Рис.7. Зміни параметрів азолектинової модельної мембрани при дії трипептиду меланостатину (МІФ)(субфаза – 0,154 М NaCl).
Таким чином, для даного пептиду роль ліпідного матриксу мембрани, очевидно, полягає в основному в концентруванні пептиду на поверхні клітини з набуттям ним певної конформації, що полегшує подальшу взаємодію з специфічними рецепторами, причому пептид-мембранна взаємодія модулюється іонною силою субфази.
Взаємодія трипептиду тироліберину (ТРГ) з модельними мембранами. ТРГ є одним з основних рилізинг-факторів гіпоталамуса, виявляє різнобічний вплив на організм – має психотропну, антидепресивну активність, впливає на процеси пам’яті, справляє позитивний вплив на перебіг алкогольного абстинентного синдрому [Булаев, 1987; Громов, 1992], може функціонувати як антагонист опіоїдної активності, знижувати рівень Са2+ в крові і гальмувати секрецію панкреатичних ферментів, можлива його цитопротективна роль при онкотрансформації, стимулює ріст Т-лімфоцитів і структурні зміни в мембрані еритроцита [Гендель и др.,1997, Жерновков и др.,2003, Торчинский и др.,2003]
Серед АКЗ в складі ТРГ (табл.1) лише Pro належить до гідрофобних і високорозповсюджених в мембранотропних пептидах. При достатньо високій загальній гідрофобності (Нш=1,52), яка співпадає з середнім значенням для досліджених РП, завдяки високому дольовому вмісту полярних АКЗ (R=2) значення дискримінантної функції Z=0,222 є найнижчим серед проаналізованих пептидів і наближається до значення, властивого для немебранних білків (рис.2). В діапазоні концентрацій 10-12-10-6 М, на відміну від більшості досліджених нами пептидів, для ТРГ не встановлено проникнення в гідрофобний шар фосфоліпідної мембрани. Проте, в значеннях ГСП виявлені особливості, відмінні від ефектів інших пептидів (рис.8). При пікомолярних концентраціях ТРГ протягом тривалого часу (60 хв) спостерігаються флуктуації ГСП азолектинового моношару (±30 мВ). Після чого відмічається тривале інтенсивне зростання цього показника. При подальшому додаванні зростаючих концентрацій пептиду флуктуації ГСП не відмічаються і приріст значень ГСП поступово припиняється (відсутність ефекту). При наближенні до мікромолярних концентрацій (10-7–10–6М) зростання ГСП відновлюється, але із значно нижчим приростом, ніж при низьких концентраціях.
Рис.8. Приклад зміни граничного стрибка потенціалу азолектинового моношару (р0=7,8 мН/м, ц0=300 мВ) при взаємодії з ним зростаючих концентрацій тироліберину (10-12–10–6М).
Отже, не проникаючи в матрикс мембрани ТРГ справляє значний вплив на стан її полярної зони, причому цей вплив характеризується двофазною концентраційною залежністю і є максимально вираженим в пікомолярних концентраціях. Отримані концентраційні залежності мембранотропної дії ТРГ узгоджуються з біофізичними дослідженнями його ефектів іншими методами (вплив на термо-індуковані структурні переходи і мікров’язкість ліпідного бішару мембрани ендоплазматичної сітки клітин печінки мишей), де найбільший ефект спостерігався саме при низьких концентраціях ТРГ – 10-10 і 10–16 М [Жерновков и др., 2003; Торчинский и др.,2003].
Мембранотропні властивості пентагастрину (ПГ). ПГ – синтетичний пептид, який включає С-термінальний тетрапептид, носій фізіологічної активності природного гормону гастрину, у зв’язку з чим широко застосовується в експериментальній і клінічній практиці. До складу ПГ (табл.1) входять 4 неполярні амінокислоти і лише одна полярна – від’ємно заряджена Asp, що визначає високі показники гідрофобності ПГ.
Взаємодія ПГ з азолектиновим моношаром має чітко виражену двофазність із значною активацією при наближенні концентрації пептиду до мікромолярних значень (Спер=2,5·10-7М) (рис.9, А). Перша фаза (починаючи з Смін=1,58·10-10М) характеризується низьким коефіцієнтом адсорбції Гіббса ГІ=2,804·10-8 М/м2. Коефіцієнт ГІІ другої фази складає 4,306·10-7 М/м2. Таким чином, процес адсорбції після певного періоду накопичення пептиду в примембранній зоні інтенсифікується в 15,4 рази (ГІ/ГІІ).
Рис.9. Зміни ГСП і поверхневого тиску при взаємодії пентагастрину (ПГ) з азолектиновими моношаровими мембранами з початковими параметрами р0=7,5±0,3 мН/м і ГСП0= 380±20 мВ (А) і з моношаровими мембранами, сформованими з ПМ міоцитів кишечника кроля з початковими параметрами: р0=9,1±0,4 мН/м, ГСП0=225±21 мВ (Б).
При взаємодії ПМ з моношаровими мембранами, сформованими з везикул ПМ міоцитів кишечника кроля, характер процесу адсорбції змінюється – зростає Смін, необхідна для початку реєстрації змін як ГСП, так і поверхневого тиску, відсутня фаза тривалого первинного накопичення препарату в зоні полярних головок, проте двофазність процесу зберігається, хоча і менш виражена (рис.9,Б), оскільки коефіцієнт адсорбції Гіббса першої фази (ГІ=2,885·10-7 М/м2) більш як в 10 разів перевищує показник ГІ при взаємодії ПГ з азолектиновою мембраною. Перехід до другої фази відбувається при концентрації ПГ 1,95·10-6М. Таким чином, співвідношення активності двох фаз (ГІ/ГІІ) адсорбції ПГ на мембранах, сформованих з природних ПМ, складає 3,04.
Отже, ПГ проявляє мембранотропну активність по відношенню як до фосфоліпідних мембран, так і до мембран, сформованих з матеріалу природних ПМ міоцитів, але загальний мембраномодулюючий ефект на ПМ нижчий – в основному за рахунок початкових етапів пептид-мембранної взаємодії. Повільна кінетика процесу на цьому етапі, очевидно, обумовлена наявністю від’ємно зарядженого залишку Asp в молекулі ПГ, що веде до електростатичного відштовхування його від мембрани при взаємодії з полярними головками одноіменно заряджених ліпідів, які в незначній кількості присутні в азолектині [Letters,1964]. Після накопичення критичної концентрації пептиду в примембранній зоні, відбувається досить активне його проникнення в матрикс мембрани. При взаємодії ПГ з ПМ початок періоду накопичення пептиду реєструється значно пізніше, проте він є набагато коротшим у порівнянні з фосфоліпідною мембраною. Подальша інкорпорація пептиду в матрикс мембран, сформованих з ПМ (ІІ фаза) є навіть активнішою, ніж у випадку фосфоліпідних мембран (за показником ГІІ), але за рахунок зниженного процесу адсорбції на І етапі загальний ефект (Δπ) є нижчим.
Мембранотропні властивості природних енкефалінів і їх синтетичного аналога Љ-77. Ми припустили, що для пептидів опіоїдного ряду здатність взаємодіяти з ліпідним матриксом мембрани могла б сприяти вибору лігандом того чи іншого типу з ряду опіоїдних рецепторів [Громов,1992] або певного сайту зв’язування на ньому і, як наслідок, визначати ті чи інші ефекти. На нашу думку, модифікація пептид-мембранної взаємодії різними факторами (ліпідний склад, фізико-хімічний стан мембрани і оточуючого її середовища тощо) може збільшувати спектр ефектів одного й того ж регулятора, тобто визначати його поліфункціональність, властиву для пептидних біорегуляторів взагалі
Природні енкефаліни (ЕНК) – пентапептиди, які розрізняються одним С-кінцевим амінокислотним залишком:Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu. Їм притаманні найвищі показники гідрофобності серед досліджених пептидів. У складі ЕНК присутні лише неполярні, переважно високогідрофобні АКЗ. Особливо це стосується Лей-ЕНК, в результаті чого його дискримінантна гідрофобність (функція Z) перевищує показники більшості проаналізованих пептидів (табл.1). Всі АКЗ в складі енкефалінів (за виключенням Met) належать до таких, що найбільш часто зустрічаються в досліджених нами мембранотропних пептидах.
Пентапептид Љ-77 – синтетичний аналог енкефалінів – має вдвічі більш високу анальгетичну активність, ніж природні ЕНК [Боброва, 1983]. На відміну від них, в Љ-77 на N-кінці присутній позитивно заряджений Lys+, який в АБП відіграє важливу роль у визначенні їх мембранотропних властивостей, сприяючи взаємодії з від’ємно зарядженими ліпідами бактеріальних мембран. За нашими розрахунками, середня гідрофобність Нш пептиду Љ-77 вища, ніж у кожного з ЕНК, проте наявність зарядженого Lys знижує значення дискримінантної функції Z. За цим параметром Љ-77 є більш гідрофобним, ніж більшість мембранних білків, але проміжним між Лей- і Мет-енкефалінами.
В діапазоні фізіологічних концентрацій ЕНК майже не взаємодіють з моношарами азолектину, сформованими на воді (І=0 г-екв/л). При збільшенні іонної сили субфази до 0,01 г-екв/л (0,01М KCl), енкефаліни інкорпоруються в азолектинові моношари, змінюючи їх початкові параметри, причому ці зміни залежать від типу енкефаліну.
