ВИСНОВКИ
Методом МД проведено систематичне вивчення впливу дистальних мутацій протеази ВІЛ-1 на її конформаційну рухливість і проведено порівняння з нативним ферментом. Показано, що механізми впливу дистальних мутацій на просторову структуру та МД протеази ВІЛ-1 можна поділити на стабілізуючі (мутанти Leu10Ile та Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu) та дестабілізуючі (мутант Leu90Met).
1. Вперше обґрунтовано і доведено, що конформаційна стабільність димеру протеази ВІЛ-1 критично залежить від стану протонування каталітичної діади Asp25/Аsp25’.
2. Розроблено та застосовано універсальний алгоритм розрахунку параметра впорядкування амідних зв’язків пептидних груп, S2, з даних МД для порівняльного аналізу з експериментальними даними ЯМР. Проведений порівняльний аналіз свідчить про кореляцію даних МД та експериментальних даних ЯМР для протеази ВІЛ-1.
3. Виявлено існування двох механізмів впливу дистальних мутацій амінокислотних залишків на зміну конформаційної рухливості протеази ВІЛ-1 – через перерозподіл амплітуди узгоджених рухів та через зміну доступних конформаційних рухів. Одночасне співіснування цих двох механізмів пояснює роль дистальних мутацій у профілі резистентності до інгібіторів протеази ВІЛ-1.
4. Розроблено універсальний алгоритм порівняння колективних конформаційних рухів двох білків шляхом побудови карт різниць динамічних крос-кореляційних матриць (КР-ДККМ), які ґрунтуються на розрахунках їхньої МД.
5. Отримані методом МД дані про вплив дистальних мутацій на просторову структуру та динаміку протеази ВІЛ-1 можуть бути використані для розробки інгібіторів протеази ВІЛ-1 нового покоління, активних як до нативної протеази, так і до мутантів, резистентних до інгібіторів.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Ковальский Д.Б., Корнелюк А.И. Конформационные изменения ВИЧ-1 протеазы в области „флэпов”: изучение методом молекулярной динамики в пико- и наносекундном временных интервалах// Біополімери і клітина.— 2002. – Т.18, № 2.— С.117-123.
Особистий внесок здобувача – автором проведено вибір та підготовку структури протеази ВІЛ-1 для розрахунку МД. Підбір параметрів МД у вакуумі, проведення розрахунків МД, аналіз результатів.
2. Ковальский Д.Б., Каниболоцкий Д.С., Дубина В.Н., Корнелюк А.И. Конформационные изменения ВИЧ-1 протеиназы: влияние протонированности активного центра на конформацию ВИЧ-1 протеиназы в воде// Український біохімічний журнал. – 2002. – Т.74, № 6. – С. 100-103.
Особистий внесок здобувача – підготовка системи до розрахунку (конвертація, мінімізація енергії системи сольватація, проведення МД для врівноваження ВІЛ-1 у водному розчині), проведення розрахунку МД, аналіз даних.
3. Ковальский Д.Б., Иванова О. С., Дубина В. Н., Каниболоцкий Д. С., Корнелюк А. И. Обобщенный параметр упорядочения S2 для связи N-H пептидной группы как мера конформационной подвижности белка: сравнение алгоритмов расчета S2 из данных симуляции молекулярной динамики// Український біохімічний журнал. – 2004. – Т.76, № 2. – С. 128-132.
Особистий внесок здобувача – підготовка системи до розрахунку та проведення розрахунку МД, планування програми по розрахунку S2, порівняння даних МД з даними ЯМР.
4. Ковальский Д.Б., Дубина В. Н., Корнелюк А. И. Исследование влияния консервативной мутации Leu10Ile на внутримолекулярную подвижность ВИЧ-1 протеазы методом молекулярной динамики// Біополімери і клітина.— 2004. – Т.20, № 4.— С. 321-324.
Особистий внесок здобувача – підготовка системи до розрахунку та проведення розрахунку МД, моделювання мутантів, розробка карт різниць, аналіз даних.
5. Kovalskyy D.B., Dubyna V.М., Mark A.E., Kornelyuk A.I. A molecular dynamics study of the structural stability of HIV-1 protease under physiological conditions: The role of Na+ ions in stabilizing the active site// Proteins. – 2005. – Vol. 58, №2. – P. 450-458.
Особистий внесок здобувача – підготовка системи до розрахунку та проведення розрахунку МД, проведення розрахунків методом ab initio, розрахунок параметра S2, порівняння МД при нейтральному та слабокислому рН.
6. Kovalskyy D.B., Kornelyuk A.I. Molecular dynamic simulation of HIV-1 protease and its drug resistant mutants// Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Abstract book. – Kyiv (Ukraine). – 2001. – P. 48.
Особистий внесок здобувача – автором проведено вибір та підготовку структури протеази ВІЛ-1 та відповідних мутантів для розрахунку МД. Підбір параметрів МД у розчині, проведення розрахунків МД, аналіз результатів.
