Библиотечный каталог авторефератов Украины

Дизаміщені аміди до того ж здатні як до утворення сильних водневих зв'язків з водою, що перевершують по енергії Н - зв'язки вода-вода, за рахунок донорно-акцепторних взаємодій, так і до структуризації води  за рахунок гідрофобної гідратації. Аміди на відміну від діолів знижують ефективну концентрацію електролітів шляхом їх переводу із іонної в молекулярну форму. Дизаміщені аміди  мають яскраво виражену дифільність – високу гідрофільність і гідрофобність одночасно. Можливо, це  обумовлює відмінність їх механізму  кріозахисної дії від діолів. Додатково до колігативного, основою якого є взаємодія з водою,  виявляється специфічний характер  їх дії, обумовлений здатністю амідів безпосередньо  впливати на властивості і структуру  мембран і цитоскелету клітин.

Виявлена залежність між кріопротекторною активністю вивчених речовин і їх кріоскопічною константою.  При цьому коефіцієнти  кореляції між показниками життєздатності сперматозоїдів після кріоконсервування  і кріоскопічною константою в межах одного гомологічного ряду  амідів чи діолів досягають  значень  0,75 - 0,85 при р ≤ 0,05. Таким чином,  кріоскопічну константу речовин  можна використовувати в доекспериментальному  скринінгу ефективних кріозахисних агентів як доповнення до інших характеристик  їх гідрофільності.

Вплив складу і фізико-хімічних властивостей кріозахисного середовища на життєздатність сперматозоїдів півнів. Показано, що при гіпотермічному зберіганні сперми півнів в присутності вивчених  вуглеводів тільки введення інозиту і мальтози негативно позначається на життєздатності  сперматозоїдів. У всіх інших середовищах життєздатність сперматозоїдів незалежно від використаного вуглеводу зберігається на однаковому рівні. Після заморожування – відтавання вірогідно кращі результати отримані при введенні в середовище  фруктози або глюкози,  лактози та інозиту. При цьому виявлено, що фруктоза, глюкоза і лактоза практично на одному рівні забезпечують збереженість мембран голівок у процесі кріоконсервування (65-70 % цілих клітин), у той час як на цілісність акросом вони  впливають по-різному. У середовищах з моносахаридами зберігається після відтавання 35-37 % клітин з цілими акросомами, у середовищах з лактозою кількість сперматозоїдів з цілими акросомами знижується до 31 %. Однак при кріоконсервуванні сперми в середовищі з лактозою отримана найвища збереженість мембран голівок  (71 % клітин). Таким чином, за ступенем зменшення позитивного впливу на життєздатність сперматозоїдів півнів після кріоконсервування  вивчені вуглеводи розташувалися в наступній послідовності: фруктоза  ≥ глюкоза > лактоза >  інозит >  сахароза >  мальтоза. Показано, що моносахариди відновлюють після заморожування - відтавання більшу кількість рухливих клітин і підтримують їхню активність протягом більш тривалого часу, зберігаючи при цьому більшу кількість клітин з цілими акросомами. Дисахариди забезпечують  після кріоконсервування більшу кількість сперматозоїдів с цілими мембранами голівок.

Додавання  амінокислот гліцину та аланіну в кріозахисне середовище привело до зниження життєздатності сперматозоїдів після відтавання. Введення антиоксидантів  у кріозахисне середовище не тільки не поліпшило функціональну збереженість клітин після кріоконсервування, а навпаки, викликало зниження запліднюючої здатності сперматозоїдів.

Вивчено вплив білкових добавок (САЛ, ЯА, ОМ) у кріозахисне середовище у діапазоні концентрацій  від 0,5 до 2 % на життєздатність сперматозоїдів півнів до і після заморожування-відтавання. Показано, що білкові добавки до кріозахисного середовища знижують цитотоксичну дію ДМФА (а також МАЦ и ДМАЦ) на етапі інкубації (рис.6), забезпечують задовільне відновлення запліднюючої здатності  сперматозоїдів після кріоконсервування без видалення кріопротекторів. Установлено, що ефективність дії білкових добавок залежить  від їхньої концентрації в середовищі, яка для одержання високих результатів не повинна перевищувати 0,5 % . Використання білкових добавок у кріозахисному середовищі може бути одним їз засобів зниження цитотоксичної дії кріопротекторів класу  амідів.

Рис. 6. Залежність рухливості сперматозоїдів півня від складу

кріозахисного середовища при гіпотермічній інкубації (4 0С):

1 –  основне середовище;  2 – основне середовище + яєчний альбумін (0,5 %);

3 – основне середовище + ДМФА;

4 – основне середовище +  яєчний альбумін   (0,5 %) + ДМФА.

Досліджена життєздатність сперматозоїдів півнів у залежності від осмотичності середовища в циклі кріоконсервування. Встановлено, що  при розведенні сперми півнів  при  температурі 20 0С  розчинами хлориду натрію з осмотичністю від 25 до 800 мОсмоль найбільш чутливими  до зміни тонічності середовища є рухливість сперматозоїдів і збереженість акросом, у той час як кількість клітин з цілими мембранами голівок при цьому практично не змінюється (рис. 7). Виявлено, що втрата рухливості сперматозоїдів в області гіпертонії (від 600 до 800 мОсмоль) оборотна. При  переносі сперматозоїдів у ізотонічні умови  клітини  відновлюють свою рухливість. Зниження рухливості, що спостерігається в області гіпотонії, навпаки, не є оборотною. Установлено, що 50 % сперматозоїдів мають ушкоджені акросомы вже при осмотичності середовища 70 мОсмоль, тобто ці клітини витримують гіпотонію тільки в 5 разів нижчу ізотонічних умов, хоча порушень цілісності мембран в області голівки при цьому не виявлено.

Рис. 7. Залежність життєздатності сперматозоїдів до заморожування від

осмотичності розчину хлориду натрію, доданого при температурі 20 0С.

Таким чином, виявлено, що сперматозоїди півнів стійкі до зміни осмотичності позаклітинного середовища  в діапазоні від 150 до 600 мОсмоль. Тому вивчена запліднююча здатність сперматозоїдів, кріоконсервованих у кріозахисних середовищах з осмотичністю від 150 до 520 мОсмоль. Найбільш високі результати заплідненості яєць  отримані після штучного запліднення курей (74-82 %) спермою, яка була  кріоконсервувована  у захисних середовищах з осмотичністю в межах 370-400 мОсмоль. Таким чином, саме в цій області знаходиться оптимальне значення осмотичності кріозахисного середовища, застосування якого забезпечує найбільш високу життєздатність сперматозоїдів півнів після заморожування-відтавання.