Характер концентраційної залежності показників змінюється із зростанням початкової щільності мембрани – поступово зникає двофазність процесу (рис. 10), вираженість якої за нашими даними, отриманими для НГГ і їх синтетичних аналогів [Островська,1995], є прямопропорційною мембранотропній активності пептиду. На відміну від ряду інших пептидів, обидва ЕНК більш активно взаємодіють з азолектиновими моношарами низької щільності. При ущільненні фосфоліпідної мембрани збільшується Смін, знижується ступінь проникнення обох ЕНК в ліпідний моношар, швидко досягається стан насиченості і знижується загальний ефект (рис.10,11), що особливо вираженим є для Лей-ЕНК. При ро 13 мН/м його взаємодія з ліпідним моношаром, на відміну від Мет-ЕНК, остаточно припиняється (рис.10-12). Мет-ЕНК не тільки у значно нижчих концентраціях починає вбудовуватись у моношар, а й викликає більш значні зміни його параметрів. Тобто, характер взаємодії енкефалінів з азолектиновими моношарами залежить від С-кінцевого залишку молекули, вплив якого, в свою чергу, очевидно, визначається параметрами гідрофобності.
Рис.10. Концентраційна залежність поверхневого тиску азолектинових моно-шарів різної початкової щільності (р0) при їх модифікації Мет- (А) та Лей- (Б) енкефалінами
Рис.11. Концентраційна залежність змін ГСП азолектинових моно-шарів різної початкової щільності (р0) при взаємодії з ними Мет- (А) та Лей- (Б) ЕНК
Взаємодія енкефалінів з моношарами, сформованими з ПМ міоцитів тонкого кишечника кроля, є менш активною, ніж з фосфоліпідними мембранами. Це відмічається як у зростанні мінімальної ефективної концентрації, так і у зниженні показників Др і Дц у порівнянні з відповідними параметрами при взаємодії енкефалінів з фосфоліпідними мембранами. Відрізняється і характер залежності ефекту Др від ро – максимальна мембранотропна активність обох ЕНК реєструється при їх взаємодії з мембранами із значеннями ро в діапазоні 5-7 мН/м (рис.12,Б). Проте, виявлені ефекти також (як і в азолектинових мембранах) свідчать про процеси адсорбції енкефалінів в зоні полярних головок мембран і подальшої їх інсерції в гідрофобну зону (останнє більш властиве для Мет-ЕНК).
Рис. 12. Залежність зміни поверхневого тиску (Др) моношарів, сформованих з азолектину (А) і везикул ПМ міоцитів тонкого кишечника (Б) під впливом Мет- і Лей-ЕНК в залежності від ро мембрани.
Синтетичний аналог енкефалінів пептид Љ-77 взаємодіє з азолектиновими модельними мембранами найбільш активно в діапазоні їх початкової щільності 5-10 мН/м (подібно до ЕНК). Проте в його адсорбції спостерігається наявність двох різних за інтенсивністю фаз (рис.13).
Рис. 13. Зміни поверхневого тиску (А) і граничного стрибка потенціалу (Б) при взаємодії синтетичного пептиду Љ-77 з азолектиновими моношаровими мембранами з початковими параметрами р0=5,5±0,3 мН/м і ГСП0= 280±20 мВ.
Отже, Љ-77 займає проміжне положення між Мет- і Лей-ЕНК як за рівнем гідрофобності, так і за значенням Смін, необхідної для прояву мембранотропних ефектів. Проте, кінетика процесу адсорбції значно відрізняється – у природних ЕНК він є однофазним, тоді як у Љ-77 – 2-фазним, причому інтенсивність другої фази (за значеннями коефіцієнта Г) значно перевищує інтенсивність адсорбції кожного з ЕНК. Проте, за рахунок більш інтенсивної взаємодії ЕНК з мембраною в діапазоні концентрацій 10-10-10-7 М/л (коли для Љ-77 відбувається фаза повільної адсорбції) загальний ефект мікромолярних концентрацій природних пептидів значно переважає відповідний ефект пептиду Љ-77.
Вплив іонів металів і іонної сили електроліту на поверхнево-активні і мембранотропні властивості Мет- і Лей-енкефалінів. В умовах організму, пептид-мембранна взаємодія може модифікуватися додатковими факторами, які впливають на стан ліпідного матриксу мембрани або самих пептидів, зокрема, іонним складом позаклітинного середовища і його іонної сили (І). На модельних мембранах такий вплив був продемонстрований нами для меланостатину. Ми дослідили вплив К+, Мg2+ та Са2+ на мембранотропну активність ЕНК при різній І субфази та різних концентраційних діапазонах пептидів, звертаючи увагу саме на зміну значень ГСП мембран, оскільки для ЕНК вплив на цей показник є більш вираженим.
При близьких значеннях поверхневого тиску в моношарах (р=5,9±0,9 мН/м) іони по-різному впливають на величину ГСП у них. Така різниця є більш вираженою при І=0,01 г-екв/л, ніж при І=0,1 г-екв/л. Проте, за інтенсивністю впливу на значення ГСП азолектинових моношарів в дослідженому діапазоні значень іонної сили ряд Са2+>Mg2+>К+ зберігається (рис.14). При впливі іонів на адсорбційні моношари енкефалінів, характер впливу зростання іонної сили субфази на параметри моношарів для кожного з двох пептидів майже не залежить від типу іона, тоді як за інтенсивністю впливу іони розподіляються вже в інший ряд, відмінний від ряду впливу на ліпідні моношари – Mg2+≈K+>Са2+ для Лей-ЕНК і, навпаки, Са2+ > Mg2+ ≈ K+ для Мет-ЕНК. Як і в інших експериментах, відповідь Мет-ЕНК на зростання іонної сили при кожному з досліджених типів іонів знов-таки є більш активною у порівнянні з Лей-ЕНК.
Рис.14. Вплив іонного складу і іонної сили (ІС) субфази на значення ГСП азолектинових моношарів (р0= 5,9±0,9 мН/м)
Рис.15. Приріст ГСП при взаємодії 10-6 М енкефалінів з азолектиновими моношарами (р0= 5,9±0,9 мН/м) на субфазах різного іонного складу і різної іонної сили (ІС).
Іонний склад субфази та її іонна сила впливають і на характер змін ГСП при взаємодії обох ЕНК з азолектиновим моношаром, що також проявляється по-різному для двох ЕНК. Чим більший приріст ГСП викликають іони в ліпідній мембрані, тим менший додатковий вплив справляє на неї високогідрофобний Лей-ЕНК. І навпаки – зростання ГСП самої мембрани сприяє прояву ефекту Мет-ЕНК. Проте достовірний вплив зміни іонної сили на цей процес виявляється тільки для іонів Са2+ (рис.15). Таким чином, визначені особливості ефектів іонів на адсорбцію пептидів на азолектинових моно шарах, опосередковані як їх впливом на фізико-хімічний стан ліпідів, так і на поведінку пептидів у розчині.
В цілому, отримані результати дозволяють віднести енкефаліни до ряду пептидів, для яких мембранотропна активність є важливою умовою прояву їх біологічної дії. Очевидно, для енкефалінів, через їх низьку власну поверхневу активність, не властиві такі безрецепторні ефекти як безпосередня взаємодія з транспортними АТФазами і іншими мембранними білками, каналоутворююча здатність тощо. Проте Мет-ЕНК більш активно модифікує фосфоліпідні мембрани, проникаючи в їх матрикс, тоді як ефекти Лей-ЕНК більш обмежені поверхневою зоною мембрани. Така різниця в мембранотропних ефектах, обумовлена єдиним АКЗ, може забезпечувати подальшу селективність ЕНК у виборі підтипу рецептора. Вважається, що Лей-ЕНК переважно є лігандом д-рецепторів, акцепторні сайти яких розташовані на зовнішній поверхні ПМ, тоді як Мет-ЕНК може взаємодіяти як з м- (акцепторні сайти – в гідрофільній зоні мембрани), так і з д-типами (гідрофобна зона) [Громов, 1992]. Отже, різна ступінь гідрофобності і різна мембранотропна активність двох енкфалінів (ступінь їх проникності в мембрану), а також її модуляція додатковими факторами, зокрема іонним складом середовища, вже на найперших етапах їх взаємодії з ПМ може сприяти вибору різних підтипів рецепторів і забезпечувати поліфункціональність дії данного пептиду.
Мембранотропні властивості нейротензину (НТ). Тридекапептид НТ (табл.1) залучений у цілий ряд ефектів в центральній і периферичній нервовій системі [Martin et al., 1999]. Він також відомий як один з найбільш потужних антиноцицептивних препаратів [Vincent et al., 1997]. Доведена його участь в процесах, що мають відношення до таких хвороб, як шизофренія, хвороби Паркінсона і Альцгеймера [Громов, 1992].
В складі НТ гідрофобні домени рознесені по кінцевих ділянках молекули, а центральна частина є гідрофільною і позитивно (+3) зарядженою. Співвідношення R (полярні/неполярні залишки) у НТ дуже високе (1,6) за рахунок великої кількості полярних АКЗ – вище, ніж у немембранних (R=1,26) або зовнішніх мембранних (R=1,37) білків. В той же час, завдяки тому, що неполярні амінокислотні залишки в його складі мають найвищі показники ДGпер, загальний рівень гідрофобності НТ (Нш=1,749), перевищує відповідний показник мембранних білків і більшості регуляторних пептидів (табл.1) Внаслідок цього Z, як лінійна комбінація показників R і Нш, наближена до значень в групі внутрішньомембранних білків. Отже, молекулу НТ можна охарактеризувати як структуру з яскраво вираженими аміфільними властивостями, яка повинна активно взаємодіяти своєю центральною частиною з гідрофільною зоною полярних головок, тоді як кінцеві ділянки будуть занурюватися в гідрофобну зону ацильних ланцюгів, або згортатися всередину молекули.
