражена здатність до агрегації у варіанта Абент+ можливо пов’язана з його властивістю приєднувати клітинні компоненти.
5. Вдосконалено методику сублімаційного висушування вірусів Коксакі В шляхом їх попередньої сорбції на бентоніті. Показано, що після ліофілізації в не звільненому від клітинних компонентів стані, варіант Абент+ вірусів Коксакі В-3 та Коксакі В-6 є більш стійким до сублімації вологи та до інших агресивних факторів, які супроводжують процес ліофілізації і значно довший час зберігає свою інфекційність. Запропоновано спосіб ліофільного висушування, який може бути використаний для більш тривалого збереження музейних штамів ентеровірусів.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
У періодичних виданнях, затверджених ВАК України:
1. Бобир В.В. Сучасні уявлення про хімічний склад та фізико-хімічні властивості ентеровірусів // Актуальні проблеми медицини та біології. – Київ, 2003. Т.1. - С. 283-292.
2. Бобир В.В. Вплив органічних розчинників на ефективність нейтралізації вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів // Збірник наукових праць співробітників КМАПО імені П.Л. Шупика. Київ, 2005.
- С. 301-305.
3. Бобир В.В., Олексієнко І.П. Сучасні підходи до стабілізації ентеровірусів шляхом ліофільного висушування // Актуальні проблеми медицини та біології. Київ, 2005. Т.1. - С. 381-390. (Здобувач виконав експериментальну роботу – провів дослідження виживання ентеровірусів після ліофілізації та провів статистичну обробку одержаних результатів).
4. Широбоков В.П., Бобир В.В. Ліофілізація ентеровірусів та їх бентонітових варіантів // Журн. АМН України. – 2005. Т.11. - №2.
- С. 377-381. (Здобувач удосконалив методику ліофільного висушування ентеровірусів, отримав електронно-мікроскопічні знімки препаратів, підготував матеріали для публікації ).
Патенти:
1. Пат. 9405 Україна, МКИ В01J37/32. Спосіб ліофілізації ентеровірусів: Пат. 9405 Україна, МКИ 01N33/569. Широбоков В.П., Бобир В.В. (Україна); Національний медичний університет імені О.О. Богомольця. - №03222; Заявл. 07.04.2005. Опубл. 15.09.2005. Бюл. №9. (Здобувач здійснив патентно-інформаційний пошук відносно даної проблеми, удосконалив методику ліофільного висушування ентеровірусів шляхом їх попередньої сорбції на бентоніті, провів експериментальне випробування цього методу з використанням вірусів Коксакі В-3 в якості модельних).
2. Пат. 9903 Україна, МКИ G 01N33/569. Спосіб підвищення сорбційної здатності плівок-підкладок в електронній мікроскопії ентеровірусів: Пат. 9903 Україна, МКИ G 01N33/569. Бобир В.В., Широбоков В.П., Войцеховський В.Г., Олексієнко І.П. (Україна); Національний медичний університет імені. О.О. Богомольця. - №03751; Заявл. 20.04.05; Опубл. 17.10.2005. Бюл. №10. (Здобувач провів аналіз патентно-інформаційний пошук, виконав експериментальну частину досліджень та приймав участь у підготовці матеріалів для публікації).
Інші видання:
1. Бобир В.В., Широбоков В.П. Поверхневі структури вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів // Науковий вісник Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. - 2005. - №1-2.
- С. 9-12. (Здобувач виконав частину експериментальних досліджень, провів аналіз одержаних результатів, підготував матеріали для публікації).
2. Широбоков В.П., Бобир В.В. Нові уявлення про морфологічні особливості вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів // Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями в гуманній та ветеринарній медицині: матеріали міжнародної наукової конференції, присвяченої 160-літтю з дня народження лауреата Нобелівської премії
І.І. Мечнікова (27-29 листопада 2005 р.). - Харків.: Інститут мікробіології і імунології імені І.І. Мечнікова. Електронна адреса: www. hniimi.da.ru. (Здобувач провів аналіз даних сучасної наукової літератури відносно даного питання, виконав експериментальну частину роботи, що включала вірусологічні та електронно-мікроскопічні методи дослідження і підготував матеріали для доповіді).
3. Бобир В.В., Широбоков В.П. Гетерогенність популяції вірусів Коксакі В з позиції їх асоціації із компонентами клітинних мембран // Наука і освіта 2005: матеріали VII міжнародної науково-практичної конференції (17-21 лютого 2005 р.). – Дніпропетровськ: 2005, Т.10.
- С. 11-13. (Здобувач провів аналіз даних сучасної наукової літератури щодо даного питання, виконав частину експериментальних досліджень, підготував матеріали для публікації).
4. Бобир В.В. Ефективність ліофільного висушування вірусів Коксакі В та їх генетичних селекціонованих варіантів // Актуальні проблеми сучасної медицини: матеріали 59 міжнародної науково-практичної конференції студентів та молодих вчених (6-8 квітня 2005 р.). – Київ: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, 2005. - С. 58.
АНОТАЦІЯ
Бобир В.В. Поверхневі компоненти вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. – Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2006.
Дисертація присвячена дослідженню формування поверхневих компонентів у вірусів Коксакі В за рахунок клітинних структур та з’ясуванню їх впливу на біологічні властивості віріонів.
