Рис. 4. Фрагмент комп’ютерного аналізу ізолятів SRY-гена сільськогосподарських тва-
рин із баз даних EMBL та GenBank, проведеного за допомогою пакету приклад-
них програм GeneBee. Ступінь гомології для створеного праймера SRY1 дорів-
нює 100 %. BBSDRYG – європейський бізон; BT15569, BTSDRYG – велика
рогата худоба; OADSRYC – вівця; CHSEDERY – коза.
ΔG і є термодинамічно невигідними. Таким чином, на підставі існуючих та модифікованих прин-ципів конструювання тест-систем для ПЛР-детекції інфекційних агентів, створений набір прайме- рів для мультиплексної ПЛР характеризується не тільки 100 % рівнем гомології, а й відсутністю самокомплементарних фрагментів у продуктів ПЛР.
Послідовності праймерів та довжини ампліконів для зовнішньої та внутрішньої пар прайме-рів наведено у табл. 2.
Таблиця 2
Набір праймерів SRY1-4 для визначення статі ембріонів великої рогатої худоби, вівці, кози та свині
Для апробаціїї сконструйованих праймерів SRY1-4 на першому етапі було використано лім-фоцити периферичної крові ВРХ, а на другому етапі – 10 ембріонів ВРХ та їх біоптати. Розроблені праймери дозволили правильно визначити стать всіх досліджених тварин.
На рис. 5 представлено електрофореграму ПЛР-аналізу для двох незалежних систем прайме-рів SRY1-SRY4 та SRY2-SRY3. Наявність смуг у відповідних доріжках вказує на присутність SRY-гена у клінічному зразку і, отже, на XY-каріотип.
Рис. 5. Електрофореграма продуктів ПЛР-детекції SRY-гена після фарбування 1 % ага-
розного гелю бромистим етидієм з наборами зовнішніх SRY1-SRY4 (доріжки 2,
3, 4) і внутрішніх SRY2-SRY3 (доріжки 5, 6, 7) праймерів; розмір ампліконів ста-
новить 416 і 176 пар нуклеотидів відповідно. 1, 8 – маркери молекулярної ваги:
1 – ДНК л, оброблена рестриктазами Hind III і EcoR1; 8 – ДНК λ, оброблена рест-
риктазою Hind III; 2, 4 – ДНК з лімфоцитів корови; 3 – ДНК з лімфоцитів бика; 5,
6 – ДНК з ембріонів великої рогатої худоби; 7 – негативний контроль. Наявність
ПЛР-продукту в доріжках 3 і 6 вказує на присутність Y- хромосоми у зразку.
В И С Н О В К И
1. У дисертації наведено нове вирішення проблем раннього виявлення збудника лейкозу великої
рогатої худоби та визначення статі преімплантаційних ембріонів шляхом створення високоспе-
цифічних молекулярно-генетичних тест-систем. Існуючі в Україні серологічні та імунологічні
методи детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби дозволяють детектувати ВЛ ВРХ у тва-
рин на стадії синтезу антитіл до вірусних антигенів, починаючи тільки з шести-дванадцяти мі-
сяців. В той же час за допомогою цих методів неможливо здійснювати раннє виявлення тва-
рин-носіїв ВЛ ВРХ із скритим (латентним) характером вірусоносійства. Тривалі спостережен-
ня за тваринницькими господарствами протягом 3-4 років показують, що за допомогою існую-
чих в Україні традиційних профілактичних заходів та методів боротьби з лейкозом великої ро-
гатої худоби неможливо повністю викоренити це захворювання. Як правило, відокремлення
РІД-позитивних тварин, вакцинопрофілактика призводять до тимчасового покращення показни-
ків стада щодо вірусу лейкозу, і через деякий час у стаді з’являються нові тварини, хворі на
лейкоз. З іншого боку, в Україні не існує тест-систем для виявлення інфекційних агентів у спер-
мі биків-плідників, ембріонах, середовищах для культивування ембріонів.
2. Для вирішення проблем раннього виявлення вірусу лейкозу великої рогатої худоби, детекції
статі преімплантаційних ембріонів сільськогосподарських тварин використано методи поліме-
разної ланцюгової реакції, комп’ютерного аналізу генів із баз даних секвенованих послідов-
ностей нуклеїнових кислот.
3. За допомогою комп’ютерного аналізу послідовностей секвенованих ізолятів вірусу лейкозу ве-
ликої рогатої худоби із баз даних EMBL, GenBank та DDBJ ідентифіковано висококонсерватив-
ні та гіперваріабельні ділянки геному ВЛ ВРХ. Визначено фрагменти геному інфекційного
агента зі 100 %-им ступенем гомології для існуючих ізолятів.