НТ проявляє незначну власну поверхневу активність і не формує на поверхні субфази суцільних адсорбційних моношарів навіть при досить високих концентраціях (10-7-10-6 М). Ліпопротеїновий моношар (60% азолектин, 10% холестерол, 30% сироватковий альбумін людини, за ваг.спів.) сприяє не тільки концентруванню молекул НТ в полярній зоні мембрани, про що свідчать зростання значень ГСП, а й інсерції молекул пептиду в моношар (зростають значення поверхневого тиску р). Активність такої взаємодії залежить від щільності моношару. Показово, що в дослідженому діапазоні поверхневого тиску (до 10 мН/м) активність зростає із збільшенням щільності мембран (що наближує їх до властивостей біологічних мембран). Достовірне проникнення пептиду в гідрофобний матрикс відбувається при початковій щільності мембрани вище 9 мН/м (рис. 16,А).
Рис.16. Зміни поверхневого тиску (А) і ГСП (Б) в ліпопротеїнових моношарових мембранах з різною початковою щільністю (р0) при адсорбції НТ.
Крім того, з ущільненням мембрани: (1) – процес набуває чітко вираженої двофазності, що також свідчить про збільшення афінності пептид-мембранної взаємодії; (2) – знижується мінімальна діюча концентрація НТ (С мін) і питома площа на молекулу НТ при максимальній адсорбції; (3) – зростає коефіцієнт адсорбції Гіббса (Г) і загальний ефект пептиду на стан мембрани, який виражається в її ущільненні (Δπ), що свідчить про збільшення кількості пептиду зв’язаного з мембраною. Зростання величини ГСП (Дц) є дуже незначним і не має чіткого розподілу на 2 фази (рис.16, Б), що також свідчить про те, що молекули НТ при адсорбції практично не затримуються поблизу поверхні мембрани, а переважно інкорпоруються між її молекулами.
Отримані факти виступають одним з доказів того, що досліджуваний процес не є простою фізичною адсорбцією, а може розглядатися певною мірою як спеціфічна взаємодія НТ з мембранною структурою, оскільки для біологічних досліджень має значення характер взаємодії пептиду саме з більш щільними мембранами, параметри яких наближені до клітинних мембран.
При взаємодії НТ з азолектиновими мембранами показники адсорбції (коефіцієнт Гіббса і зростання поверхневого тиску, Др) перевищують відповідні показники його взаємодії з ліпопротеїновими мембранами. Інтенсивність взаємодії НТ з моношарами азолектину також залежить від початкової щільності ліпідного моношару і зростає при її збільшенні. Але в даному випадку особливості адсорбції дещо відрізняються від процесів, досліджених на ліпопротеїнових мембранах. По-перше, Смін, необхідна для початку інкорпорації пептиду в ліпідний матрикс, при взаємодії НТ з азолектиновими мембранами значно перевищує аналогічний показник для ліпопротеїнових мембран. Крім того, на відміну від ліпопротеїнових мембран, з ущільненням мембрани він зростає. По-друге, взаємодія з фосфоліпідним азолектиновим матриксом у всьому дослідженому діапазоні початкових щільностей (р0) проявляє двофазний характер (рис.17). Перехід до активної фази (у всьому дослідженому діапазоні р0) відбувається при концентраціях НТ біля 0,5 мкМ.
Проте з ущільненням мембрани зростає як інтенсивність адсорбції в кожній з фаз (Г), так і співвідношення між їх показниками ГІІ/ГІ (рис.18).
Рис.17. Зміни поверхневого тиску в азолектинових мембранах при інкорпорації в них молекул нейротензину.
Рис.18. Зміни співвідношення коефіцієнтів адсорбції Гіббса (Г) при взаємодії нейротензину з азолектиновими моношарами при зростанні р0 модельної мембрани
.
З аналізу значень питомої молекулярної площі, що припадає на 1 молекулу НТ в мембрані при максимальній адсорбції, витікає, що НТ здатний вбудуватися в щільні азолектинові мембрани в кількості, що майже в 3 рази перевищує його інкорпорацію в тих же умовах в ліпопротеїнову мембрану.
Таким чином, якщо ліпопротеїнова модельна мембрана, яка за своїми властивостями більш повно відповідає ПМ тваринної клітини, сприяє більш ефективному початку процесу пептид-мембранної взаємодії, то мембрана, сформована тільки з фосфоліпідів, в значній мірі сприяє розвитку наступної стадії – інкорпорації нейротензину поміж ліпідними молекулами.
Припускається, що одним з головних факторів, що визначають адсорбцію позитивно заряджених молекул пептиду на мембранах є звичайна електро-статична взаємодія з негативними полярними групами окремих мембранних ліпідів. Для перевірки цього припущення ми дослідили особливості взаємодії високозарядженого НТ з мембранами, сформованими тільки з негативно зарядженого фосфатидилсерину (ФС) в різному діапазоні початкової щільності.
У всіх діапазонах щільності НТ починає вбудовуватись в ФС-мембрани у концентраціях, нижчих, ніж у випадку з ліпопротеїновими та азолектиновими мембранами (рис.19,А). З зростанням щільності ФС-мембрани Смін пептиду знижується. Це обумовлено зростанням загального заряду на одиницю площі мембрани, що забезпечує більш ефективне концентрування позитивно-заряджених молекул НТ біля її поверхні. При взаємодії НТ з ФС-мембранами встановлена також на порядок нижча концентрація переходу (Спер) процесу адсорбції до другої, інтенсивної фази. Але, незважаючи на ранній початок процесу, подальша інкорпорація молекул НТ у ФС-мембрани не тільки менш ефективна у порівнянні з азолектиновими моношарами, але й її інтенсивність (коефіцієнт Гіббса) знижується з наростанням щільності мембрани. Оскільки при взаємодії НТ з ФС-моношаром відбувається взаємна нейтралізація заряду, значних змін ГСП не реєструється – відповідні показники в середньому в 1,5 рази нижчі, ніж при взаємодії з нейтральними азолектиновими мембранами. Проте зберігається залежність – з ущільненням мембрани зменшуються зміни ГСП, які викликаються взаємодією пептиду з такою мембраною.
Таким чином, наявність заряду на ліпідних молекулах не тільки сприяє активації адсорбції НТ в області полярної зони мембрани при низьких концентраціях, але й затримує молекули пептиду в цій ділянці, знижуючи їх подальше проникнення в гідрофобний матрикс мембрани.
Співставлення процесів взаємодії НТ з трьома дослідженими типами мембран дозволяє зробити висновок, що як хімічний склад, так і фізичний стан (в даному випадку – щільність упакування молекул-компонентів мембрани) відіграє важливу роль у модуляції характеру взаємодії пептиду з мембраною. Загальний ефект НТ на стан мембрани, виміряний за зростанням поверхневого тиску у ній при інкорпорації пептидних молекул, більш виражений у азолектинових мембранах (рис.19, Б). Проте мінімальні ефективні концентрації є значно нижчими в ліпопротеїнових і, особливо, ФС-мембранах. В ліпопротеїнових мембранах низької щільності ефект є найнижчим серед досліджених моделей, але із зростанням початкової щільності мембран, яке активізує процес інкорпорації НТ у всіх досліджених нами системах, інтенсивність вбудовування біорегулятора максимально активується саме в фосфоліпід-холестерол-білкових мембранах.
Отримані дані, очевидно, можуть бути пояснені тим, що у ліпопротеїновій мембрані крім негативно-заряджених фосфоліпідів додатково присутні білки, гідрофільні ділянки яких виступають у позамембранне середовище. Цей фактор сприяє концентруванню пептиду поблизу поверхні мембрани (і низьким значенням Смін). З іншого боку, невисока (порівняно з фосфатидилсериновими мембранами) наявність кислих фосфоліпідів у такій мембрані не перешкоджає реалізації другого етапу взаємодії – активному проникненню пептиду у гідрофобну ділянку ліпідного матриксу. Проте холестерол, який присутній в ліпопротеїновій мембрані і знижує конформаційну рухомість ацильних ланцюгів ліпідів, гальмує і процес проникнення НТ в гідрофобну зону такої мембрани – результатом цього і є знижений загальний мембранотропний ефект (Др) нейротензину у ЛП мембранах.
Рис.19. Залежність початкової (мінімальної) концентрації вбудовування, Смін (А) молекул нейротензину і його загального мембранотропного ефекту, Др (Б) від початкової щільності упаковки (р0) моношарових мембран різного складу: АЛ – азолектинова, ФС – фосфатидилсеринова, ЛП – ліпопротеїнова.
Вплив НТ на характеристики БЛМ. Досліджено вплив НТ в діапазоні концентрацій 10-9- 2·10-5 М на електричну ємність і провідність БЛМ, сформованих з сумарної фракції фосфоліпідів мозку бика. Середня питома ємність немодифікованих мембран – 0,3 мкФ/см2, електропровідність – 27,3 пСм при 25єС. Збільшення концентрації НТ в розчині веде до зростання обох показників (рис.20), але в більшій мірі змінюється інтегральна провідність мембран (достовірний приріст – з 10-7 М НТ), тоді як зміни ємності виражені менше. Проте, збільшення ємності мембран лише у 1,5–2 рази вже є досить суттєвим. Ємність мембрани може бути розрахована за формулою для ємності плоского конденсатора: С=SмD/L, де Sм – площа БЛМ, D – ефективна діелектрична проникність неполярної частини бішару, L – товщина мембрани. З рівняння видно, що, оскільки збільшення ємності мембрани у 1,3 – 1,4 рази, яке спостерігається в експерименті при фізіологічних концентраціях НТ, не може пояснюватися збільшенням площі та/або зниженням товщини бішару, головною причиною зростання цього параметру мембрани слід вважати зростання діелектричної проникності гідрофобної зони мембрани під впливом пептиду. Таке збільшення діелектричної проникності має призвести до збільшення коєфіцієнту розподілу неорганічних іонів між водним розчином і неполярною зоною мембрани та, як наслідок, до росту провідності БЛМ.
