Библиотечный каталог авторефератов Украины

Рис. 5.  Аналіз за Саузерном ДНК імовірно трансгенних рослин цукрового буряка на предмет інтеграції в їх геном мутантного гена АНАS:
К – контрольна (нетрансгенна) рослина;
+/- – позитивний контроль реакції (використовували плазміду pCB004).

Всі три лінії, що показали позитивні за PCR і Саузерном результати, були розміщені в середовищі для коренеутворення MSRI і ті, котрі сформували корені, були пересаджені в ґрунт для наступних досліджень і одержання насіння. Щоб одержати насіння, коренеплоди всіх PURSUIT-стійких рослин, що ростуть у ґру­нті, були піддані верналізації при +4°C . Отримане насіння використовувалося в дослідах по обприскуванню PURSUIT (15, 30 і 60 г/га, що відповідає 0,3; 0,5 та 1кратній дозі, що рекомендується для польових обробок, відповідно), однак па­ростки виявилися не стійкими. Повторний аналіз за Саузерном ДНК рослин лінії №5, отриманих з насіння, не дав позитивного сигналу. Можливо, трансгенні лінії виявилися мозаїчними з низьким відсотком трансгена, що призвело до втрати трансгенних тканин або під час субкультивування рослин, або під час утворення гамет (тобто була відсутня трансмісія трансгена в першому поколінні). Химерні­стю отриманих рослин також можна пояснити і низьку їхню стійкість до гербіци­дів.

Трансформація експлантів цукрового буряка
методом бомбардування мікрочастинками золота

Відомо, що гармата моделі PDS-1000 була успішно застосована для одер­жання транзієнтної експресії при обстрілі клітинної суспензії (Ingersoll, 1996), а також клітин продихів (Hall, 1997) цукрового буряка. В нашій роботі ми викорис­товували інші експланти – сегменти листків і калюс. Після обстрілу експланти поміщали на середовища для регенерації. Через три дні експланти були проаналі­зовані. Для аналізу використовували модифікований метод гістохімічного аналізу GUS активності, що дозволяє пригнічувати дію фенолоксидаз. Модифікований метод дозволив провести аналіз експлантів цукрового буряка. В результаті в двох калюсних колоніях було виявлено зафарбовані зони. На рис. 6 представлено одну з них (сорт ACH-199). Колом позначений сектор, що зафарбувався в блакитний колір. Фарбування групи клітин характерне для транзієнтної експресії після бом­бардування експлантів мікрочастинками золота.

Рис. 6.  Результати гістохімічного аналізу активності глюкуронідази через три дні після бомбардування пухкого калюсу сорту ACH-199 плазмідою pCB002.

Обстрілювання тканин частками з нанесеною плазмідою, що містить ген глюкуронідази, з наступним гістохімічним аналізом проводилося з метою оптимі­зації параметрів трансформації для подальшого використання їх з метою одер­жання стабільних трансформантів. Позитивні результати цих експеримент­тів є практичною базою для використання регенеруючого ембріогеного калюсу для прямої трансформації. Відпрацьовані параметри і методи трансформації з вико­ристанням гармати можуть бути застосовані для практичних цілей одержання ро­слин цукрового буряка зі зміненим метаболізмом – стійких до гербіцидів чи не­сприятливих умов навколишнього середовища.

Висновки

1. Відпрацьовано системи індукції калюсоутворення і регенерації у рослин цукрового буряка (Beta vulgaris L.) з різних експлантів і калюсу, підібрано оптимальний склад середовищ для масового одержання регенерантів.
2. Гістологічним аналізом встановлено, що регенераційні процеси в черешках листків цукрового буряка в культурі  in vitro проходять по типу органогенезу.
3. Запропоновано ефективний метод регенерації рослин з калюсу шляхом соматичного ембріогенезу. Вперше отримано вторинні ембріоїди цукрового буряка та оптимізовано умови підтримки їх у культурі in vitro без втрати регенераційної активності і здатності коренеутворення з регенерантів.
4. Розроблено умови і підібрано методи генетичної трансформації буряка за допомогою Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота з преципітованою ДНК.
5. Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вуглеводів.
6. Виявлено стабільну експресію гена GUS у калюсі і листках буряка при використанні A. tumefaciens, а також транзієнтну експресію цього гена, внесеного у клітини калюсу шляхом бомбардування  експлантів мікрочастинками золота.
7. За допомогою A. tumefaciens в рослини цукрового буряка перенесено ген  стійкості до гербіциду PURSUIT. Експресію цього гена виявлено у трьох ліній цукрового буряка на основі позитивного сигналу при аналізі PCR і гібридизації за Саузерном.

