Пригнічення IDR може вносити вклад у нейропротекторні властивості німодипіна. Німодипін має нейропротекторні властивості в багатьох моделях патологічних станів ЦНС. Він значно підвищує кількість життєздатних клітин в умовах лабораторної гіпоксії/гіпоглікемії, тривалого впливу агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот, або b- амілоідного білку, основного компонента синільних бляшок при хворобі Альцгеймера (Nuglisch et al., 1990; Welsch et al., 1990; Danks et al., 1992; Weiss et al., 1994; Stuiver et al., 1996; Gepdiremen et al., 1997; Ueda et al., 1997; Kawaguchi et al., 1999). Для досягнення нейропротекторного ефекту в моделях ішемії німодипін береться в концентраціях, що досягають десятків і навіть сотень мікромолей. Як було показано в цій роботі, 2 мкМ німодипіну повинні пригнітити IDR наполовину в його пізній фазі. Отже, нейропротекторна дія німодипіна може бути обумовлена (крім блокування кальцієвого струму L- типу) його дією на калієвий струм затриманого випрямлення. Як і BIIA388Cl, в результаті блокування калієвого струму німодипін може перешкоджати депресії, що поширюється, а також загибелі клітин у результаті апоптоза. На користь цієї гіпотези говорить той факт, що блокатор кальцієвого струму L- типу ніфедипін, що володіє значно меншою спорідненістю до калієвих каналів затриманого випрямлення, майже не виявляє нейропротекторних властивостей.
ВИСНОВКИ
1. Гіперактивація потенціал- керованих калієвих каналів затриманого випрямлення відбувається при різних патологічних станах ЦНС і може призводити до ушкодження клітин нервової тканини. Селективне блокування цих каналів може мати нейропротекторну дію при інсультах і нейродегенеративних процесах. На даний час відомо надзвичайно мало високоафінних селективних блокаторів калієвих каналів затриманого випрямлення, які придатні до використовування у фармакології. У цій роботі за допомогою методу петч- кламп у конфігурації “ціла клітина” показано, що сполука BIIA388Cl, що має нейропротекторні властивості, селективно блокує калієвий струм затриманого випрямлення в мембрані пірамідних нейронів гіпокампу щура.
2. При збільшенні концентрації BIIA388Cl у позаклітинному розчині пікова амплітуда IDR зменшується, причому зростає швидкість спаду струму. Константа половинного блокування струму (IC50) на піку складає 300 ± 30 nМ, а на 300-ій мсек після початку деполяризації мембрани зменшується до 120 ± 20 nМ. Сполука зсуває криву стаціонарної інактивації у бік більш негативних потенціалів і уповільнює вихід каналів із інактивованого стана.
3. Отримані експериментальні дані дозволяють припустити, що BIIA388Cl зв'язується із каналом у відкритому і інактивованому станах, у той час, як закритий стан каналу затриманого випрямлення має низьку спорідненість до сполуки. Після зняття деполяризації на мембрані, молекула BIIA388Cl швидко роз'єднується із каналом, що не дозволяє сполуці розвити класичний феномен “use-dependence”.
4. Підвищення позаклітинної концентрації калію не впливає на спорідненість BIIA388Cl до каналу затриманого випрямлення. Вхідний і вихідний калієві потоки, що течуть через канал, блокуються BIIA388Cl в однаковій мірі, що свідчить про алостеричне приєднання молекули сполуки до каналу.
5. BIIA388Cl має низьку спорідненість до калієвих каналів А- типу, він пригнічує калієвий струм А- типу із константою IC50 = 40 мкМ.
6. Блокатори кальцієвих струмів L-типу німодипін і ніфедипін пригнічують калієвий струм затриманого випрямлення в мембрані пірамідних нейронів гіпокампу щура. Німодипін і ніфедипін пригнічують пізню фазу калієвого струму затриманого випрямлення сильніше, ніж його пік, викликаючи прискорення кінетики спаду струму. Константи IC50 для німодипіна і ніфедипіна складають відповідно 2.0 ± 0.2 мкМ і 44 ± 1 мкМ. Встановлена різниця в спорідненості німодипіна і ніфедипіна до калієвих каналів затриманого випрямлення може пояснювати той факт, що перший має більш виражені нейропротекторні властивості в різних моделях ішемії. Пригнічення німодипіном калієвого струму затриманого випрямлення може вносити вклад у нейропротекторну дію німодипіна і повинне враховуватися при розробці препаратів на його основі.
Список опублікованих праць здобувача за темою дисертації.
1. Kirichok Yu., Nikolaev A.V. and Krishtal O.A. [K+] out accelerates inactivation of Shal-channels responsible for A-current in rat CA1 neurons // NeuroReport - 1998. - V. 31 - P. 625-629.