Рис.20. Відносні зміни електроємності (С/С0) та електропровідності (G/G0) БЛМ з сумарної фракції фосфоліпідів мозку бика при дії НТ. Субфаза 0,15 М КCl-трис-НСl, рН=6,8, t=25 єC
Раніше [Рибальченко та ін., 1990] нами встановлений активний вплив окситоцину на показники БЛМ з формуванням канальних структур. Для інших досліджених РП зміни параметрів БЛМ не перевищували 10-20%.
Мембранотропні властивості біорегуляторів - похідних амінокислот. Оскільки одним з визначаючих факторів мембранотропної дії пептидних біорегуляторів є їх амінокислотний склад, можливо, що й біорегулятори, які є похідними окремих амінокислот, здатні в тій чи іншій мірі реалізувати свої біологічні ефекти через етап взаємодії з ліпідним матриксом мембрани-мішені. Ми дослідили мембранотропні ефекти природного амінокислотного біорегулятора гамма-аміномасляної кислоти (ГАМК) і нового вітчизняного синтетичного кардіотонічного препарата – суфану, який є похідним бурштинової кислоти і амінокислоти триптофану.
ГАМК – гідрофільна амінокислота, що є продуктом декарбоксилювання глутамінової кислоти, не входить до складу білків і є медіатором нервової системи. В концентраціях 10-10-10-4 М ГАМК не проникає в матрикс ліпідних мембран, але адсорбуєтся на його поверхні, впливаючи на орієнтацію полярних груп, про що свідчить зміна ГСП, починаючи з концентрацій, вище 10-10 М. При цьому приріст значень ГСП при різних концентраціях ГАМК в субфазі відбувається з різною інтенсивністю (рис.21). Максимальний ефект ГАМК відзначається при концентрації 10 -6 М – при цій концентрацій найвищою є як швидкість приросту ГСП в часі, так і абсолютна зміна цього показника. При подальших збільшеннях концентрації препарату приріст значень ГСП стає менш вираженим.
Рис.21. Швидкість приросту ГСП (V) на азолектиновій мембрані при ступінчастому нарощуванні концентрацій ГАМК в субфазі.
Таким чином, ефект взаємодії ГАМК із ліпідним матриксом обмежується концентруванням препарату на поверхні мембрани, що є важливою умовою подальшої ефективної ліганд-рецепторної взаємодії.
Кардіотонік суфан (дикалієва сіль N-сукциніл-триптофану), клінічні випробування якого тривають, виробляється у вигляді L-форми, що містить тільки L-триптофан та D,L-форми, яка є рацемованою сумішшю двох ізомерів. Нами встановлено, що ліпідна фаза мембрани відіграє активну роль в процесі взаємодії з нею оптичних ізомерів суфану. Наявність фосфоліпідного моношару модулює мембранотропні властивості препаратів суфану таким чином, що менш поверхнево-активний L-суфан при низьких концентраціях (до 10-6 М) виявляється більш мембраноактивним по відношенню до мембран різного складу, ніж D,L-суфан Проте, при подальшому збільшенні концентрації препарату в субфазі взаємодія L-суфану припиняється, тоді як для D,L-форми – продовжується, внаслідок чого при високих концентраціях в ряді випадків загальний ефект цієї форми навіть перевищує ефект L-ізомеру. Аніонні ліпіди перешкоджають як початку процесу адсорбції (ведуть до збільшення Смін), так і подальшій інкорпорації речовини (особливо L-форми) в мембрану. При взаємодії з цвіттеріонним фосфатидилхоліном D,L-форма виявилась більш активною – її ефект перевищує ефект L-форми 1,93 рази (р<0,02) і наближений до ефекту при інкорпорації в азолектинові мембрани (рис.22). При взаємодії суфану з ліпопротеїновою мембраною змінюється кінетика процесу, характерна для взаємодії препаратів з фосфоліпідними мембранами. Для D,L-суфану зникає двофазність інкорпорації, а для L-суфану при такому ж максимальному ефекті, як і при його взаємодії з азолектиновою мембраною, процес розтягується у часі. Наявність білків і холестеролу, очевидно, створює додатковий бар’єр для проникнення як L-, так і D,L-суфану. Проте, при взаємодії з ліпопротеїновою мембраною (на відміну від фосфоліпідних) загальний ефект L-суфану значно переважає ефект D,L-форми (в 10,25 раза, р<0,001) і практично співпадає з ефектом на азолектинових мембранах.
Рис.22. Порівняння загального ефекту (за зростанням поверхневого тиску) L- і DL-форм суфану (10 –5 М) при їх взаємодії з модельними мембранами різного складу (р0= 9,0±0,5 мН/м): АЛ - азолектинова; ФС - фосфатидилсеринова; ФХ - фосфатидилхолінова; ЛП-ліпопротеїнова мембрана
Отже, ці дослідження можуть пояснювати і більш високу ефективність L-ізомеру порівняно з рацематом в медико-біологічних і клінічних дослідженнях і дозволяють стверджувати, що в прояві біологічної дії і, зокрема, стереоселективності суфану активна роль належить його безрецепторним взаємодіям з ліпідним матриксом мембрани.
Мембранотропні властивості екзогенних біорегуляторів. Встановлено, що мембранотропна активність гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) є нижчою порівняно з пептидними біорегуляторами і її дія обмежується поверхневою зоною мембрани за рахунок концентрування на поверхні ліпідного матриксу, що узгоджуються з встановленими в нашому колективі ефектами 2,4-Д на БЛМ [Бычко, 2002] і з її впливом на стан мембрани еритроцитів [Suwalsky et al., 1996]. Процес має слабковиражену двофазність. Для регулятора росту рослин івіну (N-оксид 2,6-диметилпіридину), як і для ендогенних РП, властивий двофазний характер взаємодії з мембраною, який, проте, має якісні і кількісні відмінності від особливостей пептид-мембранних взаємодій. Концентраційна залежність має вигляд кубічної параболи, яка не зустрічається для інших досліджених нами ліганд-мембранних взаємодій. На першому етапі (10–11-10-8 М) молекули івіну адсорбуються переважно в полярній зоні, але на орієнтацію полярних груп впливають в незначній мірі (зміни ГСП не перевищують +20-30 мВ), частково вбудовуючись в мембранний матрикс. При концентрації івіну близко 10-8М досягається стан насиченості з виходом концентраційної залежності на плато (відсутнє при пептид-мембранних взаємодіях). Проте, процес посилюється при наближенні до мікромолярних концентрацій. При цьому при взаємодії з більш щільно упакованими мембранами івін не тільки інтенсивніше вбудовується в гідрофобну зону мембрани, а й активніше впливає на орієнтацію її заряджених компонентів (за змінами ГСП).
Обидва ксенобіотики впливають на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність везикул ПМ гепатоцитів в умовах, коли виключається можлива взаємодія з рецепторами (рис.23). Ефекти 2,4-Д на обидва типи Mg2+,Ca2+-АТФазної активності мають подібний (параболічний) характер концентраційної залежності і більш виражені для високоафінної АТФази, яка є основним компонентом Ca2+-насосу ПМ. Під впливом івіну не відбувається достовірних змін в активності обох форм Mg2+,Ca2+-АТФази, хоча зберігається тенденція до параболічної концентраційної залежності його впливу на ферментативну активність і більш виражена відповідь високоафінної форми Mg2+,Ca2+-АТФази.
Рис.23. Концентраційна залежність відносної високоафінної та низькоафінної Mg2+, Ca2+-АТФазної активності фракції ПМ клітин печінки щурів під впливом 2,4-Д (А) і івіну (Б).
Мембранотропні властивості фітопрепаратів. На даний час значна кількість фітопрепаратів підбирається емпіричним шляхом. Актуальним залишається добір тестових систем, які допомогли б, в залежності від потреб, зупинитися на більш поліфункціональних або, навпаки, селективних рецептурах. Враховуючи отримані нами факти про тісний зв’язок біологічної дії БАР з характером їх мембранотропної активності, ми припустили, що одним з таких ефективних тестів активності фітопрепаратів, може бути аналіз їх мембранотропної дії в модельних системах. Нами встановлена висока мембранотропна активність і охарактеризовані її параметри для ряду фітопрепаратів з радіо- і гепато-протективною дією - спиртових екстрактів квіток і трави ехінацеї пурпурової, кореневища цикорію і лепехи звичайної, трави деревію, багатокомпонентної фітонастоянки вітчизняного виробництва “Поліфітол-1”, в хімічному складі якої переважають поліфеноли. Всі досліджені препарати є мембранотропними агентами, які, високоймовірно, здатні справляти вплив на мембрани різних клітин організму, не потребуючи обов’язкової наявності специфічних білкових рецепторів до молекул його складових, а взаємодіючи безпосередньо з ліпідним матриксом мембрани. Найвищу поліфункціональність дії серед представлених препаратів повинні проявляти препарати з найвищими показниками мембранотропності – аїру і трави ехінацеї. Показана залежність прояву мембранотропної активності від особливостей отримання препарату, що може бути застосовано при подальшому пошуку природних мембраностабілізаторів.
Пряма взаємодія компонентів фітопрепаратів з ліпідним матриксом мембрани додатково підтверджує універсальність безрецепторного “ліпідного” механізму реалізації біологічної активності речовин різної хімічної природи. Метод попереднього експрес-визначення біологічної активності фітопрепаратів за показниками їх мембранотропної активності застосований при доборі фітозборів з гепатопротективною активністю сумісно з кафедрою фітотерапії Медичного інституту Української асоціації народної медицини. Його ефективність підтверджена в клінічних дослідженнях у пацієнтів з різними формами гепатитів [Гарник, 2004]. Метод зареєстровано МОЗ України як нововведення в галузі охорони здоров’я (2003, реєстраційний № 249/19/03).