Одним з факторів, який  виявляє пошкоджуючу дію на клітини при кріоконсервуванні, є зміна іонної сили поза-  та  внутрішньоклітинного середовища.  У зв'язку з цим  був вивчений вплив кріозахисних  середовищ з однаковою осмотичністю (390-400 мОсмоль), але різною іонною силою розчинів (від 0 до 0,322 моль/л) на життєздатність сперматозоїдів після кріоконсервування (табл.6 і 7). Отримані дані показують, що існує  оптимальне значення  іонної сили (0,200 ± 0,017 моль/л), яке забезпечує відновлення максимально можливої кількості  життєздатних сперматозоїдів після заморожування-відтавання. Будь-яке відхилення  іонної сили середовища від цього значення, наприклад, її різке   зменшення  в середовищі С5,  яке містить  тільки  неелектроліти, чи збільшення в середовищі С1, навіть за рахунок найбільш вагомого компонента  глутамата натрію,  приводить до  зниження життєздатності сперматозоїдів півнів після кріоконсервування.

Таблиця 6

Склад та співвідшошення  компонентів у кріозахисних середовищах

з різною  іонною силою

Примітка. *- середовище BHSV (Schram G.P.,1989)

Таблиця 7

Залежність життєздатності  сперматозоїдів півнів після заморожування-відтавання від іонної сили  середовища (склад в табл.6)

Примітка: *- визначали рухливість сперміїв  при  4 0С до повної загибелі клітин; кріопротектор ДМФА в концентрації 1 М, заморожування проводили в пайєтах.

Однак  домінуючою і достатньою умовою для успішного кріоконсервування  сперми є   осмотичність  кріозахисного середовища  і тільки потім іонна сила, тому що після штучного запліднення курей спермою, кріоконсервованою  у середовищі С5,  іонна сила якого дорівнює 0, отримане відновлення функціональної активності сперматозоїдів після відтавання (заплідненість яєць  після штучного запліднення курей на рівні 34 %, див. табл.6 і 7 ).

Таким чином встановлено, что  оптимальне значення  осмотичності  кіозахисного середовища знаходиться в області гіпертонії відносно плазми сперми і дорівнює  395-400 мОсмоль при рН 6,9 ± 0,1 , оптимальне значення іонної сили середовища дорівнює 0,200 ± 0,017 моль/л.

       Вплив режимних параметрів і кінцевої температури охолодження на життєздатність сперматозоїдів півнів. Вивчена залежність життєздатності сперматозоїдів півнів від кінцевої температури заморожування з використанням швидкостей охолодження  2,10,40 0С/хв. Сперму півнів заморожували в ампулах у  кріозахисному середовищі ЛКС-1 з  ДМФА, концентрація 1 М.  Зразки сперми охолоджували до температури –5, –10, –15, –20, –30, –40, –50, –60, –70, –80, –90, –100  та –196 0С, потім відтавали та оцінювали життєздатність сперматозоїдів. Для  більш чіткого виявлення зон температур, що відповідають  найбільшому рівню ушкоджень   сперматозоїдів у залежності від швидкості охолодження,  провели розрахунок зменшення кількості життєздатних клітин при зниженні температури на кожні 5 чи 10 0С в  відсотках від числа цілих сперматозоїдів  при попередній температурі.  Розрахунок проведений за наступною формулою:  

де  In  - показник життєздатності сперматозоїдів при кожній досліджуваній температурі охолодження; In-1  - показник життєздатності сперматозоїдів  при   зниженні  температури на кожні  5 чи 10 0С.

На рис.8 приведені  отримані результати розрахунку зниження цілісності акросом  у сперматозоїдів на кожні  5 0С  в області температур від  0    до –30 0С. На рис.9 представлені дані розрахунку втрати рухливості сперматозоїдами  при зниженні температури на кожні 10 0С в залежності від кінцевої температури охолодження з різною швидкістю. Зменшення числа клітин з цілими мембранами голівок при зниженні температури на кожні 10 0С в залежності  від кінцевої температури охолодження практично цілком відтворює  закономірність, приведену на рис.9.

Аналіз отриманих результатів  дозволяє виділити дві критичні  температурні  зони, в яких у сперматозоїдів ушкоджуються в першу чергу  акросоми. При  повільному охолодженні (2 і 10 0С/хв) тільки в 5 - 10 %  сперматозоїдів  порушення акросом  з'являються  при –5 0С,  основна частина клітин  (60 –75 %) втрачає  акросоми  в діапазоні температур  –15 ÷ –20 0С.  У той  же час  при охолодженні зі швидкістю 40 0С/хв  більш ніж у 50 % клітин  акросоми пошкоджуються в області  температур від  –3 до –8 0С,  у іншої частини сперматозоїдів - при   температурі –20 0С.

У  діапазоні  температур –3 ÷ –8 0С  починається  кристалізація позаклітинного середовища.  Клітини в цей час піддаються дуже значному осмотичному впливу як за рахунок збільшення  концентрації позаклітинного розчину,  так і за рахунок дії кристалів льоду, що утворюються.

Рис.8. Кількість сперматозоїдів, які одержують ушкодження акросом

при зниженні температури з різною швидкістю на кожні 5 0С в залежності

від кінцевої температури охолодження: 1 – 2 0С/хв; 2 – 10 0С/хв; 3 – 40 0С/хв.

Клітини інтенсивно дегідратуються, відбувається різка зміна їх об’єму, що, мабуть, і приводить до пошкодження акросом   більш  ніж у 50 % сперматозоїдів. Можна припустити, що в області температур –3 ÷ –8 0С, сперматозоїди піддаються температурно-осмотичному шоку, і, в першу чергу,  пошкоджуються  саме акросоми. У неушкодженої частини клітин, що  залишилася, у цій температурній зоні акросомальні мембрани втрачають свої бар'єрні властивості  і при наступному охолодженні з цією ж швидкістю руйнуються при  температурі –20 0С.  При  додатковому дослідженні впливу швидкості охолодження на збереженість   акросом в області температур до –8 0С   виявлено, что ушкодження акросом починають збільшуватися вже  при швидкості охолодження 15 0С/хв.