Список робіт, опублікованих ЗА темОЮ дисертації

1. Гирич А.М., Череп Н.Н., Скаржинская М.В., Головко А.Э., Глеба Ю.Ю. Генетическая трансформация рапса Brassica napus с помощью Agrobacterium tumefaciens // Цитология и генетика.– 1995.– №2.– С. 20-25.
2. Банникова М.А., Головко А.Э., Хведыныч О. А., Кучук Н.В. Регенерация растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) в культуре in vitro. Гистологическое изучение процессов регенерации // Цитология и генетика. – 1995.– №6.– С. 14-22.
3. Golovko A. Genetic variability of somatic embryogenesis in tissue cultures of sugar beet breeding lines // Цитология и генетика.– 2001.– №6.– С. 10-17.
4. Головко А.Э., Погребняк Н.Я., Банникова М.А. Особенности культивирования in vitro и трансформации сахарной свеклы // Физиология и биохимия культурных растений.– 2002.– 34, №5.– С. 394-405.
5. Golovko Andrei. Methods for somatic embryo formation and plant regeneration of Beta vulgaris. Patent US 6,555,375 B1. Int. Cl. C12N 5/00, C12N 5/02. Filled 14.06.2000 (Issued to American Cyanamid by United States Patent and Trademark Office on 29.04.2003).
6. Банникова М.А., Головко А.Э., Кучук Н.В., Глеба Ю.Ю. Разработка методов генетической трансформации у коммерческих сортов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) // Сборник тезисов II Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", 1993.– Пущино, 1993.– С. 11(245).
7. Bannikova M.A., Golovko A.E., Khvedynich O.A., Kuchuk N.V., Gleba Y.Y. In vitro organogenesis and protoplast cultivation of sugar beet (Beta vulgaris L.) // Abstracts of IVth European Cell Biology Congress Prague, June 26th – July 1st 1994. – Prague, 1994. – P. 546.
8. Merkulov S.M., Pasternak T.P., Golovko A.E., Gleba Y.Y. Agrobacterium - mediated transformation of pear cultivars (Pyrus communis L.) // Abstracts of IVth European Cell Biology Congress Prague, June 26th – July 1st 1994.– Prague, 1994. – P. 542.

АнотацІя

Головко А.Е. Цукровий буряк (Beta vulgaris l.) в культурі in vitro: регенерація, морфогенез і генетична трансформація.– Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія.– Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України. Київ, 2003.

За темою дисертації захищається 8 наукових робіт.

Вивчалися процеси морфогенезу в культурі тканин цукрового буряка (Beta vulgaris L.) in vitro з використанням 14 сортів вітчизняної і закордонної селекції. Відпрацьовано системи індукції калюсу і регенерації цукрового буряка з різних експлантів і калюсу, підібраний оптимальний склад середовищ для одержання ве­ликої кількості регенерантів. Гістологічний аналіз показав що регенераційні про­цеси в черешках листків цукрового буряка в культурі in vitro, проходять за типом органогенезу. Запропоновано ефективний метод регенерації рослин з калюсу шляхом соматичного ембріогенезу. Вперше отримано вторинні ембріоїди буряка і оптимізовано умови підтримки їх у культурі in vitro без втрати регенераційної ак­тивності і здатності коренеутворення у регенерантів. Розроблені методи регене­рації рослин було використано для трансформації цукрового буряка за допомо­гою Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота. Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вуглеводів. Ви­явлено стабільну експресію гена GUS у калюсі і листках при використанні A. tumefaciens, а також транзієнтну експресію цього гена, внесеного у клітини ка­люсу в результаті бомбардування мікрочастинками золота. Отримані трансгенні рослини цукрового буряка зі стійкістю до PURSUIT при використанні A. tumefaciens. Відібрано три лінії цукрового буряка (Beta vulgaris L.), що пока­зали позитивний сигнал при аналізі PCR і гібридизації за Саузерном.

Ключові слова: цукровий буряк (Beta vulgaris L.), органогенез, ембріогенез, регенерація, трансформація, Agrobacterium tumefaciens, стійкість до гербіцидів, ген АНАS.

Аннотация

Головко А.Э. Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) в культуре in vitro: регенерация, морфогенез и генетическая трансформация.– Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология.– Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины. Киев, 2003.

По теме диссертации защищается 8 научных работ.

Диссертация посвящена изучению индукции каллюсогенеза, регенерации и генетической трансформации сахарной свеклы (Beta vulgaris L.). Целью работы была разработка эффективной системы регенерации и методов трансформации сахарной свеклы при помощи агробактерии Agrobacterium tumefaciens и бомбар­дировки микрочастицами золота с преципитированной ДНК, получение клеточ­ных линий и трансгенных растений, а также их молекулярно-биологический ана­лиз.

Изучались процессы морфогенеза в культуре тканей сахарной свеклы in vitro с использованием 14 сортов отечественной и  зарубежной  селекции. Отработаны системы индукции  каллюса, изучены процессы спонтанного и индуцируемого органогенеза сахарной свеклы  из  различных  эксплантов и каллюса, подобран оптимальный состав сред для получения большого количества регенерантов. Гис­тологический анализ показал что регенерационные процессы в черешках листьев сахарной свеклы в культуре in vitro проходят по типу органогенеза, приводящего к образованию почек с последующим их развитием и образованием листьев. По­лучена и изучена регенерация из каллюса путём соматического эмбриогенеза.  Впервые получены вторичные эмбриоиды свеклы и оптимизированы условия поддержания их в культуре in vitro без потери регенерационной активности и способности корнеобразования у регенерантов. Поддерживая культуру эмбрио­генного каллюса, оказалось возможным получить постоянную высокоэффектив­ную (c частотой 15-20%) регенерацию растений.