Узагальнення. Взаємодія всіх досліджених біорегуляторів з ліпідними мембранами розпочинається, а в ряді випадків обмежується (ГАМК, тироліберин, МІФ) їх накопиченням в зоні полярних головок ліпідів. Інтенсивність і концентраційні характеристики цього етапу взаємодії пов’язані як з особливостями структури біорегулятора, так і з особливостями модельної мембрани, зокрема складом її полярної зони. Мінімальні діючі концентрації (Смін) спостерігаються при взаємодії біорегуляторів з від’ємно зарядженими мембранами з фосфатидилсерину. На ФС-мембранах з вищим ступенем щільності значення Смін ще більше знижується, що легко пояснюється одночасним зростанням щільності зарядів на мембрані і, як наслідок, збільшенням електростатичної взаємодії. При застосуванні модельних ліпопротеїнових мембран або природних ПМ значення Смін звичайно є проміжним – кількість від’ємно заряджених ліпідів в них складає 20-30 %, проте додатково присутні білкові домени, які додають свій внесок в електростатичні взаємодії. Якщо ж в складі самого біорегулятора присутні від’ємно заряджені групи, одноіменний заряд ФС-мембран, навпаки, гальмує їх накопичення на поверхні мембрани. Наявність таких груп знижує мембранотропну активність біорегуляторів і по відношенню до азолектину, який в цілому нейтральний, але містить в своєму складі також фосфатидилсерин і фосфатидилетаноламін [Letters, 1964].
Крім того, аніонні ліпіди, а також, очевидно, заряджені амінокислотні залишкі на білкових ланцюгах в складі модельних ліпопротеїнових і природних ПМ не тільки сприяють первинному концентруванню більшості біорегуляторів на поверхні мембрани, але й частково перешкоджають їх подальшому проникненню в гідрофобний матрикс, утримуючи молекули біорегуляторів за рахунок електростатичних сил в зоні полярних головок. При взаємодії з такими мембранами загальний мембранотропний ефект завжди значно нижчий, ніж при взаємодії з азолектиновими моношарами. Ще більше зниження загального ефекту (але не його повне пригнічення!) спостерігається і при взаємодії препаратів з ліпопротеїновими мембранами, що, очевидно, обумовлено додатковою наявністю холестеролу в їх складі, який знижує конформаційну рухомість ацильних ланцюгів мембранних ліпідів.
Активність адсорбції і загальний ефект досліджених БАР є найвищими при їх взаємодії з мембранами з азолектину. Більше того, в ряді випадків ефективність інкорпорації молекул в ці мембрани зростає з їх ущільненням до певного рівня, демонструючи, таким чином, підвищену афінність мембранотропних речовин до мембран з сумарної фосфоліпідної фракції.
Для мембран різного ліпідного складу, як і для різних пептидів, навіть з незначними відмінностями за вмістом АКЗ (наприклад, енкефалінів), характер залежності інтенсивності інкорпорації від щільності мембрани є різним. Зниження Смін із збільшенням щільності мембрани характерно тільки для аніонних мембран і викликається збільшенням до певного ступеня щільності зарядів, яке сприяє більш швидкому концентруванню пептидів на поверхні мембрани. Для мембран, які мають в цілому нейтральний заряд, із збільшенням їх щільності потребується більша початкова концентрація біорегуляторів, але і проникнення в їх гідрофобну зону відбувається більш активно, оскільки електростатичні сили не затримують ліганд в полярній ділянці мембрани.
Ефективність інкорпорації пептидних біорегуляторів в азолектинові мембрани тісно, але не завжди прямо, пов’язана з рівнем їх гідрофобності. Всі проаналізовані пептиди, за виключенням тироліберину, характеризуються високими показниками параметрів гідрофобності – вони вищі, ніж навіть у внутрішньо мембранних клітинних білків і практично співпадають з відповідними показниками мембранотропних антибактеріальних і цитотоксичних пептидів (рис. 1). Раніше [Островська, 1995] для трьох пептидів – вазопресину, окситоцину і дезаміноокситоцину ми отримали пряму залежність взаємозв’язку показників гідрофобності пептиду (зокрема дискримінантної функції Z) і його мембранотропного ефекту. Проте, дослідження і аналіз їх вкорочених і подовжених фрагментів, які мали близькі показники гідрофобності, але різну кількість полярних і, зокрема, заряджених груп, показали, що, очевидно, більш важливе значення має поєднання цих параметрів. Представлене дослідження підтверджує це припущення.
Достовірний ефект проникнення в ліпідний матрикс (Др≥ 2 мН/м) виявляють пептиди, у яких показник лінійної дискримінантної функції Z перевищує 0,3 (рис. 24). З подальшим зростанням значення Z до 0,8 ефект збільшується (коефіцієнт лінійної кореляції r =0,862). При перевищенні цього значення (що відбувається при поєднаннї високої загальної гідрофобності і зменшеного вмісту полярних амінокислотних залишків) мембранотропний ефект різко знижується. Вирівнювання отриманого емпірічного ряду за методом Чебишева дозволило знайти теоретичну залежність мембранотропного ефекту від значення Z, представлену на рис. 24 суцільною кривою, яка наближена до параболи другого порядку.
Рис.24. Залежність ефективності інкорпорації регуляторних пептидів (за зміною поверхневого тиску в мембрані) від значення лінійної дискримінантної функції Z. Концентрація пептидів у субфазі – 10-6 М, мембрани – моношари азолектину, р0 – від 5до 7 мН/м).
В цілому механізм ефектів пептидних і інших біорегуляторів за участю ліпідного матриксу мембрани можна уявити таким чином (рис.25):
На першому етапі біорегулятори адсорбуються на мембрані за рахунок електростатичних зв’язків. Це сприяє їх концентруванню і набуттю певної конформації (фолдингу). Вже на цьому етапі взаємодія БАР з мембраною сприятиме зв’язуванню біорегулятора з поверхневими акцепторними сайтами рецептора. Наступним етапом є інкорпорація молекули біорегулятора в гідрофобну зону ліпідного матриксу. Набуваючи остаточної, єдино можливої конфігурації в гідрофобному оточенні, молекули біорегуляторів стають здатними ефективно зв’язуватись з внутрімембранними акцепторними сайтами відповідних рецепторів, безпосередньо взаємодіяти з мембранними білками (АТФазами, G-білками і ін.) або впливати на їх функціонування через локальні зміни фізико-хімічного стану ліпідів, утворювати іон-провідні структури, можливо, виступають субстратами для утворення внутрімембраних і внутріклітинних месенджерів (наприклад, пептидної природи).
Здатність біорегулятора до реалізації того чи іншого етапу пептид-мембранних взаємодій, з представлених на рис. 25, залежить від його первинної структури, яка й визначає його фізико-хімічні властивості. Особливості таких взаємодії залежатимуть і від фізико-хімічних властивостей самої мембрани. Слід нагадати, що ці властивості можуть бути різними не тільки для мембран клітин різних тканин, але й при змінах стану одних і тих же клітин, зокрема, при апоптозі, онкотрансформації тощо [Azuma et al., 2002]. Виходячи з цього, можна припускати існування відносної специфічності безецепторних пептид-ліпідних мембранних взаємодій.
Рис. 25. Можливі шляхи дії пептидних біорегуляторів на клітину з урахуванням їх мембранотропної активності
І – попередня адсорбція на поверхні ліпідного матриксу мембрани, яка забезпечує набуття пептидом біологічно активної конформації, необхідної для взаємодії з рецептором. Наслідком цього може бути: 1.1 – зміна стану полярної зони ліпідного матриксу; 1.2 – забезпечення ефективної взаємодії з поверхневими акцепторними сайтами рецепторів;
ІІ – різні ступені проникнення пептидної молекули в ліпідний матрикс мембрани, в результаті чого може відбуватися: 2.1 – взаємодія біорегулятора з гідрофобним внутрімембранним акцепторним сайтом рецептора 2.2 - зміна фізико-хімічного стану оточуючих ліпідів, яка може приводити до зміни функціонування мембрано-зв’язаних білків, зокрема транспортних АТФаз; 2.3 – безпосередній вплив біорегуляторів на активність таких білків; 2.4 – формування іонних каналів.
В цілому біологічне значення безрецепторної взаємодії регуляторних пептидів з мембранним матриксом може полягати в таких аспектах:
1. Накопичення ліганду на поверхні мембрани, створення більш ефективної діючої концентрації. Це може бути одним з пояснень ефективності дії ультрамалих доз біорегуляторів.
Крім асиметрії в ліпідному складі між двома моношарами мембран спостерігається також нерівномірне розташування різних ліпідів в межах одного моношару (утворення доменів) [Rodgers, Glaser,1991], що також може мати значення для накопичення певного регуляторного пептиду або іншого біорегулятора в тій чи іншій зоні мембрани [Bandrowich-Picuіa, 2000].
2. Опосередкування вибору підтипу рецептору (наприклад, у випадку енкефалінів, нейрокінінів).
3. Забезпечення безпосередньої взаємодії з мембранними регуляторними структурами – АТФазами (нейрогіпофізарні гормони), G-білками (пептид мастопаран з отрути оси) тощо.
4. Формування пептидних іонних каналів з наступною зміною іонного статусу клітини – як один з механізмів впливу на скорочення міоцитів (нейрогіпофізарні гормони) чи реалізація антибактеріальної дії ряду антибіотиків.