При повільних швидкостях охолодження   60-75 %  сперматозоїдів мають ушкоджені акросоми в інтервалі   температур  –15 ÷ –20 0С. Це друга критична   температурна зона, у якій ушкодження  сперматозоїдів, можливо, обумовлені  “ефектами розчину” - підвищенням концентрації неелектролітів та електролітів,  збільшенням іонної сили поза-  і внутрішньоклітиного середовища, зміною рН та ін. При цьому чим менша  швидкість  охолодження  на даному етапі, тим  більш тривалий час знаходяться клітини у  несприятливих умовах, і тим  більший рівень ушкоджень сперматозоїдів під впливом цього фактора.  Отже швидкість охолодження в цьому температурному діапазоні необхідно збільшити, тому що виявлено, що при повільних швидкостях охолодження сперматозоїди втрачають рухливість (рис.9) і одержують пошкодження мембран голівок.

Рис. 9.  Зменшення кількості  рухливих сперматозоїдів при зниженні

температури з різною швидкістю на кожні 10 0С в залежності від кінцевої

температури охолодження: 1 – 2 0С/хв; 2 – 10 0С/хв; 3 – 40 0С/хв.

При цьому при швидкості охолодження 2 0С/хв  у зазначеній температурній зоні  ушкоджується більше  60 %  клітин (рис.9). При швидкості охолодження 10 0С/хв  рівень ушкоджених клітин  у цьому діапазоні температур знижується  на 10-15 %. Температурно-осмотичний шок в області температур –3 ÷ –8 0С, що викликає значне пошкодження акросом   при збільшенні швидкості охолодження до 40 0С/хв,   у меншому ступені впливає на цілісність мембран голівок і рухливість сперматозоїдів. Знижується рухливість і спостерігаються пошкодження мембран  не більш,  ніж у 5- 10 % клітин (рис.9).  Однак при даній швидкості охолодження значні пошкодження клітин спостерігаються в  іншому температурному інтервалі, а саме в діапазоні   –60 ÷ –70 0С. При цьому  в області температур  від 0 до –25 0С знижується   рухливість сперматозоїдів і пошкоджуються мембрани  тільки   20 –30  % клітин , у той час як  у температурній зоні –60 ÷ –70 0С  рівень пошкоджень значно вищий (рис.9). Можливо,  цей діапазон температур  варто вважати третьою критичною зоною дії факторів кріопошкоджень на сперматозоїди. Чим викликані пошкодження клітин у цій температурній області, залишається   нез’ясованим. 

Залежність рівня пошкоджень сперматозоїдів у кожній з цих зон від швидкості охолодження приводить до необхідності використовувати багатоетапний режим заморожування і провести оптимізацію швидкості охолодження на кожному етапі. У зв'язку з цим був вивчений вплив на життєздатність сперматозоїдів півнів наступних режимних параметрів охолодження і заморожування: швидкості охолодження від 4 0С до –8 0С; тривалості  витримки на  плато кристалізації;  швидкості охолодження від –8 до –20 0С; від –20 до –80 0С з наступним зануренням у рідкий азот.

Проведені дослідження показали, что відновлення найбільшої кількості функціонально повноцінних сперматозоїдів при заморожуванні сперми півнів в ампулах ємкістю 0,6 см3  та в пайєтах ємкістю 0,25 см3 з кріопротектором ДМФА (1М) забезпечується при наступному режимі заморожування:  від 4 до –8 0С зі швидкістю охолодження 1-3 0С/хв; 1-2 хв  витримки на плато кристалізації позаклітиного середовища; далі охолодження до –25 0С зі швидкістю 25-30 0С/хв;  до  –80 0С зі швидкістю 65-70 0С/хв та наступним зануренням у рідкий азот. Використання цього режиму  кріоконсервувованя сперми півнів  дозволило  забезпечити заплідненість яєць після штучного запліднення кур  розмороженою спермою до  рівня 75 - 85 %. Таким чином, на підставі проведених досліджень був розроблений метод низькотемпературного консервування сперми півнів без видалення кріопротекторів.

Вплив тривалого низькотемпературного збереження на життєздатність сперматозоїдів півнів. У 1990 р. за  розробленим метом кріоконсервування  була заморожена і закладена на збереження в кріобанк  НДІ птахівництва УААН сперма різних порід півнів: австралорп, голошийна, єреванська, італійська куріпчаста, каліфорнійська смугаста, сусекс, юрлівська голосиста, род-айленд і білий леггорн. На рис.10  представлені результати визначення

Рис.10  Життєздатність сперматозоїдів півнів породи род-айленд після тривалого збереження при температурі –196 0С.

життєздатності сперматозоїдів півнів породи род-айленд після заморожування-відтавання через півроку, рік і 9 років збереження в низькотемпературному банку. Збереження глибокозамороженої сперми протягом зазначених термінів не вчинило негативного впливу на життєздатність сперматозоїдів. Рухливість сперматозоїдів (50-55%), кількість кліток з неушкодженими мембранами голівок (66-70%) і цілими акросомами (30-34%) залишилися на колишньому рівні. Заплідненість яєць навіть збільшилася на 7 і 4 %  через рік і 9 років збереження сперми, що, можливо, пов’язано з  кращими відтворними якостями курей, використаних у цей час для штучного запліднення. Виводимість яєць  також підвищилася через рік і 9 років збереження  на 8 і 10 %. Вивід курчат через півроку, рік і 9 років збереження сперми дорівнює 71,0; 67,8 і 72,4 %, відповідно.

Отримані результати визначення запліднюючої здатності сперми півнів різних порід, яка зберігалася в низькотемпературному банку протягом 9-10 років свідчать, що життєздатність сперматозоїдів півнів різних порід значно відрізняється після відтавання. Найбільш високі показники заплідненості  яєць і вивідку курчат  отримані для сперми породи півнів род-айленд (80,2 і 70,3 %), найбільш низькі – білий леггорн (лінія 9 – 52,8 і 38,7 %, лінія 37 – 32,8 і 25,3 %, відповідно). Виводимість яєць залишається на високому рівні (від 80 до 90 %) і не залежить від породи півнів, що вказує на низьку ембріональну смертність. Таким чином, сперматозоїди різних порід півнів відрізняються за своєю кріорезистентністю, яка, можливо, обумовлена різним  ліпідним складом і властивостями мембран. Виходячи з цього необхідно корегувати метод кріоконсервування в кожному конкретному випадку.