Електронно-мікроскопічними методами встановлено, що на поверхні вірусів Коксакі В після репродукції залишаються клітинні компоненти, які підвищують стійкість віріонів до фізичних, хімічних та біологічних впливів і тим самим сприяють збереженню їх інфекційності під час позаклітинного існування. Доведено, що здатність до асоціації з рештками клітин характеризує лише ентеровіруси з високим афінітетом до бентоніту (варіант Абент+). Експериментально показано здатність надкапсидних компонентів контрастуватися 1% осмієвою кислотою, крім того, віріони звільняються від них після обробки органічними розчинниками, що свідчить про їх ліпідну природу.
Вперше показано диференціацію дисоціантів вірусів Коксакі В за здатністю до агрегації та встановлено залежність даних властивостей вірусів від рН середовища. Вдосконалено методику сублімаційного висушування вірусів Коксакі В шляхом їх попередньої сорбції на бентоніті.
Ключові слова: віруси Коксакі В, дисоціація, поверхневі компоненти, електронна мікроскопія, нейтралізація, агрегація, ліофілізація.
АННОТАЦИЯ
Бобыр В.В. Поверхностные компоненты вирусов Коксаки В и их селекционированных вариантов. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.06 – вирусология. – Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, Киев, 2006.
В диссертационной работе представлены результаты экспериментальных исследований структурно-морфологических особенностей вирусов Коксаки В и их бентонитовых вариантов.
Электронно-микроскопическими методами установлено, что на поверхности вирусов Коксаки В после репродукции остаются клеточные компоненты. Показано, что способность к ассоциации вирионов с остатками клеток характерна только для вирусов Коксаки В с высоким аффинитетом к бентониту (вариант Абент+).
Выявленные дополнительные компоненты не входят в состав вирусного капсида, энтеровирусы способны освобождаться от данных поверхностных структур после концентрирования, селекции на бентонитовые варианты и других процессов, связанных с механическим воздействием. Показано, что надкапсидные компоненты вирусов контрастируются 1% осмиевой кислотой и исчезают после обработки вирусов органическими растворителями, что свидетельствует об их липидной природе.
Установлено, что остатки клеток на поверхности вирусов Коксаки В повышают их устойчивость к физическим, химическим и биологическим воздействиям. Это подтверждается тем, что вирусы значительно дольше сохраняют инфекционность при хранении в разных температурных режимах и после лиофилизации. Кроме того, зафиксировано повышение эффективности нейтрализации вирусов типоспецифическими диагностическими сыворотками после обработки эфиром: у вирусов Коксаки В-3 – на 36,5%, Коксаки В-4 – на 75%, Коксаки В-5 – на 73%, Коксаки В-6 – на 79%. Незначительно повышается эффективность нейтрализации у вирусов Коксаки В-1 и не отмечается у вирусов Коксаки В-2.
Усовершенствована методика электронной микроскопии энтеровирусов. Научно обоснованы оптимальные способы электронно-микроскопического исследования и контрастирования поверхностных компонентов вирусов Коксаки В: обработка фосфорно-вольфрамовой или осмиевой кислотой, использование нативных, неконцентрированных препаратов. С целью выявления энтеровирусов в вируссодержащем материале с низким титром, разработан способ подготовки образцов для электронной микроскопии с использованием пленок-подложек из формвара, обработанных бентонитом, что создает возможность изучать морфологию вирусов в неконцентрированном состоянии, непосредственно после их репродукции.
На примере вирусов Коксаки В-6 установлено, что бентонитовые диссоцианты (Абент+ и Абент-) отличаются способностью к агрегации. Показано, что вариант Абент- агрегирует только при кислых рН, в отличие от варианта Абент+, у которого эти свойства проявляются при кислых, нейтральных и слабощелочных значениях рН. Высказано предположение, что выраженная способность к агрегации у варианта Абент+ связана с его способностью к ассоциации с клеточными компонентами.
Установлены различия в резистентности у диссоциантов вирусов Коксаки В после лиофилизации: более устойчивым оказался бентонитовый вариант Абент+. Обосновано эффективность использования лиофилизации энтеровирусов путем их предварительной сорбции на бентоните. Показано, что данный способ может быть использован для сохранения музейных штаммов энтеровирусов.
Ключевые слова: вирусы Коксаки В, диссоциация, поверхностные компоненты, электронная микроскопия, агрегация, нейтрализация, лиофилизация.
ANNOTATION
Bobir V.V. The superficial components of Coxsackie B viruses and their selection variants – A manuscript.
Dissertation for the candidate of medical sciences in specialty 03.00.06. – Virology. – O.O. Bogomolets National Medical University, Kyiv, 2006.
This scientific thesis is devoted to the investigation of the superficial components of Coxsackie B viruses’ formation by means of the cell structures and to their influence on virions’ biological properties determination.
The electric microscopic methods have demonstrated the cell components to remain on the Coxsackie B viruses’ surface after the reproduction. These cell components increase the virions’ resistance to physical, chemical and biological effects and in such a way contribute to their infectiosity maintenance. It has been proved that the ability to associate with the cells debris is typical only for enteroviruses with high aphinity to bentonite (Abent+ variant). The experiments have demonstrated the ability of percapsid components to be contrasted by 1% osmic acid, besides, the virions are released from them after the treatment by organic solvents; the latter confirms their lipid nature.
For the first time there has been demonstrated the differentiation of Coxsackie B viruses’ disassociants by their aggregation ability and there has been found out the dependence of the viruses abovementioned properties on the pH medium. The methods of Coxsackie B viruses’ freeze drying by means of their preliminary sorption on bentonite has been improved as well.
Key words: Coxsackie B viruses, disassociation, superficial components, electronic microscopy, neutralization, aggregation, freeze drying.
| 