7. Ковальський Д.Б., Дубина В.М., Каніболотський Д. С., Корнелюк О.І. Комп’ютерне моделювання конформаційних станів протеази вірусу імунодефіциту людини методом молекулярної динаміки// Тези доповідей ІІІ з’їзду Українського біофізичного товариства. – Львів (Україна). – 2002. – C. 167.
Особистий внесок здобувача – підготовка системи до розрахунку та проведення розрахунку МД, аналіз корельованих рухів протеази ВІЛ-1.
8. Kovalskyy D.B., Dubyna V.М., Mark A.E. and Kornelyuk A.I. A molecular dynamics study of the effect of distal drug resistant mutations on HIV-1 protease dynamics// Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Abstract book. – Kyiv (Ukraine). – 2003. – P. 88.
Особистий внесок здобувача – все планування та проведення розрахунку МД, моделювання мутантів, порівняння корельованих рухів мутантів з нативною протеазою.
9. Ковальський Д.Б., Дубина В.М., Корнелюк О.І. Вивчення впливу дистальних мутацій Leu10Ile/Leu90Met та Ala71Val/Gly3Ser/Leu93Ile на конформаційну рухливість ВІЛ-1 протеази методом молекулярної динаміки// Тези доповідей І Української наукової конференції „Проблеми біологічної та медичної фізики” ПБМФ-2004. – Харків (Україна). – 2004. – С. 79.
Особистий внесок здобувача – все планування та проведення розрахунку МД, моделювання мутантів, аналіз змін конформаційного простору узгоджених рухів до і після мутацій.
10. Dubyna V.М., Kovalskyy D.B., Ivanova O.S. and Kornelyuk A.I. The improvement of the algorithm for S2 order parameter calculation from molecular dynamics simulation using the correlation motion function// The 5th International Conference on Biological Physics (ICBP-2004), Abstract book.-Gothenburg (Sweden). – 2004. – P. 141.
Особистий внесок здобувача – проведення розрахунку МД, корекція методики розрахунку S2.
АНОТАЦІЯ
Ковальський Д.Б. Вплив дистальних мутацій на конформаційну рухливість ВІЛ-1 протеази: дослідження методом молекулярної динаміки. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2005.
Проведено розрахунки МД нативної протеази з метою повніше вивчити конформаційну рухливість нативного білка. Отримані результати МД порівнювали з даними ЯМР. Показано, що за фізіологічних умов іон Na+ вбудовується до каталітичної діади, що суттєво стабілізує просторову структуру димеру протеази. Проведено розрахунок МД чотирьох мутантів: Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu и Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys. Показано, що мутант Leu10Ile стабілізує закриту конформацію протеази шляхом зменшення гнучкості сусідньої N-кінцевої петлі. Мутант Leu90Met змінює пакування амінокислотних залишків у димеризаційному домені, що призводить до зменшення доступного конформаційного простору протеази. Доведено, що потрійний мутант Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu негативно впливає на взаємну рухливість доменів, що призводить до стабілізації закритої конформації протеази ВІЛ-1. У мутанта Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys не виявлено суттєвих змін просторової конформації протеази ВІЛ-1 та її колективних рухів у процесі МД.
Ключові слова: молекулярна динаміка, протеаза ВІЛ-1, резистентні мутанти, колективні рухи, узагальнений параметр впорядкування S2, ЯМР.
АННОТАЦИЯ
Ковальский Д.Б. Влияние дистальных мутаций на конформационную подвижность ВИЧ-1 протеазы: исследование методом молекулярной динамики – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 – молекулярная биология. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2005.
Проведены расчеты МД с целью наиболее подробно изучить конформационную подвижность нативного белка. Полученные данные МД сравнивалась с данными ЯМР. Показано, что при физиологических условиях ион Na+ встраивается к каталитической диаде, что существенно стабилизирует пространственную структуру димера протеазы. Проведен расчет МД четырёх мутантов: Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu и Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys. Показано, что мутант Leu10Ile стабилизирует закрытую конформацию протеазы путем уменьшения локальной гибкости соседней N-концевой петли. Мутация Leu90Met приводит к переупаковке аминокислот димеризационного домена, что существенно уменьшает доступное конформационное пространство. Показано, что тройной мутант Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu негативно влияет на подвижность доменов относительно друг друга, что приводит к стабилизации закрытой конформации белка. У мутанта Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys не обнаружено существенного влияния на пространственную конформацию протеазы ВИЧ-1 и ее коллективных движений в процессе МД.
Ключевые слова: молекулярная динамика, коллективные движения, обобщенного параметра упорядочения S2, резистентные мутанты, протеаза ВИЧ-1, ЯМР.
SUMMARY
Kovalskyy D. B. Effect of Distal Mutations of Conformational Behavior of HIV-1 Protease: Molecular Dynamics Simulations Study. – Manuscript.