2. Ніколаєв А.В., Кірічок Ю.В., Островська О. І., Малетіна І.І., Петко К.І., Ягупольський Л.М. Пригнічення калієвого струму А-типу в пірамідних нейронах гіпокампу щурів пінациділом і його фторпохідними // Нейрофізіологія. - 1999. - Т. 31, № 3. - С. 232-235.
3. Киричек Ю.В., Бойчук Я.А., Копаница М.В., Цинцадзе Т.Ш., Лозовая Н.А., Кришталь О.А. Действие мибефрадила на синаптическую передачу в гипокампе и на потенциалзависимые токи в изолированных нейронах гиппокампа и таламуса крыс // Нейрофізіологія. - 2000. - Т. 32, № 1. - С. 16-21.
4. Kirichok Yu., Lozovaya N. and Krishtal O. Time and voltage-dependent block of the delayed rectifier K+ current in hippocampal pyramidal neurons by therapeutic concentration of nimodipine // Fifth IBRO World Congress of Neuroscience. - 1999 -Jerusalem, Israel, July 11-15 - P. 191.
6. Krishtal O., Kirichok Yu., Tsintsadze T., Lozovaya N., Loesel W. and Arndts D. New channel blocker BIIA388Cl blocks delayed rectifier, but not A-type potassium current in central neurons. // Society for Neuroscience. - 1999 - 29th annual meeting, Miami Beach, October 23-28 - V. 25, part 1 - 213.12 .
7. Kirichok Yu., Krishtal O., Tsintsadze T., Lozovaya N., Loesel W. and Arndts D. (2000). A novel neuroprotective drug selectively blocks delayed rectifier potassium channels in hippocampal pyramidal neurons // Keystone Symposia “Potassium Channels: Structure, Function and Therapeutic Utilities” - 2000 - Granlibakken Resort, Tahoe City, California, March 11-16.
Кірічок Ю.В. Нові фармакологічні впливи на калієві канали у пірамідних нейронах гіпокампу: селективна блокада каналів затриманого випрямлення. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02. - біофізика. Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 2000.
Досліджено дію нової сполуки BIIA388Cl, а також німодипіну і ніфедипіну на К+- канали в ізольованих нейронах гіпокампу щура. З використанням методу петч- кламп у конфігурації “ціла клітина” було показано, що BIIA388Cl сильно пригнічує калієвий струм затриманого випрямлення IDR (IC50=120 nМ), у той час як швидкий калієвий струм IA має низьку чутливість до цієї сполуки (IC50 = 40mМ.). При збільшенні концентрації BIIA388Cl у позаклітинному розчині пікова амплітуда IDR зменшується і зростає швидкість спаду струму. Сполука зсуває криву стаціонарної інактивації у бік більш негативних потенціалів і уповільнює вихід каналів з інактивованого стана. Ймовірно, BIIA388Cl зв'язується із каналом у відкритому і інактивованому станах, у той час як закритий стан каналу затриманого випрямлення має низьку спорідненість до сполуки. Таким чином, BIIA388Cl є ефективним і селективним блокатором калієвого струму IDR- типу, який в основному обумовлює втрату внутрішньоклітинного калію деполяризованими нейронами. Селективне блокування IDR може мати нейропротекторну дію.
Німодипін і ніфедипін, як і BIIA388Cl, пригнічують пік IDR слабкіше, ніж його пізню фазу, викликаючи прискорення кінетики спаду струму. IC50 для німодипіну і ніфедипіну складають відповідно 2.0 ± 0.2 mМ і 44 ± 1 mМ. Ефективне блокування німодипіном IDR може вносити вклад у нейропротекторну дію німодипіна і повинне враховуватися при розробці препаратів на його основі.
Ключові слова: нейрони гіпокампу, BIIA388Cl, німодипін, ніфедипін, петч-кламп, калієвий струм затриманого випрямлення, блокатор каналу, нейропротекція.
Киричёк Ю.В. Новые фармакологические воздействия на калиевые каналы в пирамидных нейронах гиппокампа: селективная блокада каналов задержанного выпрямления. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02. - биофизика. Институт физиологии им. А.А .Богомольца НАН Украины, Киев, 2000.