5. Зміна фізико-хімічного стану самого ліпідного матриксу, а через це – активності мембранних ферментів, транспортних і інших білків, функціонуваня яких, як відомо, в значній мірі визначається станом анулярних ліпідів.
Наші дослідження мембрано-активних властивостей похідних амінокислот, екзогенних речовин-ксенобіотиків і фітопрепаратів підтверджують універсальність механізму ліпідного шляху реалізації біологічної дії біорегуляторів. І, нарешті, встановлені нами безрецепторні ефекти окремих біорегуляторів (тироліберин, 2,4-Д), коли ефект проявляється в малих дозах і зменшується або зникає при збільшенні концентрації речовини, очевидно, можуть виступати підставою для залучення ліпідного компоненту в пояснення механізмів такого явища як “парадоксальна токсичність”, при якому менші дози БАР виявляють вищий ефект [Бурлакова,2003; Криштопенко, 2001].
ВИСНОВКИ
Регуляторні пептиди з різними структурно-функціональними властивостями (оптичні ізомери кіоторфіну, тироліберин, меланостатин, пентагастрин, Мет- і Лей-енкефаліни, їх синтетичний аналог S-77, нейротензин), похідні амінокислот (гамма-аміномасляна кислота і кардіотонік суфан), ксенобіотичні речовини (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота і N-оксид диметил-піридину) і фітопрепарати здатні взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран без попереднього залучення специфічних білкових рецепторів.
Взаємодії біорегуляторів з мембранами опосередковуються ліпідним складом і залежать як від електростатичних, так і від гідрофобних ефектів. Аніонні ліпіди сприяють концентруванню БАР на поверхні мембрани, більш ефективне проникнення регуляторних пептидів спостерігається в мембрани, що складаються з нейтральних фосфоліпідів, тоді як холестерол і білки знижують активність взаємодії біорегуляторів з мембранним матриксом.
Ефективність пептид-мембранної взаємодії залежить від гідрофільно-гідрофобного балансу пептидної молекули. Високі показники загальної гідрофобності при наявності полярних амінокислотних залишків (Z=0,3-0,8) сприяють активній інкорпорації пептидів в ліпідний матрикс. В той же час, такі ж або вищі показники гідрофобності при відсутності полярних залишків ведуть до істотного зниження активності пептид-мембранної взаємодії. При цьому мембранотропні властивості малих (2-13 амінокислотних залишків) регуляторних пептидів не мають прямої залежності від довжини молекули.
Мембраноактивні регуляторні пептиди, подібно антибактеріальним пептидам, характеризуються зниженним вмістом гідрофільних амінокислот, за виключенням Gly, Arg+ та Gln і підвищенням сумарного вмісту гідрофобних амінокислот. Спектри гідрофобних амінокислотних залишків в РП і в антибактеріальних пептидах характеризуються протилежними тенденціями за вмістом більшості залишків. В регуляторних пептидах, на відміну від антибактеріальних, збільшений вміст залишків, що перешкоджають формуванню б-спіралей. Ці відмінності можуть лежати в основі мембраноселективності і різної дії двох класів пептидів.
Різна гідрофобність енкефалінів, обумовлена єдиним С-кінцевим амінокислотним залишком, веде до різного прояву їх мембранотропної активності (Лей-енкефалін діє переважно в поверхневій зоні мембрани, тоді як молекули Мет-енкефаліну інкорпоруються в її матрикс), що може лежати в основі біологічного механізму вибору підтипу опіатного рецептора.
Пептид-ліпідна взаємодія модулюється вмістом оптичних ізомерів амінокислот в їх молекулах. Встановлена достовірна різниця в пептид-мембранних взаємодіях між різними ізомерними формами дипептиду кіоторфіну і пряма залежність між активністю їх взаємодії з фосфоліпідним матриксом в ряду L-Tyr-L-Arg > D-Tyr-L-Arg ≈ L-Tyr-D-Arg > D-Tyr-D-Arg і анальгетичною активністю цих форм.
Суфан (дикалієва сіль N-сукциніл-триптофану) проявляє мембранотропну активність по відношенню до ліпідних моношарових мембран. L-форма суфану є більш активною у порівнянні з D,L-формою. Провідна роль у виявленні мембранотропних властивостей суфану належить фосфоліпідам. Білки і холестерол знижують інтенсивність інкорпорації суфану, в першу чергу, D,L-форми, що співпадає з результатами клінічних досліджень.
Пептид-мембранні взаємодії різноспрямовано модулюються іонним складом і іонною силою субфази. В ряді Са2+> Mg2 > K+ відбувається пригнічення взаємодії Лей-енкефаліну з полярною зоною фосфоліпідних мембран і активація взаємодії Мет-енкефалінів, що може бути обумовлено різною гідрофобністю двох енкефалінів. Підвищення іонної сили субфази до фізіологічних значень активує пептид-мембранну взаємодію і інкорпорацію меланостину в матрикс фосфоліпідної мембрани.
Гідрофільна гамма-аміномасляна кислота не здатна самостійно проникати в матрикс мембрани, але інтенсивно адсорбується в зоні полярних ліпідних головок. Максимальний ефект спостерігається при дії мікромолярних концентрацій ГАМК. Роль взаємодії ГАМК із ліпідним матриксом обмежується концентруванням препарату на поверхні мембрани, що є важливою умовою ефективної подальшої ліганд-рецепторної взаємодії.
Досліджені мембранотропні властивості ксенобіотиків 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) і N-оксид 2,6-диметилпіридину (івіну). Взаємодія івіну з фосфоліпідними мембранами характеризується швидким проникненням його в гідрофобний матрикс мембрани, тоді як 2,4-Д переважно взаємодіє з полярними групами ліпідів мембран, що пояснюється її аніонними властивостями. Двофазність процесів їх взаємодії з ліпідним матриксом реалізується в параболічній концентраційній залежності їх безрецепторного впливу на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність плазматичних мембран клітин печінки щура.
Встановлена висока мембранотропна активність і охарактеризовані її параметри для ряду фітопрепаратів з радіо- і гепато-протективною дією. Показана залежність змін мембранотропної активності від особливостей отримання фітопрепарату, що може бути застосовано при подальшому пошуку природних мембраностабілізаторів.
Запропоновано схему механізму реалізації ефектів пептидних і інших біорегуляторів за участю ліпідного матриксу мембрани. На першому етапі біорегулятори адсорбуються на мембрані за рахунок електростатичних зв’язків. Наступним етапом є інкорпорація молекули біорегулятора в гідрофобну зону ліпідного матриксу. Набуваючи єдиної конфігурації в гідрофобному оточенні, молекули біорегуляторів ефективно взаємодіють з мембранними рецепторами, утворюють іон-провідні структури, безпосередньо взаємодіють з мембранними білками (АТФазами, G-білками і ін.), можливо є субстратами для утворення внутрімембраних і внутріклітинних месенджерів (наприклад, пептидної природи), локально змінюють фізико-хімічний стан ліпідного матриксу, що приводить до зміни активності мембранних ферментів і переходу мембрани як системи до іншого стаціонарного стану.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Рыбальченко В.К., Островская Г.В. Мембранотропная активность нейрогипофизарных гормонов. – Луганськ, “Елтон-2”. – 1998. – 82 с.
Физиология и биохимия пищеварения человека и животных/ В.К.Рыбальченко, Т.В. Береговая, М.Ю.Клевец, Е.А.Кондратюк, Г.В.Островская, Т.В.Рыбальченко, А.Я.Скляров; Под ред.В.К.Рыбальченко. – К.: Фитосоциоцентр, 2002. – 366 с.
Рыбальченко В.К., Островская Г.В., Рыбальченко В.К. Активная роль липидного матрикса плазматических мембран в реализации эффектов регуляторных пептидов //Тканевые регуляторные пептиды. Теоретические аспекты и перспективы практического применения/ Веснина Л.Э., Гаркович А.Л., Грицай Н.Н. и др.: Под общ.ред. И.П.Кайдашева, В.П.Мищенко, В.К. Рыбальченко. – К.: “Здоров’я”, 2003. – С.309-330.
Могилевич Б.Р., Рыбальченко В.К, Островская Г.В. Теоретический подход к определению мембранотропной активности регуляторных пептидов//Биофизика.– 1995. – Т.40, №1. –С.95-97.
Островская Г.В., Рыбальченко В.К., Порало И.В. Взаимодействие нейротензина с модельными мембранами // Вестн.пробл. биол.и мед. – 1996. – №12. – С.21-26.
Коршак О.Л., Коцюба В.Л., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Вплив мет- і лей-енкефалінів на стимульовану пентагастрином шлункову секрецію // Вісн. Київ. Ун-ту. Ін-т фізіол. – 1996. – Вип.2. – С.53-60.
Островська Г.В., Мельник Ю.М., Рибальченко В.К. Порівняльна характеристика мембранотропної активності мет- і лей-енкефалінів//Вісн.Київ.ун-ту. Пробл. регул. фізіол. функцій. – 1998. – Вип.3. – С.65-69.
Порало І.В., Островська Г.В., Ковальчук Т.О. Поверхнева і мембранотропна активність препаратів суфану різного складу (l- i d,l-суфану)//Вісн.Київ.ун-ту.Пробл.регул.фізіол. функцій.– 1999.– Вип.4.– С.34-38.
Мельник Ю.М., Островська Г.В., Цівінська С.М. Мембранотропна активність оптичних ізомерів кіоторфіну//Вісн.Київ.ун-ту.Пробл.регул.фізіол.функцій. – 1999. – Вип.4. –С.57-60.
Рибальченко В.К., Порало І.В. Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Мельник Ю.М. Мембранотропна активність нейропептиду кіоторфіну та кардіотонічного препарату суфану // Нейрофизиология. 1999. – Т.31, №3. – С.266-269.
Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Характеристика мембранотропних властивостей спиртових настоянок фітопрепаратів//Зб.наук. праць. співр. КМАПО ім. П.Л. Шупика. К., 2000. – Вип.9, Кн.2, – С.189-199.
Рибальченко Т.В., Островська Г.В., Кондратюк Е.А., Мельник Ю.Н., Гурняк О.М., Рибальченко В.К. Безрецепторная межклеточная химическая сигнализация // Нейрофизиология. – 2000. – Т.32, №3. – С.281-282.
Порало І.В., Островська Г.В. Рибальченко В.К. Мембранотропні ефекти неглікозидного кардіотонічного препарату суфан//Доп. НАН України. Біологія. – 2000. – № 4. – С.195-198.
Чекман І., Горчакова Н., Олійник С., Середенко М., Гудивок Я., Барабой В., РибальченкоВ., Островська Г., Порало І., Ніженковська І.. Динаміка перекисного окислення ліпідів в органах щурів при опроміненні та антиоксидантний ефект суфану // Галицьк. лікарськ. вісник. – 2000. – Т.7, №2. – С.85-88.
Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Мембранотропна активність трав’яних зборів з гепатопротекторними властивостями//Гастроентерологія. – 2000. –Вип.31. –С.375-380.
Кучеренко М.Є., Рибальченко Т.В., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Миготлива модель молекулярної організації плазматичної мембрани//Доп.НАН України. Біологія. – 2001. – №7. – С.149-152
Островська Г.В., Поканевич В.В., Гарник Т.П., Філінська О.М., Рибальченко В.К. Мембранотропна активність фітопрепарату Поліфітол-1//Вісн.Київськ.ун-ту. Пробл. регул. фізіол. ф-цій. – 2001. – Вип.7. – С.41-44.
Островська Г.В., Поканевич В.В. Гарник Т.П. Рибальченко В.К. Характеристика мембранотропних властивостей спиртових екстрактів фітопрепаратів//Доп. НАН України. Біологія. – 2001. – №8. – С.152-156.
Ostrovska G., Rybalchenko V., Rybalchenko T., Filinska O. Decrease of hepatotoxic effect of herbicide 2,4-D by plant growth regulator ivin//Ann.Universitatis Mariae Curie-Skіodowska Lublin-Polonia – 2002. – Vol.XV. – N36. – P.425-428.
Рибальченко В.К., Островська Г.В., Рибальченко Т.В. Мембранотропні ефекти біорегуляторів: 1. Ендогенні пептиди//Фітотерапія. – 2002. – № 1-2. – С.53-59.
Островська Г.В., Яблонська С.В., Філінська О.М., Рибальченко Т.В., Бабіч Л.В. Гепатотоксичні ефекти тривалого інтрагастрального введення щурам 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти й регулятора росту рослин івіну//Вісн.Київськ.ун-ту.Пробл.регул.фізіол.ф-цій. – 2004. –Вип.9. – С.56-57.
Нова методика добору співвідношення компонентів фітозборів на основі їх мембранотропних властивостей Реєстр. № 249/19/03 /Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К., Рибальченко Т.В./Реєстр галузевих нововведень МОЗ України. –К., 2003. –Вип.18-19. –С.174-1 75.
Рибальченко В.К., Островська Г.В., Могилевич Б.Р., Демченко І.Б. Використання модельних мембран у дослідженнях ефектів біологічно активних речовин//II наук.-практ.конф.з народ. та нетрад. мед. – К., 1996. – С.55-56.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Порало І.В., Мельник Ю.М. Мембранотропні властивості бальзаму “Поліфітол-1”//ІІІ наук.-практ.конф.з нетрад.медиц. – К., 1997.- С.60-61.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Мельник Ю.М. Вплив іонів металів і іонної сили електроліту на мембранотропні властивості мет- і лей-енкефалінів //VII Укр.біохім. з’їзд. К., 1997.– Ч.1. – С.48.
Островська Г.В., Рибальченко В.К. Характеристика мембранотропних властивостей бальзаму “Поліфітол-1”//”Поліфітол-1”. – К.: КМІ УАНМ, 1998. – С.8-12.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Мельник Ю.М., Порало І.В., Рибальченко Т.В. Роль оптичної ізомерії в мембранотропній активності кіоторфіну// XV з’їзд Укр. фізіол.т-ва. - Київ, 1998. / Фізіолог.журн. – 1998. – Т.44, №3. – С.11.
Рибальченко В.К., Островська Г.В., Могилевич Б.Р., Ковальчук Т.О., Порало І.В., Цівінська С.М., Рибальченко Т.В. Коцюба В.Л., Кондратюк О.А., Мельник Ю.М., Савчук О.М., Бичко А.В. Роль мембранних ліпідів в міжклітинній хімічній сигналізіції // ІI з’їзд Укр. біофіз.тов-ва. – Харків, 1998. – С.90.
Горчакова Н.О., Рибальченко В.К., Островська Г.В, Олійник С.А., Ніженковська І.В. Поверхнева та мембранотропна активність препаратів суфану різного складу (l- i d,l-суфану) // ІI з’їзд Укр. біофіз.тов-ва. – Харків, 1998. – С.107.
Островская Г.В., Рыбальченко В.К. Физико-химические особенности пептидной молекулы определяют мембранотропные свойства биорегулятора //XVI Менделеевский съезд по общ. и прикл. химии. – С.-Пб., 1998. – С.105.
Рыбальченко В.К., Островская Г.В. Липидный путь химической межклеточной сигнализации//XVI Менделеевский съезд по общ. и прикл. химии. – С.-Пб., 1998. – С.124.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Порало І.В. Мембранотропна активність спиртового екстракту кореневища лепехи звичайної (Acorus calamus)//IV Міжнар.конф. “Інформо-терапія:теор.асп. і практ.застосув.” К., 1998 / Інформ.та негентр.мед. – 1998. – Вип.1. – С.24.
Рибальченко В.К., Островська Г.В., Могилевич Б.Р., Ковальчук Т.О., Рибальченко Т.В., Порало І.В., Цівінська С.М., Бичко А.В. Інформаційні аспекти взаємодії регуляторних пептидів з мембранами// IV Міжнар.конф. “Інформотерапія:теор.асп. і практ.застосув.” К., 1998 / Інформ.та негентр.мед. – 1998. – Вип.1. – С.28.
Островська Г.В., Порало І.В., Ковальчук Т.О., Ніженковська І.В., Рибальченко В.К. Первинні механізми взаємодії кардіотонічного препарату суфану з мембранами // V Міжнар.конф. “Інформотерапія: теор.асп. і практ.застосув.” К., 1999 / Інформ.та негентр. мед. – 1999. – Вип.1. – С.74-75.
Рибальченко В.К., Островська Г.В., Рибальченко Т.В. Роль липидов в рецепции химических информационных сигналов // V Міжнар.конф.“Інформотерапія: теор. асп. і практ.застосув.” К., 1999 / Інформ.та негентр.мед. – 1999. – Вип.1. – С.78-79
Порало И.В., Островская Г.В., Рыбальченко В.К. Мембранотропные эффекты негликозидного кардиотонического препарата суфан// Всерос.науч.конф. с муждунар. участием, посв.150-летия со дня рожд. И.П. Павлова. – С.-Пб., 1999. – С.245.
Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К., Поканевич В.В. Вивчення механізму дії засобів рослинного походження щодо корекції функціонального стану гепатобіліарної та гастродуоденальної системи//V з’їзд фармац.України. – Харків, 1999. – С.113.
Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К., Поканевич В.В. Гепатопротекторна дія препаратів ехінацеї пурпурової (Echinacea purpurea) у відновно-реабілітаційній терапії хворих різних вікових груп //ІІІ Нац.Конгр. геронтологів і геріатрів Укр.– К., 2000. – С.31.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Боровикова Г.С., Пономаренко С.П., Рибальченко Т.В. Взаємодія регулятора росту рослин Івіну з модельними фосфоліпідними мембранами// І з’їзд токсикологів України. –К., 2001. – С.62.
Харчук І.В., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Мембранотропні, цитолого-гістологічні та біохімічні ефекти кардіотонічного засобу суфану - похідної сполуки бурштинової кислоти //Всеукр. Наук.конф. “Актуальні пробл. гастроентерології” – Київ, 2001. – С.55.
Островська Г.В., Решетнік Є.М, Долгова О.М., Рибальченко Т.В Фізіологічна і мембранотропна активність природних енкефалінів і пептиду љ-77 – їх синтетичного аналогу// ІІІ з’їзд Укр.біофіз.т-ва. – Львів, 2002. – С.80.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Яблонська С.В., Філінська О.M. Дослідження механізмів сумісної дії гербіциду 2,4-Д і регулятора росту рослин івіну //ІІІ з’їзд Укр.біофіз.т-ва. – Львів, 2002. – С.118.
Островская Г.В., Бычко А.В., Карпезо Н.О., Мацюх О.С., Рыбальченко В.К., Сютикова О.В. Взаимодействие ивина с липидными мембранами и базисные механизмы реализации биологической активности препарата// ІХ Міжнар.конф. “Інформотерапія: теор.асп.і практ.застосув.” К., 2003 / Інф.та негентр. мед. – 2003. – Вип.1. – С.81-82.
Яблонська С., Островська Г., Рибальченко Т., Філінська О. Порівняльний аналіз впливу гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти на дві форми Mg2+, Ca2+-АТФазної активності плазматичної мембрани гепатоцитів щурів// Міжнар. Наук-практ.конф. студ., асп. та молод. вчених “Шевченківська весна”, присв.190-річчю з дня народж.Т.Шевченка та 170-річчю заснування Київського ун-ту. – Київ, 2004. Вип.ІІ. . – С. 39-40.