4. Створено чотири тест-системи для однораундової та одна для двораундової ПЛР-детекції прові-
русної ДНК ВЛ ВРХ, набори праймерів яких мають 100 %-ий ступінь гомології і характеризу-
ються 100 %-ою специфічністю для всіх відомих ізолятів гена env ВЛ ВРХ. Удосконалено ме-
тод ПЛР-аналізу для раннього виявлення тварин-носіїв ВЛ ВРХ, яких неможливо детектувати
за допомогою існуючих серологічних методів діагностики.
5. Виявлено висококонсервативні фрагменти Y-специфічного гена SRY головних видів сіль-
ськогосподарських тварин: великої рогатої худоби, вівці, кози, свині та коня. Філогенетичний
аналіз показав, що SRY-ген свині та особливо коня еволюційно віддалений від SRY-гена
тварин родини Bovidae. Зважаючи на це, розроблено універсальну тест-систему для ПЛР-де-
текції статі преімплантаційних ембріонів ВРХ, вівці, кози та свині. Сконструйовані набори
праймерів SRY1-4 характеризуються 100 %-ою специфічністю для детекції статі ембріонів
ВРХ, вівці, кози та 96 %-ою специфічністю для детекції статі ембріонів свині.
6. Розроблені набори праймерів SRY1-4 можна використовувати для проведення стандартного ва-
ріанту гніздової ПЛР, а також як чотири незалежні набори праймерів для однораундової ПЛР-
детекції статі. Створені пари праймерів дозволили правильно визначити стать усіх досліджених
тварин.
7. Теоретичне та експериментальне порівняння створених та існуючих ПЛР-тест-систем для де-
текції ВЛ ВРХ показало, що всі створені набори праймерів мають більш високий ступінь гомо-
логії (100 % для всіх відомих ізолятів), а отже, більш високі специфічність та чутливість на від-
міну від існуючих аналогів.
8. Удосконалено критерії якості та оцінки існуючих ПЛР-тест-систем для молекулярно-генетич-
чних досліджень. Показано, що ступінь гомології праймерів є ключовим параметром, який ви-
значає специфічність, чутливість і точність ПЛР-аналізу. В той же час доведено необхідність
при конструюванні праймерів брати до уваги можливість утворення вторинної структури одно-
нитковим ампліконом.
9. За допомогою аналізу механізму процесів денатурації-ренатурації ДНК удосконалено принци-
пи конструювання молекулярно-генетичних тест-систем для ПЛР-аналізу.
10. На основі розроблених праймерів для детекції статі та виявлення ВЛ ВРХ створено тест-систе-
му для мультиплексної ПЛР, тобто одночасної ідентифікації статі та виявлення ВЛ ВРХ у гено-
мі преімплантаційних ембріонів.
Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації:
1. Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Нехороших Е.М., Бусол В.А., Цымбал В.И. Детекция виру-
са лейкоза крупного рогатого скота с использованием полимеразной цепной реакции // Вісник
аграрної науки. – 1999. – № 9. – С. 35-39.
2. O. Limanskaya, A. Limansky. Universal test-system for PCR sexing of cattle, sheep, goat and pig em-
bryos // Journal Biology of Reproduction. – 1999. – Vol. 60, Suppl. 1. – P. 195.
3. Лиманська О.Ю., Лиманський О.П. Тест-система для генотипування ембріонів великої рогатої
худоби // Биологический вестник. – 1999. – Т. 3, № 1-2. – С. 102-106.
4. Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Безуглый Н.Д. Определение пола преимплантационных эмб-
рионов сельскохозяйственных животных с помощью полимеразной цепной реакции // Биотех-
нология. – 2000. – № 2. – С. 66-72.
5. Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. Тест-система для выявления виру-
са лейкоза крупного рогатого скота полимеразной цепной реакцией // Ветеринария. – 1999. –
№ 6. – С. 27-32.
6. Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Безуглый Н.Д. Конструирование ПЦР-тест-системы для оп-
ределения пола эмбрионов сельскохозяйственных животных // Науково-технічний бюллетень
Інституту тваринництва. – 1999. – № 75. – C. 160-165.
7. Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. Выявление вируса лейкоза круп-
ного рогатого скота полимеразной цепной реакцией // Ветеринарна медицина. – 1998. –
вып. 74. – С. 35-44.
8. Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. Тест-система для выявления ви-
руса лейкоза крупного рогатого скота полимеразной цепной реакцией // Збірник матеріалів
міжнародної науково-практичної конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобут-
ки та проблеми”. – Харків (Україна). – 1997. – С. 108-112.