ВИСНОВКИ

1. Методи кріоконсервування сперми півнів та рівень знань в цій області, що існують на цей час, не дозволяють ефективно використовувати генетичний матеріал високопродуктивних плідників у селекційно-племінній практиці. Тому в дисертаційній роботі проведено теоретичне узагальнення досліджень впливу фізико-хімічних факторів кріопошкоджень на структурно-функціональний стан сперматозоїдів півнів на кожному з етапів кріоконсервування: вплив кріопротекторів у залежності від умов інкубації  і  їх хімічної структури до заморожування, вплив складу і фізико-хімічних властивостей кріозахисного  середовища, режимні параметри та кінцева температура  охолодження і заморожування. Вивчена кріопротекторна активність двох гомологічних рядів амідів і діолів в залежності від їх хімічної структури. На підставі цього обґрунтовані нові аспекти механізму пошкоджень і кріозахисту клітин у циклі кріоконсервування та розроблений безвідмивний спосіб кріоконсервування сперми півнів, ефективність якого перевірена при довгостроковому низькотемпературному зберіганні сперми різних порід півнів (9-10 років).

2. Встановлено, що в ряді вивчених амідів менш цитотоксичними є ДМФА, МАЦ і ДМАЦ, у ряді діолів - ЕГ, 1,2-ПД і 2,3-БД. За ступенем збільшення рівня ушкоджень сперматозоїдів під їх впливом  ці речовини розподілилися в наступній послідовності: ДМФА < МАЦ < ДМАЦ < ЕГ < 1,2-ПД < 2,3-БД. Виявлено, що морфологічні ушкодження сперматозоїдів під впливом амідів та діолів мають диференційний характер: діоли в більшому ступені ушкоджують мембрани голівок, аміди – акросомальну структуру клітин.

3. Показано, що рівень ушкоджень сперматозоїдів під впливом  діолів та амідів  по-різному залежить від температури інкубації. Кількість сперматозоїдів з морфологічними аномаліями в присутності амідів з підвищенням температури  інкубації  монотонно збільшується, у той час як під впливом діолів  - досягає максимуму при  15 0С і зменшується з  подальшим ростом температури.

4. Виявлено, що цитотоксична дія діолів на сперматозоїди  залежить від розмірів їх молекул  - чим більший об’єм молекул ізомерів бутандіолу або пропандіолу, тим вища їх цитотоксичність.  Цитотоксична дія амідів  на сперматозоїди  на відміну від діолів виявляється тільки при високій температурі і  концентрації і  не залежить від розмірів їх молекул. Отримані дані вказують на те, що механізм  цитотоксичної дії амідів і діолів на сперматозоїди відрізняється: в загальну цитотоксичну дію амідів основний вклад вносить хімічна (чи біохімічна) компонента, у той час як цитотоксичність діолів переважно обумовлена осмотичним фактором.

5. Встановлено, що при кріоконсервуванні сперми півнів кращими кріопротекторами  в рядах амідів і діолів  є менш цитотоксичні речовини. За  ступенем зменшення  кріопротекторної активності речовини розподіляються в такій послідовності: ДМФА > ДМАЦ > 1,2 –ПД > МАЦ > ЕГ > 2,3-БД. ДМФА за своєю кріозахисною активністю перевершує  всі досліджені речовини, забезпечуючи відновлення функціонально повноцінних сперматозоїдів після заморожування-відтавання  на 15-40 % більше ніж  інші вивчені кріопротектори.

6. Визначено, що білкові добавки до кріозахисного середовища знижують цитотоксичну дію дизаміщених амідів як до, так і після заморожування-відтавання. Ефективність дії білків залежить від їх концентрації в середовищі, яка не повинна перевищувати 0,5 % для одержання високої життєздатності  сперматозоїдів після кріоконсервування.

7. Виявлено, що сперматозоїди півнів стійкі до зміни осмотичності позаклітинного середовища в діапазоні від 150 до 600 мОсмоль. При цьому зниження рухливості, що спостерігається в області гіпертонії від 600 до 800 мОсмоль,  є оборотним, рухливість клітин відновлюється при переносі в ізотонічні умови. Установлено, що критична осмотичність середовища для сперматозоїдів півнів  в області гіпотонії,  при якій  50 % клітин  мають ушкоджену акросому, є 70 мОсмоль.

8. Показано, що осмотичність  є одним з домінуючих фізико-хімічних параметрів кріозахисного середовища для успішного кріоконсервування сперматозоїдів, її оптимальне значення знаходиться в області помірної гіпертонії стосовно  плазми сперми і становить 395-400 мОсмоль. Уперше визначено оптимальне значення іонної сили кріозахисного  середовища, що складає 0,200 ± 0,017  моль/л.

9. Виявлені три критичні температурні зони дії основних факторів кріопошкоджень сперматозоїдів півнів у процесі заморожування:  від –3 до –8 0С;     від –15 до –25 0С; від –60 до –80 0С. Показано, що рівень ушкоджень сперматозоїдів півнів (акросом, мембран і зниження рухливості)  у цих температурних зонах залежить від швидкості охолодження. При швидкості охолодження  менше ніж 10 0С/хв  основна частина клітин  пошкоджується  в області температур від –15 до –25 0С,  при швидкості охолодження  вище 15 0С/хв  -   у діапазоні  від  –3  до –8 0С, при цьому спостерігаються, головним чином, порушення акросомальной структури сперматозоїдів.

10. Залежність ушкоджень акросомальной структури сперматозоїдів в області температур від –3 до –8 0С, що виявлена   при збільшенні швидкості охолодження вище 15 0С/хв,  свідчить про те, що основним  пошкоджуючим фізико-хімічним фактором для сперматозоїдів є температурно-осмотичний шок. Наслідки його впливу у цьому діапазоні температур  зменшуються при зниженні швидкості охолодження до 1-3 0С/хв.

11. Встановлено, що зберігання сперми півнів у глибокозамороженому стані в умовах кріобанку протягом 9-10 років  не чинить негативного впливу на морфологічну збереженість і функціональну активність  сперматозоїдів.  Виявлено,  що стійкість  сперми півнів різних порід до дії низьких температур істотно розрізняється, що призводить до необхідності корегування методу кріоконсервування в кожному конкретному випадку.

Практичні рекомендації

1. Для зниження цитотоксичної дії амідів і діолів  на етапі підготовки   біологічних об'єктів  до заморожування кріопротектори  варто вводити тільки у  водному  розчині чи в складі кріозахисних середовищ. Введення 100 % речовин неприпустимо, тому що екзотермічний ефект їх змішання  з водою, яка складає основну частину суспензій клітин,  може приводити до локальних перегрівів,  підвищувати температуру інкубації  і викликати  ушкодження клітин.