Яблонська С., Островська Г., Рибальченко Т., Зеленюк В., Філінська О. Вплив неорганічних іонів на взаємодію енкефалінів з ліпідними мембранами// Міжнар. Наук-практ.конф. студ., асп. та молод. вчених “Шевченківська весна”, присв.190-річчю з дня народж.Т.Шевченка та 170-річчю заснуванняКиївського ун-ту. – Київ, 2004. Вип.ІІ.– С. 42-43.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Рибальченко Т.В. Особливості взаємодії пентагастрину з ліпідним матриксом мембран // Міжнар.наук.конференція “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”, приуроч. до 80-ліття з дня народж. проф. І.В.Шостаковської. – Львів, 2004. – С.57-58.
Яблонська С.В., Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Зеленюк В.О., Філінська О.М., Рибальченко В.К. Порівняння ефектів гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та регулятора росту рослин івіну на дві форми Mg2+, Ca2+-АТФазної активності плазматичних мембран гепатоцитів щурів//ІІ з’їзд токсикологів Укр. – К., 2004. – С.72-73.
АНОТАЦІЇ
Островська Г.В. Первинні механізми мембраномодулюючої дії біорегуляторів природного і синтетичного походження. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2004.
Дисертація присвячена з’ясуванню первинних механізмів мембраномодулюючої дії біорегуляторів природного і синтетичного походження і активної ролі ліпідного матриксу мембран в цих процесах. Досліджено особливості взаємодії бірегуляторів з модельними ліпідними і ліпопротеїновими мембранами різного складу. Показано, що досліджені речовини з різною ефективністю здатні взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран без попереднього залучення специфічних білкових рецепторів. Ефективність цих процесів залежить від електростатичних і гідрофобних взаємодій. Пептид-ліпідна взаємодія модулюється вмістом оптичних ізомерів амінокислотних залишків в їх молекулах, іонним складом і іонною силою субфази. Не виявлено прямої залежності мембранотропних властивостей регуляторних пептидів від довжини молекули. Пояснюється роль ліпідної фази у виборі підтипу рецептора при взаємодії пептидів з мембраною. Провідна роль в прояві мембранотропних властивостей досліджених біорегуляторів належить фосфоліпідам, тоді як білки і холестерол знижують інтенсивність їх інкорпорації. Встановлена висока мембранотропна активність і охарактеризовані її параметри для ряду фітопрепаратів з радіо- і гепато-протективною дією. Показана залежність змін цієї активності від особливостей отримання фітопрепарату, що може застосовуватись при подальшому пошуку природних мембраностабілізаторів. Запропоновано схему механізму реалізації ефектів пептидних і інших біорегуляторів за участю ліпідного матрикса мембрани.
Ключові слова: Регуляторні пептиди, ліпідний матрикс, мембранотропність, безрецепторні ефекти, модельні мембрани, плазматичні мембрани, похідні амінокислот, фітопрепарати, ксенобіотики.
Островская Г.В. Первичные механизмы мембраномодулирующего действия биорегуляторов природного и синтетического происхождения. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2004.
Диссертация посвящена выяснению первичных механизмов мембраномодулирующего действия биорегуляторов и активной роли липидного матрикса мембран в этих процессах. Изучены особенности взаимодействия ряда регуляторных пептидов (киоторфин и его оптические изомеры, тиролиберин, меланостатин, пентагастрин, Мет- і Лей-енкефалины, их синтетический аналог S-77, нейротензин), производных аминокислот (гамма-аминомасляная кислота и дикалиевая соль N-сукцинил-триптофана – суфан), ксенобиотиков (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и N-оксид диметил-пиридина) и фитопрепаратов с модельными мембранами. Показано, что исследованные вещества в различной степени способны взаимодействовать с липидным матриксом мембран без вовлечения специфических белковых рецепторов. Мембранотропные регуляторные пептиды (РП) характеризуются сниженным содержанием гидрофильных аминокислотных остатков, за исключением Gly, Arg и Gln, и повышеннием суммарного содержания гидрофобных остатков по сравнениею со средними значениями в белках эукаритов. В спектре гидрофобных аминокислотных остатков в РП отмечаются противоположные тенденции по сравнению с мембраноактивными антибактериальными пептидами, что может лежать в основе мембраноселективности и разного действия двух классов пептидов. Связывание эндогенных биорегуляторов с мембранами зависит как от электростатических, так и от гидрофобных взаимодействий с липидным матриксом и модулируется ионным составом и ионной силой субфазы. Более эффективно РП встраиваются в нейтрально заряженные мембраны. Однако, при взаимодействии с кислыми липидами значительно снижается минимальная действующая концентрация биорегуляторов. Эффективность пептид-мембранного взаимодействия зависит от гидрофильно-гидрофобного баланса пептидной молекулы. Высокие показатели общей гидрофобности при наличии полярных аминокислотных остатков способствуют активной инкорпорации пептидов в липидный матрикс. Однако, такие же или высшие показатели гидрофобности при отсутствии полярных остатков ведут к снижению активности или полной инактивации пептид-мембранного взаимодействия. Наличие холестерола и белков в составе мембран снижают эффективность взаимодействия биорегуляторов с мембранным матриксом. На примере энкефалинов показана возможная роль липидной фазы в выборе подтипа рецептора этими биорегуляторами. Пептид-липидные взаимодействия модулируются содержанием оптических изомеров аминокислот в их молекулах. Установлено достоверное различие во взаимодействиях изомерных форм дипептида киоторфина с фосфолипидным матриксом, соответствующее различию в их анальгетической активности. Суфан также проявляет мембранотропную активность по отношению к липидным монослойным мембранам, при этом L-форма суфана более активна по сравнению с D,L-формой. Ведущая роль в проявлении мембранотропных свойств суфана принадлежит фосфолипидам, тогда как белки и холестерол снижают интенсивность его инкорпорации, в первую очередь, D,L-формы, что совпадает с результатами клинических исследований. Гидрофильная гамма-аминомасляная кислота, не проникая в матрикс мембраны, интенсивно адсорбируется в зоне полярных липидных головок, с максимальным эффектом при микромолярных концентрациях. Роль взаимодействия ГАМК с липидным матриксом ограничивается концентрированием препарата на поверхности мембраны, что является важным условием дальнейшего эффективного лиганд-рецепторного взаимодействия. Исследованы мембранотропные свойства гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и регулятора роста растений ивина (N-оксид 2,6-диметилпиридина). Показано, что взаимодействие ивина с фосфолипидными мембранами характеризуется его быстрым проникновением в гидрофобный матрикс. Процесс активируется с увеличением плотности упаковки в мембране и имеет тенденцию к двуфазности. 2,4-Д взаимодействует преимущественно с полярными группами мембранных липидов. Оба препарата оказывают двухфазное влияние на АТФазные активности ПМ клеток печени. Установлена высокая мембранотропная активность и охарактеризованы ее параметры для ряда фитопрепаратов с гепатопротективным действием. Показана ее зависимость от особенностей получения фитопрепарата, что может применяться при дальнейшем поиске природных мембраностабилизаторов. Предложена схема механизма реализации эффектов пептидных и других биорегуляторов при участии липидного матрикса мембраны. На первом этапе биорегуляторы адсорбируются на мембране за счет электростатических взаимодействий. Следующим этапом является инкорпорация молекулы биорегулятора в гидрофобную зону липидного матрикса. Приобретая единую конформацию в гидрофобном окружении, молекулы биорегуляторов эффективно взаимодействуют с мембранными рецепторами и другими мембранными белками, образуют ион-проводящие структуры, возможно, служат субстратами для образования внутримембранних и внутриклеточных мессенджеров (например, пептидной природы), локально изменяют физико-химическое состояние липидного матрикса, что ведет к изменению активности мембранных ферментов и переходу мембраны как системы к другому стационарному состоянию.
Ключевые слова: Регуляторные пептиды, липидный матрикс, мембранотропность, безрецепторные эффекты, модельные мембраны, плазматические мембраны, производные аминокислот, фитопрепараты, ксенобиотики.
Ostrovska G.V. Primary mechanisms of membrane modulating action of bioregulators of nature and synthetic origine. – Manuscript.
Dissertation for scientific degree of doctor the biological sciences 03.00.02 – biophysics. – Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2004.
The thesis is devoted to finding-out of primary mechanisms of membrane modulating action of natural and synthetic bioregulators and to active role of a membrane lipide matrix in these processes. The features of interaction of bioregulators with model lipide and lipoprotein membranes of different composition are investigated. It was displaied, that the studied substances are capable to interact with a lipide matrix of membranes with different efficiency without precursor involving of specific protein receptors. The efficiency of these processes depends on electrostatic and hydrophobic interpaсtions. The peptide-lipide interactions are modulated by the contents of optical isomers of aminoacidic residues in their moleculas, by ionic composition and ionic strength of a subphase. It is not revealed direct relation of membrane-tropic properties of the regulator peptides from length of their molecula. The role of a lipide phase in selection of a subtype of a receptor at peptide-membrane interaction is explained. The leading role in a display of membrane tropic properties of investigated bioregulators belongs to the phospholipids, whereas the proteins and cholesterol reduce intensity of their incorporation. The high membrane-tropic activity for a series of hepatoprotective phytomedicine is established and its parameters are described. The relation of changes of this activity to features of phytomedicine obtaining is displayed. It can be applied by further search of natural membrane stabilizers. It is offered the scheme of the mechanism of realization of bioregulators effects with assistance of membrane lipide matrix.
Keywords: Regulator peptides, lipide matrix, membrane tropic activity, unreceptor effects, model membrane, plasma membrane, amino acid derivates, phytomedicine, xenobiotics.
|