9. Бабкин В.Ф., Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. ПЦР-детекция виру-
са лейкоза крупного рогатого скота // Збірник матеріалів ІІ Міжнародної конференції “Вико-
ристання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекцій-
них дослідженнях”. – Одеса (Україна). – 1998. – С. 75-77.
10. Бабкин В.Ф., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Нехороших Е.М., Безуглый Н.Д. Определение
пола эмбрионов сельскохозяйственных животных // Збірник матеріалів ІІ Міжнародної конфе-
ренції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у гене-
тико-селекційних дослідженнях”. – Одеса (Україна). – 1998. – С. 77-78.
11. Лиманская О.Ю. Полимеразная цепная реакция в ветеринарной медицине // Науково-практич-
ний семінар “Лабораторна ветеринарна медицина: фізико-хімічні методи досліджень”. – Рівне
(Україна). – 1998. – С. 138-148.
АНОТАЦІЇ
Лиманська О.Ю. Розробка молекулярно-генетичних тест-систем для ранньої детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби та визначення статі преімплантаційних ембріонів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2001.
Дисертацію присвячено проблемі створення молекулярно-генетичних тест-систем для ран-ньої детекції збудників інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин та детекції статі преімплантаційних ембріонів. Удосконалено основні критерії оцінки тест-систем для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та принципи конструювання праймерів. Показано, що ключовим пара-метром, який визначає специфічність і точність ПЛР-аналізу, є ступінь гомології праймерів. Скон-струйовано набори праймерів для ранньої детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби на основі множинного вирівнювання послідовностей env гена відомих ізолятів із баз даних EMBL/GenBank та термодинамічного аналізу праймерів та ампліконів. За допомогою теоретичного та експеримен-тального порівняння створених та існуючих наборів праймерів показано, що сконструйовані прай-мери мають більш високі специфічність і точність порівняно з існуючими аналогами. Створено універсальну ПЛР-тест-систему для визначення статі ембріонів великої рогатої худоби, вівці, кози та свині.
Ключові слова: детекція статі, ембріон, множинне вирівнювання, ступінь гомології, SRY-ген, ген env, амплікон, лейкоз, провірусна ДНК.
Лиманская О.Ю. Разработка молекулярно-генетических тест-систем для ранней детекции вируса лейкоза крупного рогатого скота и определения пола преимплантационных эмбрионов. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2001.
Диссертация посвящена проблеме конструирования молекулярно-генетических тест-систем для ранней детекции возбудителей инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных и определения пола преимплантационных эмбрионов. В обзоре литературы приведены общие сведе-ния о медленных инфекциях сельскохозяйственных животных, к числу которых относится лейкоз крупного рогатого скота (КРС). Дан сравнительный анализ серологических и молекулярно-генети-ческих методов детекции вируса лейкоза (ВЛ) КРС, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). Рассмотрены принципы, механизм, различные модификации и основные характе-ристики ПЦР. Изложены преимущества и возможности использования метода ПЦР при решении биотехнологических задач в области ветеринарной медицины и животноводства. Дана характерис-тика различных методов детекции пола эмбрионов, а также генов, ответственных за образование мужского пола организма. Проведен сравнительный анализ тест-систем, основанных на ПЦР-де-текции Y-специфических генов SOX, SRY и аллель-специфических генов ZFX/ZFY, для опреде-ления пола преимплантационных эмбрионов сельскохозяйственных животных. Усовершенствова-ны основные принципы конструирования тест-систем для ПЦР. Показано, что ключевым парамет-ром, определяющим надежность, точность и специфичность ПЦР-анализа, является степень гомо-логии праймеров. Сконструированы наборы праймеров BLV1-4 для ранней детекции ВЛ КРС на основе проведения множественного выравнивания секвенированных последовательностей гена env различных изолятов ВЛ КРС из баз данных EMBL/GenBank и последующего статистического анализа с учетом термодинамических характеристик праймеров. Построены теоретические профи-ли плавления праймеров BLV1-4, определены их температуры плавления и, следовательно, темпе-ратуры отжига с учетом ионной силы реакционной смеси. Продемонстрирована зависимость тем-ператур отжига праймеров от степени гомологии. Показано, что наличие каждого “ошибочного” (неспаренного) основания в комплексе праймер-продукт ПЦР приводит к понижению темпера-туры отжига праймера на ~ 4 оС. Поскольку ширина плавления олигонуклеотидов длиной 20-30 нуклеотидов составляет 8-10 оС, в случае двух и более некомплементарных нуклеотидов затруд-нен отжиг праймера на ампликоне. Это может приводить к ложноотрицательному результату ана-