Thesis for Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.03 –Molecular Biology. – Institute of Molecular Biology and Genetics of Ukrainian National Academy of Sciences, Kyiv, 2005.
Drug resistant mutations within HIV-1 protease structure are the main obstacle on the way of successful patients recovery treated with HIV1- protease inhibitors. Numerous studies revealed the existence of active site and distal drug resistant mutations of HIV-1 protease. Effect of active site mutations could be readily understood from the spatial structure of the enzyme and its interaction mode with inhibitors. In turn, impact of distal mutations on atomic level is not so apparent: X-ray structures of such mutants a very similar to the native one and the observed deviation could not be attributed to a particular distal mutation. Dissertation is devoted to the theoretical investigation of the effect of point and multiple distal mutations on the conformational flexibility of the HIV-1 protease. Molecular Dynamics (MD) simulation technique was chosen as relevant and efficient tool.
The goal assumes extensive comparison of data from Molecular Dynamics (MD) simulations runs of mutants with corresponding data of the native protease as a reference. For this purpose an extensive investigation of conformational behavior of native HIV-1 protease as a function of simulation conditions was performed using MD simulation technique. MD of the native HIV-1 protease under weak acidic and physiological conditions was computed. Comparative analysis of these two runs reveals that Na+ ions binds to deprotonated catalytic dyad shielding repulsion of negatively charged carboxylic groups. It serves as a substitutor of the proton and stabilize the dimmer structure under physiological conditions. Therefore, salt (i.e. Na+ and Cl— ions) must be included into the simulated system under physiological in order to obtain stable conformational behavior of the enzyme.
In order to compare results of the MD simulations results with available NMR data a program to compute generalized order parameter S2 was developed. A good agreement of S2 computed from MD simulations and NMR derived data suggests correctness of the selected simulation protocol.
A general approach “difference map of dynamic cross correlation matrixes” (DM-DCCM) for correlated motions was developed in order to compare Molecular Dynamics of two systems through the analysis of their collective motion (Essential dynamics, ED) changes. According to the approach the DCCM maps are constructed for two systems to be compared based on the ED analysis. Due to the contribution to overall global motions only first 4 eigenvectors are considered. The evaluation of the difference between the reference and mutant DCCMs results in DM-DCCM. A coefficient of identity is estimated which indicates the ratio of difference between correlated motions of two proteins. The general procedure is further applied to study effects of single or multiple drug resistant distal mutations on MD of HIV-1 protease.
The following mutants were selected in this study: Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu and Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys.
Leu10Ile mutant largely effects conformational dynamics comparing to native protease by stabilizing the closed conformation of the HIV-1 protease. The effect is mediated by the decrease of flexibility of adjacent residue Pro9. For the native protease we have shown that conformational transition of the Pro9 facilitates curling outward of the N-terminal loop that, in turn, is strongly correlated with global flap opening motions. Therefore inability to flip out of the Pro9 immediately results in inability to open the flap of the protease spontaneously. From the dynamical point of view in the Leu10Ile mutant the redistribution of the amplitude of correlated motions occurs. Largest eigenvector appears to be catalytic assisted motion over the flap opening motion in the native protease. This results coincides with the observation that the mutant Leu10Ile is more enzymatically effective than the native protease.
Mutation at position 90 to methionine led to redistribution in the local packing density of the dimerization domain. Leu90Met mutant is shown to have small effect on changes of snapshot conformations. However, it effects the correlated motions by disturbing the flexibility of catalytic loop residues in the dimerization interface of the protease. Essential dynamics analysis reveal decreased coupling of amino acid residues within dimerization domain that led to fewer interaction between two subunits. Such destabilization mistunes correlated motion of the entire HIV-1 protease. The last that may impact on decreased protein stability observed in experimental studies.
Triple mutant Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu has larger van der Waals contacts of the dimerization domain with core domains than in native form of the enzyme. Increased volume of the residue 71 fills the space required for the flap opening event. As shown with DM-DCCM changes occur in correlated motions of the dimerization domain also. Shape of Leu93 sidechain allows better interaction with Phe99’ from the opposite subunit. This increases dependency of the motion of core and dimerization domains. As results these mutation solidify closed conformation of the protease similar the effect to Leu10Ile mutant. Also the increase in amplitude of the catalytic assisted motion is observed.
Quaternary mutant Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys did not expressed any distinct effect on HIV-1 protease molecular dynamics. Theoverall conformational analysis as well as DM-DCCM suggest almost identical behavior of the mutant comparing the the reference native dynamics. The observation is rationalized by the facts that these mutations are conservative solvent exposed and situated on the flexible loops of HIV-1 protease.
Keywords: molecular dynamics, correlated motions, HIV-1 protease, drug-resistant mutations, generalized order parameter S2, DM-DCCM algorithm, NMR.
| 