В работе также было опробовано несколько подходов к определению кон­центраций антибиотиков и гербицидов, подавляющих рост каллюса сахарной свеклы, и установлены  оптимальные концентрации PURSUIT и канамицина для селекции каллюса и растений. Разработанные методы регенерации растений были использованы для трансформации сахарной свеклы  при помощи A. tumefaciens и бомбардировки микрочастицами золота. Предварительно был  проведен  скри­нинг способных к трансформации эксплантов различного генезиса нескольких сортов и отобраны наиболее оптимальные сорта и ткани. В результате работ по трансформации впервые получены трансгенные каллюсные линии свеклы с изме­нённым биосинтезом углеводов, некоторые из которых обнаpужили способность к коpнеобpазованию на селективных сpедах. При использовании A. tumefaciens отобраны несколько химерных по экспрессии GUS гена канамицинустойчивых растений, и показана стабильная экспрессия трансгена в листьях.

Используя широкий арсенал методов для повышения эффективности транс­формации и регенерации получены трансгенные растения сахарной свеклы с ус­тойчивостью к PURSUIT при использовании A. tumefaciens. Отобраны три линии сахарной свеклы, которые показали положительный сигнал на наличие мутант­ного гена АНАs при анализе PCR и гибридизации по Саузерну. Бомбардирование тканей микрочастицами золота с нанесенной плазмидой, содержащей ген глюку­ронидазы, с последующим гистохимическим анализом позволило получить тран­зиентную экспрессию гена GUS в клетках каллюса. Таким образом, разработан­ные методы соматического эмбриогенеза и органогенеза сахарной свеклы в куль­туре in vitro могут быть использованы в массовом размножении ценных геноти­пов, включая растения сахарной свеклы с измененным метаболизмом, устойчи­вые к гербицидам или неблагоприятным условиям окружающей среды.

Ключевые слова: сахарная свекла (Beta vulgaris L.), органогенез, эмбриогенез, регенерация, трансформация, Agrobacterium tumefaciens, устойчивость к гербицидам, ген АНАs.

Summary

Golovko A.E. Sugar beet (Beta vulgaris L.) in vitro cultivation: regeneration, morphogenesis and genetic transformation.– Manuscript.

Thesis for a Ph D degree (Biology)  by speciality 03.00.20 – biotechnology.– Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

The results of 8 scientific publications are defended.

The processes of morphogenesis were investigated in sugar beet tissue culture in vitro using 14 Ukrainian and foreign cultivars. Methods for callus induction were developed; spontaneous and induced regeneration from various explants and callus were studied; the media composition was optimized to maximize the number of regenerants. Histology analysis showed that regeneration from petioles cultivated in vitro occurs through organogenesis which results in bud formation followed by leaf development. Regeneration through somatic embryogenesis in friable callus was induced and studied. Repetitive embryo culture has been initiated for the first time; culture conditions and media composition were optimized to maintain the repetitive embryos in vitro for very long time without losing the capability to regenerate normal plants. Carefully maintained embryogenic culture was able to regenerate plants on a regular basis with very high efficiency (15-20%). Several methods for determining the concentrations of herbicides and antibiotics that effectively inhibited sugar beet callus growth were used, and optimal concentrations of PURSUIT and kanamycin for selection of callus and shoots were determined. Developed regeneration methods were used to transform sugar beet via Agrobacterium tumefaciens and particle bombardment. The most susceptible to genetic transformation explants were identified for each sugar beet variety prior to beginning the transformation experiments. Transgenic calli carrying genes for altered carbohydrate biosynthesis have been obtained for the first time as a result of these experiments; some of the transgenic lines were able to form roots in presence of a selective agent. Several kanamycin-resistant chimeras stably expressing GUS gene in leaves were isolated after transformation with Agrobacterium tumefacien. Also, through modifying the protocol for agrobacterium-mediated transformation with the purpose of increasing the frequency of transformation and regeneration, three transgenic lines carrying mutant AHAS gene were obtained and analyzed. The transgenic nature of the plants was confirmed through PCR and Southern analyses. Finally, transient expression of GUS gene was observed in cells after bombardment of callus with gold particles carrying plasmid with glucuronidase gene followed by histochemical analysis for GUS. Therefore, the optimized protocol for particle gun transformation can be effectively used for obtaining transgenic sugarbeet plants with altered metabolism, resistant to herbicides and tolerant to environmental stress.

Key words: sugar beet (Beta vulgaris L.), organogenesis, embryogenesis, regeneration, transformation, Agrobacterium tumefaciens, herbicide resistance, AHAS gene.