Исследовано действие нового соединения BIIA388Cl, а также нимодипина и нифедипина на К+- каналы в изолированных нейронах гиппокампа крысы. С использованием метода пэтч-кламп в конфигурации “целая клетка” было показано, что BIIA388Cl сильно подавляет калиевый ток задержанного выпрямления IDR (IC50=120 nМ), в то время как быстрый калиевый ток IA обладает низкой чувствительностью к веществу (IC50 = 40 mМ.). При увеличении концентрации BIIA388Cl во внеклеточном растворе пиковая амплитуда IDR уменьшается и возрастает скорость спада тока. Вещество сдвигает кривую стационарной инактивации в сторону более отрицательных потенциалов и замедляет выход каналов из инактивированного состояния. BIIA388Cl, вероятно, связывается с каналом в открытом и инактивированном состояниях, в то время как закрытое состояние канала задержанного выпрямления имеет низкое сродство к веществу. Таким образом, BIIA388Cl является эффективным и селективным блокатором калиевого тока IDR- типа, который в основном обуславливает потерю внутриклеточного калия деполяризованными нейронами. Селективное блокирование IDR может обладать нейропротекторным действием.
Нимодипин и нифедипин как и BIIA388Cl подавляют пик IDR слабее, нежели его позднюю фазу, вызывая ускорение кинетики спада тока. IC50 для нимодипина и нифедипина составляют соответственно 2.0 ± 0.2 mМ и 44 ± 1 mМ. Эффективное подавление нимодипином IDR может вносить вклад в нейропротекторное действие нимодипина и должно учитываться при разработке препаратов на его основе.
Ключевые слова: нейроны гиппокампа, BIIA388Cl, нимодипин, нифедипин, петч-кламп, калиевый ток задержанного выпрямления, блокатор канала, нейропротекция.
Kirichok Yu.V. New pharmacological effects on potassium channel in hippocampal pyramidal neurons: selective blockage of delayed rectifier channels. -Manuscript.
Thesis for candidate’s degree by specialty 03.00.02. - biophysics. Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.
A new substance (R,S)-(3,4-Dihydro-6,7-dimethoxyisoquinoline-1-yl)-2-cyclohexyl-N-(3,3-diphenylpropyl)-acetamide hydrochloride (BIIA388Cl), which demonstrates neuroprotective properties in animal models, was examined for its action on K+ currents in acutely isolated rat hippocampal neurons using the patch-clamp/concentration clamp techniques in the whole-cell configuration. The delayed rectifier K+-current (IDR) was strongly inhibited by externally applied BIIA388Cl, while the transient A-current (IA) remained virtually unaffected. Block of IDR by the pre-applied BIIA388Cl was revealed as rapid decay of the current indicating direct interaction of the drug with the open state of the channel. The removal of the block upon repolarization was also rapid (t = 22 ms). Comparatively high rate of unbinding upon repolarization does not allow the substance to exhibit the “classical” phenomenology of use-dependence. The dose-response relationship for the blocking action of BIIA388Cl revealed the IC50 value of 300 nM for the peak IDR , whereas the IC50 value for IDR measured in 300 ms after the onset of depolarization was 120 nM. The blocking action of BIIA388Cl on IA was at least 200 times less potent (IC50 = 40mМ). In the majority of cells the inhibition of IDR by BIIA388Cl was not voltage-dependent. However, the drug appears to have complex action: definite voltage dependence (the lower depolarization the lower the block) was found in 3 cells out of 11. Tentatively, these exclusions could be accounted for by different action of the substance on different subpopulations of IDR channels in hippocampal pyramidal neurons. BIIA388Cl produced negative shift of the IDR steady-state inactivation curve and substantially slowed down the recovery from inactivation. The blocking ability of BIIA388Cl was not altered when the concentration of external potassium ions was elevated from 5mM to 130mM. Moreover the substance equally inhibited inward and outward potassium ion flows through IDR channels. These results suggest allosteric binding of BIIA388Cl to the delayed rectifier potassium channel.
These data allow to conclude that BIIA388Cl is an effective and selective IDR blocker which preferentially binds to activated and inactivated IDR channel. Leaving IA unaffected, the substance does not increase the duration of the field action potential in the hippocampal slices. Thus, it is capable of blocking the persistent K+-conductance of depolarized neurons without causing measurable effects on the normally functioning neuronal circuits. IDR is the main pathway for the loss of intracellular potassium by depolarized neurons. Selective obstruction of this pathway by BIIA388Cl may be useful for the neuroprotection during ischemia and Alzheimer disease.
We also demonstrated that nimodipine and nifedipine, which are known as the blockers of L-type calcium channels, suppress IDR in hippocampal pyramidal neurons. These substances, like BIIA388Cl, decrease peak amplitude of IDR and speed up decay of the current. The dose-response relationships for the blocking actions of nimodipine and nifedipine revealed the IC50 values of 2.0 ± 0.2 mМ и 44 ± 1 mМ correspondingly. Effective suppression of IDR by nimodipine may contribute to the neuroprotective ability of nimodipine and may account for the fact that nimodipine has more pronounced neuroprotective ability than nifedipine.
Keywords: hippocampal neurons, BIIA388Cl, nimodipine, nifedipine, patch-clamp, delayed rectifier potassium current, channel blocker, neuroprotection.
| 