2. Враховуючи  різний  характер цитотоксичної дії  амідів і діолів, а також різний механізм їх кріозахисної дії і проникності крізь мембрани  клітин, рекомендуються наступні способи зниження їх цитотоксичності і реалізації їх потенційної кріопротекторної активності при кріоконсервуванні біологічних об'єктів: введення і інкубацію клітин з ними проводити при  температурах, близьких до нуля,  використовувати аміди в комбінації з діолами  у співвідношенні 1:2,  у кріозахисніх середовищах застосовувати білкові добавки, наприклад, альбуміни.

3. При кріоконсервуванні  сперми півнів рекомендується  використовувати наступні умови підготовки клітин  до заморожування: температура введення та  експозиції з ДМФА і ДМАЦ не повинна перевищувати 4 0С. Час експозиції до заморожування не більший  15-20 хв. Оптимальна кінцева концентрація амідів у суспензії не більша  0,75 - 1 М.  Введення діолів у суспензії сперматозоїдів можна проводити при 20 0С. Час експозиції до заморожування не більший  30 хв. Оптимальна концентрація в суспензії клітин для  ЕГ  і 1,2-ПД - 1 М.

4. При кріоконсервуванні сперми півнів рекомендується використовувати кріозахисне середовище наступного складу ( г/100 мл Н2О):  глутамат натрій – 2,85; фруктоза (чи глюкоза) – 0,5; інозит – 0,25; ацетат магнію – 0,07; ацетат калію – 0,5; ПВП –12000 – 0,2;  овомукоід (чи яєчний альбумін) – 0,3. Осмотичність 400 мОсмоль;  рН 6,9; іонна сила – 0,200.

5. Рекомендується використовувати наступний багатоетапный режим охолодження і заморожування сперми півнів, що забезпечує відновлення максимального числа функціонально повноцінних клітин   при  кріоконсервуванні в пластикових  ампулах  чи пайєтах з кріопротектором ДМФА в концентрації 1 М: швидкість охолодження  від 4 0С  до –8  0С  - 1-3 0С/хв; 1-2 хв витримка на плато кристалізації; далі охолодження до –25 0С зі швидкістю 25-30 0С/хв; до –80 0С зі швидкістю 65-70 0С/хв з наступним зануренням у рідкий азот.

6. Заморожування в гранулах доцільно використовувати при кріоконсервуванні сперми окремих півнів. При цьому величина   необхідної температури металевої  підкладки, яка гідрофобізується  кремнеорганічним звологувачем ГКЖ-94,  залежить від того, який кріопротектор використовується: якщо ДМАЦ чи ДМФА, температура повинна бути –140 0С, якщо використовуються  кріопротектори МАЦ, ДМФА, ЕГ, 1,2-ПД чи їх комбінація, температура підкладки повинна бути –50 0С. 

7. Виявлена   кореляція між кріопротекторною активністю речовин і  їх кріоскопічною константою дозволяє рекомендувати цю фізико-хімічну характеристику   для використання  в доекспериментальному скринінгу ефективних кріопротекторів у доповненні до інших показників  їх гідрофільності.

Список опублікованих робіт за темою дисертації:

1. Шраго М.И., Новиков, А.Н., Ханина Л.А., Линник Т. П. Криопротекторы и криоконсерванты (основные направления исследований) // Криобиология . – 1985.- вып. 3. – С. 8-13. (Запропоновано  математичне моделювання залежності кріозахисної  активності кріопротекторів від їх структури.)
2. Линник Т.П., Новиков А.Н., Рындин В.Ф., Хайкин Р.К., Терещенко А.В.  Прогнозирование эффективных криопротекторов методом КССА при криоконсервировании спермы петуха // Криобиология. – 1990.-вып.3.-С.41-45. (Проведено математичне моделювання залежності “структура-  кріозахисна активність кріопротекторів”, проаналізовано одержані результати.)
3. Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Новиков А.Н., Линник Т.П. Криоконсервирование спермы петухов // Птицеводство.- 1990. - № 43.-С.14-17. (Ідентифіковано  кріопротектори, обгрунтовано їх використання, приймала участь у розробці метода кріоконсервування.)
4. Новиков А.Н., Кулешова Л.Г., Линник Т.П. Механизм роста кристаллов льда в модельных системах // Биофизика. – 1991. –36, № 1. – С.122-127. (Ідентифіковано  кріопротектори та проведено математичне моделювання  залежності біофізичного процесу, що вивчався, від фізико-хімічних параметрів кріопротекторів.)
5. Новиков А.Н., Вепринцев, Б.Н., Утешев В.К.,Смолихина Т.Н., Линник Т.П. Токсическое действие криопротекторов на зародышей вьюна и лягушек // Пробл. криобиологии. – 1991. - № 4. – С.16-21. (Ідентифіковано  кріопротектори та їх фізико-хімічні властивості, вивчено вплив  структури кріопротекторів на їх цитотоксичність.)
6. Сахацкий М.І., Терещенко О.В., Артеменко О.Б., Новіков О.М., Ліннік Т.П. Токсичність і кріозахисна дія деяких кріщпротекторів при заморожуванні сперми півнів // Птахівництво. – 1992.- С.20-24. (Ідентифіковано  кріопротектори та їх фізико-хімічні властивості, вивчено вплив  структури кріопротекторів на їх цитотоксичність.)
7. Новиков А.Н., Вепринцев, Б.Н., Утешев В.К.,Смолихина Т.Н., Линник Т.П. Влияние переохлаждения и криопротекторов на внутриклеточную кристаллизацию в зародышах вьюна // Пробл. криобиологии .- 1992. - № 3.- С.27-33. (Проведено математичне моделювання залежності досліджуваних процесів від структури та фізико-хімічних характеристик кріопротекторів.)
8. Верховская  Л.З., Луговой В.И., Ханина Л.А., Голендер В.Е., Линник Т.П. Применение вычислительных методов при целенаправленном поиске новых криопротекторов // Химико-фармацевтический журн.- 1992. – 26, № 2. – С.57- 59. (Проведено  вибірку кріопротекторів та їх дескриптерів для розрахунку залежності  кріозахисної  активності речовин від їх структури, проаналізовано одержані результати.)
9. Новиков А.Н., Пичугин Ю.И., Линник Т.П.  Влияние криопротекторов и ряда органических добавок на процесс рекристаллизации льда в модельных системах // Пробл. криобиологии. – 1992.- № 2.-С.20 – 23. (Проведено математичне моделювання залежності досліджуваних процесів від структури кріопротекторів, проведено аналіз одержаних результатів.)
10. Линник Т.П.  Подходы и принципы создания криозащитных сред для спермы птиц и млекопитающих // Пробл. криобиологии. – 1993. - № 4. – С.40-48.
11. Линник Т.П., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. Влияние белковых добавок к криозащитной среде на сохранность спермиев петухов при криоконсервировании // Пробл.криобиологии. – 1996. - № 2.- С.35-39. (Запропоновано та експериментально доведено  ідею про позитивний  вплив білків  у кріозахисному середовищі на життєздатність сперміїв, проведено статистичний анализ і узагальнено результати.)
12. Линник Т.П. Амиды алифатических кислот– эффективные криопротекторы. I. Физико-химические свойства соединений ряда амидов // Пробл. криобиологии. – 1998. - № 3. – С.21-28.
13. Межидов С.Х., Моисеев В.А., Линник Т.П.  Влияние концентрации различных веществ на соотношение форм гемоглобина внутри эритроцитов // Вестник проблем биологии и медицины. – 1998. - № 20. – С. 62-65. (Вивчено методом УФ-спектроскопії вплив кріопротекторів  на конформацію внутрішньоклітинних білків.)
14. Линник Т.П.  Амиды алифатических кислот – эффективные криопротекторы. II. Криозащитные свойства соединений ряда амидов // Пробл. криобиологии. – 1999. - № 2. – С. 22-32.
15. Kopeika J.E., Bibenko O.V, Linnik T.P., Kopeika E.F.The influence of DMSO  (Dimethyl sulfoxide) on the sperm genome of Misgurnus fossilis // Cryobiology.- 1999. – 39. – P. 318. (Отримано  фракції ДМСО різного ступеню очистки, проведено їх ідентифікація.)
16. Линник Т.П., Грищенко В.И., Артеменко А.В., Терещенко А.В.  Влияние осмотичности криозащитной среды на сохранность спермиев петухов при криоконсервировании // Пробл. криобиологии. – 2000. - № 2. – С.86 – 93. (Визначено   діапазон осмотичності кріозахисного середовища , в якому сперматозоїди зберігають  свою життєздатність до і після заморожування, проведено статистичний анализ і узагальнено результати.)
17. Линник Т.П., Грищенко В.И., Артеменко А.В., Терещенко А.В. Влияние длительного низкотемпературного хранения спермы петухов на ее оплодотворяющую способность // Пробл. криобиологии. – 2000. - № 3. – С. 64-71. (Доведено різницю  в стійкості  сперми півнів різних порід до дії низьких температур, проаналізовано одержані результати.)
18. Линник Т.П.. Бизикина О.В.  Криоконсервирование спермы петухов.I.        Цитотоксичность диолов и амидов // Пробл. криобиологии. -  2001. - № 2. – С. 72 – 79. (Вивчено  цитотоксичність амідів і діолів у залежності від умов  інкубації та від  структури кріопротекторів, проанализовано отримані результати, запропоновано механізм їх пошкоджуючої дії)
19. Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование спермы петухов.II.Криозащитная активность диолов и амидов // Пробл. криобиологии. -  2001. - № 4. – С. 43-51.  (Досліджено вплив  структури амідів і діолів на їх кріозахисну активність, проведено статистичний анализ і узагальнено результати, запропоновано механізм їх дії.)
20. Линник Т.П., Бизикина О.В. Цитотоксичность и криопротекторная активность диолов, амидов и их смесей при криоконсервировании спермы петухов // Пробл. криобиологии. – 2001. - № 3 . – С.50. (Запропоновано ідею використання сумішей кріопротекторів на базі амідів і діолів, перевірено експериментально, проведено аналіз одержаних результатів.)
21. Бизикіна О.В., Артеменко О.Б., Ліннік Т.П. Використання різних класів кріопротекторів при кріоконсервуванні сперми півнів // Птахівництво. –  2001, вип.51. - С.14-18. (Запропоновано ідею використання сумішей кріопротекторів на базі амідів і діолів, перевірено експериментально.)
22. Бизикина О.В., Линник Т.П. Криоконсервирование спермы петухов. III. Цитотоксичность и криопротекторная активность смеси N,N-диметилформамида с диолами // Пробл.криобиологии. – 2002.- № 1. – С.39-44. (Запропоновано ідею використання суміші кріопротекторів на базі амідів і діолів, перевірено експериментально, проаналізовано одержані результати.)
23. Гордієнко О.І., Ліннік Т.П. Механізми проникання неелектролітів низки діолів крізь мембрани еритроцитів // Вісн. ХНУ № 568 - Біофіз. вісн. – 2002. – вип. 2(11). – С. 53-58. (Ідентифіковано кріопротектори ряду діолів та їх фізико-хімічні і структурні параметри.)
24. Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Новиков А.Н., Линник Т.П. Разработка защитной среды для консервации спермы петухов // Науч-техн. Бюл. УкрНИИП, Харьков, 1988.-  вып.24. – С.29-32. (Проведено математичне планування оптимізації складу  кріозахисного середовища.)
25. Пичугин Ю.И., Новиков А.Н., Линник Т.П. Зависимость цитотоксичности и криопротекторной активности диолов от их структуры и физико-химических свойств. II. Криоконсервирование спермы карпа // Сб науч. тр. “Криоконсервирование клеток и тканей”, Харьков,1989. – С.21-28. (Проведено кореляцію між кріозахисною активністю діолів і їх фізико-хімічними параметрами, встановлено залежність цитотоксичності діолів від їх гідрофобності.)
26. Линник Т.П., Новиков А.Н., Терещенко А.В., Сахацкий Н.И., Артеменко А.Б. Криконсервирование спермы петухов на основе смеси криопротекторов амид - гликоль // Сб. науч. тр. “Патофизиологические аспекты действия холода на организм”, Харьков,1989. – С.64-68. (Експериментально доведено позитивний ефект використання  суміші кріопротекторів на базі амідів і діолів.)
27. Пичугин Ю.И., Линник Т.П. Прогноз использования ряда кетоспиртов в качестве криопротекторов // Сб.науч.тр. “Патофизиологические аспекты действия холода на организм”, Харьков,1989. – С.11-15. (Вивчено залежність   кріозахисної  активності кетоспиртів від їх структури.)
28. Новиков А.Н., Линник Т.П.  Влияние физико-химических свойств криопротекторов на скорость роста и размер кристаллов льда в модельных системах // Сб.науч.тр. “Физико-химические свойства и биологическое действие криопротекторов”, Харьков,1990. -–С.99-103. (Проведено математичне моделювання залежності швидкості росту кристалів  льоду  від структури кріопротекторів.)
29. Новиков А.Н., Линник Т.П., Олейник С.Т., Белецкая А.В. Влияние криопротекторов и органических добавок на характеристики рекристаллизационного процесса “стеклофаза-кристалл” //Рукопись деп. в ВИНИТИ 20.11.89. № 6949-1389, 1989 – 14 с. (Проведено математичне моделювання впливу структури та фізико-хімічних властивостей кріопротекторів на  процес, який вивчався.)
30. Атлас инфракрасных спектров криоконсервантов / Костяев А.А., Сведенцев Е.П., Гордиенко Е.А., Конопельцев И.К., Розанов Л.Ф., Нардид О.А., Линник Т.П., Останков М.В., Кротов Ю.В., Муратов В.В. – Сыктыквар: Ин-т физиологии Коми НЦ  РАН, 2001.- 72 с. (Ідентифіковано  кріопротектори та їх фізико-хімічні параметри, приймала участь в інтерпретації ІЧ-спектрів.)
31. А.с.СССР № 1335238  “Способ контроля насыщения биологической ткани жидким криопротектором” / Линник Т.П., Чуйко В.А., Новиков А.Н., Карпенко Л.Г. -  Опубл. в Б.И., 1987, № 33, С.21.
32. А.с.СССР № 1524882 “Способ криоконсервирования спермы птиц” /       Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Новиков А.Н., Линник Т.П. - Опубл. в Б.И.,1989, №44, С.17
33. Терещенко А.В., Шныров В.Л., Линник Т.П. Влияние криопротекторов на теплопоглощение суспензии сперматозоидов петухов // Тез.докл. республ. науч. конф. “Состояние и перспективы развития биотехнологии в животноводстве”, Харьков, 1988. – С.21-22 .
34. Линник Т.П., Верховская Л.З., Луговой В.И., Пичугин Ю.И.  Прогнозирование новых криопротекторов методом КССА // Тез.докл. VI съезда фармакологов УССР “Фармакология, состояние и перспективы исследований”, Харьков, 1990. – С.184-185 .
35. Терещенко А.В., Сахацкий Н.И., Новиков А.Н., Линник Т.П.,  Артеменко А.Б. Режим криоконсервирования спермы петухов // Тез.докл. республ. конф. “Актуальные проблемы птицеводства Украины”, Харьков, 1990. – С.7-8.
36. Линник Т.П., Пичугин Ю.И.   Прогнозирование эффективных криопротекторов в ряду диолов и амидов методом КССА // Тез.докл. II международ. конф. “Успехи современной криобиологии”, Харьков, 1992. – С. 95-96.
37. Pichugin J.I., Linnik T.P., Novikov A.N., Levchenko E.N. On the mechanism of action of low and high molecular cryoprotectants // Abstr.confer. “Theoretical basis of cryopreservation”, Hrades Kralove, Czech and Slovak Federal Republic, 1992. – P. 9.
38. Линник Т.П., Пичугин Ю.И.  Подходы и принципы создания многокомпонентных криозащитных сред для спермы птиц // Тез. докл. I съезда общества криобиологии и криомедицины, Харьков, 1995. – С. 136-137.
39. Пичугин Ю.И., Линник Т.П.  Итоги и перспективы поиска новых эндоцеллюлярных криопротекторов // Тез. докл. I съезда общества криобиологии и криомедицины, Харьков, 1995. – С. 202 – 203.
40. Lugovoi V.I., Stribul T.F., Linnik T.P. The dynamics of izoenzyme amylase compound change in the endosperm of maize sprouting seeds after low temperature effect // Abstr. 34th Annual Meeting of the Society for Cryobiology.- Barcelona, 1997. – P.113.
41. Kopeika J.E., Bibenko O.V, Linnik T.P.,  Kopeika E.F..The influence of DMSO  (Dimethyl sulfoxide) on the sperm genome of Misgurnus fossilis // Abstr. 36 th Annual Meeting of the Society for Cryobiology.- Marseille, France, 1999. – P. 79.
42. Гордієнко О.І., Ліннік Т.П. Проникність мембран  еритроцитів  до неелектролітів низки діолів // Тез.допов. ІІІ  з’їзду  Українського біофізичного товариства, Львів. – 2002.- С.116.

Анотації

Ліннік Т.П. Фі­зи­ко-­хі­мі­ч­ні фа­к­то­ри кріопошкоджень  і крі­озахисту спе­р­ма­то­зо­ї­дів пів­нів у ци­к­лі ни­зь­ко­те­м­пе­ра­ту­р­но­го кон­се­р­ву­ван­ня – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю  03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків – 2002.

У роботі досліджений вклад фізико-хімічних факторів кріопошкоджень, що чинять вплив на структурно-функціональний стан сперматозоїдів півнів на етапах їх кріоконсервування, і на підставі цього розроблені науково-обгрунтовані  підходи до створення ефективних способів кріозахисту клітин.

Отримані порівняльні дані цитотоксичної дії на сперматозоїди півнів  і кріозахистної ефективності двох гомологічних рядів хімічних сполук амідів і діолів (16 речовин).  Виявлені ефективні   кріопротектори в кожному з вивчених  класів сполук у відношенні даного об'єкта. Запропоновані і вивчені способи зниження їх цитотоксичності.  Запропоновані та обговорюються  аспекти механізмів пошкоджуючої дії діолів і амідів та їх кріопротекторної активності.

Досліджено вплив осмолярності  та іонної сили кріозахисного середовища  на життєздатність сперматозоїдів. Визначений діапазон фізико-хімічних властивостей кріозахисного середовища, у якому клітини  максимально зберігаються до і після кріоконсервування.

Досліджено вплив режимних параметрів та кінцевої температури охолодження  на життєздатність сперматозоїдів. Показано, що основним фізико- хімічним фактором, що ушкоджує сперматозоїди,  є температурно-осмотичний шок, який  викликає руйнування акросомальних структур сперматозоїдів у  діапазоні температур  від –3 до –8 0С  при швидкості охолодження  понад  15 0С/хв.

На підставі проведених досліджень розроблений метод кріоконсервування сперми півнів та перевірена його ефективність при низькотемпературному   зберіганні  сперми півнів різних порід протягом 9- 10 років.

Ключові слова: кріоконсервування, сперматозоїди півнів, кріопротектори, аміди, діоли, цитотоксичність, кріозахисна активність, кріозахисне середовище, фізико-хімічні властивості, структура молекул, швидкість охолодження.

Линник Т.П. Физико-химические факторы криоповреждений и криозащиты сперматозоидов петухов в цикле низкотемпературного консервирования. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков – 2002.

В работе исследован вклад физико-химических факторов криоповреждений, оказывающих влияние на структурно-функциональное состояние сперматозоидов петухов на этапах криоконсервирования, и на основании этого разработаны научно-обоснованные подходы к разработке эффективных способов криозащиты клеток.

Впервые получены сравнительные данные цитотоксического действия на сперматозоиды петухов и криозащитной эффективности двух гомологических рядов химических соединений амидов и диолов (16 веществ). Установлено, что в ряду изученных амидов менее цитотоксичгыми являются ДМФА, МАЦ и ДМАЦ, в ряду диолов – ЭГ, 1,2-ПД и 2,3-БД. Впервые выявлено, что  зависимость повреждающего действия диолов и амидов на сперматозоиды петухов по-разному зависит от температуры инкубации. Количество сперматозоидов с морфологическими аномалиями в присутствии амидов с повышением температуры монотонно увеличивается, в то время как в присутствии диолов - проходит через максимум при 15 0С и уменьшается с последующим ростом температуры. Показано, что повреждающее действие диолов  на сперматозоиды в отличие от амидов зависит от размеров их молекул – чем больше объем молекул даже при одинаковой молекулярной массе  диолов (изомеры бутандиола и пропандиола), тем выше их цитотоксический эффект. Экспериментально доказано, что в общую цитотоксичность диолов основной вклад вносит осмотический фактор, в то время как  цитотоксическое действие амидов  имеет преимущественно химическую природу, обусловленную их гидрофобностью и высокой донорно-акцепторной способностью.

Впервые выявлено, что белковые добавки к криозащитной среде снижают токсическое действие дизамещенных амидов на сперматозоиды.

Установлено, что при криоконсервировании спермы петухов лучшими криопротекторами  в ряду амидов и диолов  являются менее цитотоксичные вещества. По степени уменьшения  криопротекторной активности вещества распределяются следующим образом: ДМФА > ДМАЦ > 1,2 –ПД > МАЦ > ЭГ > 2,3-БД.

Показано, что сперматозоиды петухов устойчивы к изменению осмотичности внеклеточной среды в диапазоне от 150 до 600 мОсмоль. При этом наблюдаемое снижение подвижности в области гипертонии обратимо, подвижность восстанавливается при переносе в изотонические условия. Критической осмотичностью среды для сперматозоидов петухов в области гипотонии,  в условиях которой  50 % клеток  имеют поврежденную акросому, является 70 мОсмоль. Установлено, что осмотичность  является  доминирующим физико-химическим свойством криозащитной среды для успешного криоконсервирования сперматозоидов, ее оптимальное значение находится в области умеренной гипертонии по отношению к семенной плазме спермы и равно 395-400 мОсмоль.  Впервые определено оптимальное значение ионной силы криозащитной среды, которое составляет 0,217 моль/л.

Установлены три критические температурные зоны действия основных факторов криоповреждений на сперматозоиды петухов:   от –3 до –8 0С;    от –15 до –25 0С; от –60 до –80 0С, уровень повреждений клеток в которых зависит  от скорости охлаждения. При скорости охлаждения меньше 10 0С/мин   основная часть клеток (50-60 %) повреждается  в области температур от –15 до –25 0С. При скорости охлаждения  выше 15 0С/мин  -   в диапазоне  от  –3  до –8 0С, что свидетельствует о том, что основным повреждающим фактором для сперматозоидов является температурно-осмотический шок. Последствия его воздействия уменьшаются при снижении скорости охлаждения в данном диапазоне температур.

Установлено, что хранение спермы петухов в глубокозамороженном состоянии в условиях криобанка в течение 9-10 лет  не оказывает отрицательного влияния на морфологическую сохранность и функциональную активность  сперматозоидов. Обнаружено,  что устойчивость  спермы петухов разных пород к действию низких температур существенно различается, что приводит к необходимости корректировки метода криоконсервирования в каждом конкретном случае.

Ключевые слова: криоконсервирование, сперматозоиды петухов, криопротекторы, амиды, диолы, цитотоксичность, криозащитная активность, криозащитная среда, физико-химические свойства, структура молекул, скорость охлаждения.

Linnik T.P. Physical and Chemical  Factors of Cryodamage and Cryoprotection for  Fowl Spermatozoa in the Cycle of Low Temperature Preservation.- Manuscript.

Thesis for scientific degree of doctor’s biological sciences  on the specialіty 03.00.19 - cryobiology.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkіv, 2002.

In the work we have investigated  the action of physical and chemical  cryodamage factors, affecting  the structural and functional state of fowl spermatozoa at the stages of their  cryopreservation, and at this base  there have been elaborated  the scientifically substantiated approaches  to efficient ways for  cell cryoprotection.

There were obtained the comparative data for cytotoxic effect on fowl spermatozoa and cryoprotective efficacy  of two homologous series for amides and diols chemical  compounds (16 substances). There were revealed  the efficient cryoprotectants  in each of studied  compounds’ classes as for the given object.   We have proposed and studied the ways for decreasing  their cytotoxicity. The mechanism aspects  of diols and amides’  damaging effect and their cryoprotective activity  have been offered and discussed.

There was studied  the effect of osmoticity  and ionic power  of cryoprotective medium on spermatozoa viability. We have determined  the range  of physical and chemical  properties of cryoprotective medium,  within  which the cells are most stable  under  positive and low temperatures.

The effect of the regimen’s parameters  and final cooling temperature  on spermatozoa viability was investigated. It has been demonstrated that the temperature-osmotic shock is the main impairing  physical and chemical factor, damaged the acrosome structures in spermatozoa in the temperature range  –3 ÷ –8 0С with the cooling rate higher than 15C/min.

Basing on  the investigations, carried-out there has been elaborated the method for fowl sperm cryopreservation, as well as we have tested  its efficacy  under  low temperature storage within 10 years of fowl sperm of various species.

Key words: cryopreservation, fowl spermatozoa, cryoprotectants, amides, diols, cytotoxicity, cryoprotective  activity, cryoprotective medium, physical and chemical characteristics,  molecule structure, cooling rate .