лиза. На основе проведения компьютерного анализа с возрастающим количеством известных сек-венсов гена env по мере поступления информации о новых изолятах ВЛ КРС в базы данных EMBL и GenBank доказаны достоверность и корректность выбора праймеров. Показано, что четыре на-бора праймеров, образованные комбинацией олигонуклеотидов BLV1-4, можно использовать как четыре независимые тест-системы для выявления ВЛ КРС с помощью однораундовой, а также двухраундовой ПЦР. Проведено теоретическое и экспериментальное сравнение сконструирован-ных и существующих наборов праймеров для детекции ВЛ КРС. Показано, что праймеры BLV1-4 имеют более высокую степень гомологии (100 % для всех известных изолятов ВЛ КРС) и, следо-вательно, более высокую точность в отличие от существующих. Обоснована необходимость выбо-ра праймеров из консервативных фрагментов генома вируса лейкоза с высокой степенью гомо-логии. Изучено влияние неспецифических комплексов, которые могут образоваться между прай-мером и ампликоном, а также возможных вторичных структур ампликона на результат ПЦР-ана-лиза. Проведена оптимизация параметров ПЦР для детекции ВЛ. На основе компьютерного анали-за изолятов гена α-лактальбумина КРС разработана тест-система для внутреннего контроля амп-лификации, которая может быть использована при проведении ПЦР-детекции инфекционных воз-будителей не только КРС, но и коз. Проведен филогенетический анализ изолятов SRY-гена КРС, овцы, козы, свиньи, лошади, а также зубра. Показана их эволюционная близость для КРС, овцы и козы в то время, как SRY-ген свиньи и особенно лошади эволюционно удален от SRY-гена членов семейства Вovidae. В соответствии со сформулированными принципами конструирования прайме-ров для ПЦР разработана универсальная система праймеров SRY1-4 для определения пола пре-имплантационных эмбрионов КРС, овцы, козы и свиньи на основе детекции SRY-гена с учетом возможности проведения гнездовой ПЦР. Сконструированные наборы праймеров характеризуют-ся 100 %-ой специфичностью для детекции пола эмбрионов КРС, овцы и козы и 96 %-ой специ-фичностью для детекции пола эмбрионов свиньи. Проведен анализ каждого набора праймеров с точки зрения возможного образования вторичной структуры однонитевым ампликоном в процессе перехода от этапа денатурации ПЦР-продукта к этапу отжига праймера. На основе разработанных праймеров для детекции пола и выявления ВЛ КРС создана тест-система для мультиплексной ПЦР – одновременной идентификации пола и определения провирусной ДНК ВЛ КРС в геноме преим-плантационных эмбрионов. Проведена апробация сконструированных праймеров на лимфоцитах периферической крови КРС. С помощью разработанных праймеров пол всех исследуемых живот-ных был определен правильно. Проведена оптимизация параметров ПЦР для определения пола преимплантационных эмбрионов – определены значения температуры отжига и количество необ-ходимых циклов амплификации при проведении реакции с одним бластомером. Для 30 % исследо-ванных эмбрионов КРС был определен XY-кариотип.
Ключевые слова: детекция пола, эмбрион, множественное выравнивание, степень гомо-логии, SRY-ген, ген env, ампликон, лейкоз, провирусная ДНК.
Limanskaya O.Yu. Design of molecular genetic test-systems for early detection of bovine leu-kemia virus and preimplantation embryo sexing. – Manuscript.
Thesis for degree of Philosophy Doctor (Ph. D.) in Biology, speciality 03.00.20 – biotechnology. – Institute of Molecular Biology and Genetics, Kyiv, 2001.
This Ph. D. thesis is devoted to design of molecular genetic test-systems for early detection of farmer animals infectious agents and preimplantation embryo sexing. Polymerase chain reaction (PCR) principles, mechanism, different modifications and main characteristics are considered. Main principles of PCR test-system characterization and primers design are modified. It is shown primers homology de-gree is a key parameter for PCR effectiveness, accuracy and specificity. Primer sets for early bovine leu-kemia virus (BLV) detection are designed on the basis of multiple alignment of gene env sequences of different BLV isolates from EMBL/GenBank and following thermodynamical analysis of primers and amplicons. Theoretical and experimental comparison of designed and known primer sets for BLV detec-tion is carried out. It is shown designed primers have higher specificity and accuracy than known primers. The universal primer system for preimplantational cattle, sheep, goat and pig embryo sexing is created.
Keywords: sexing, embryo, multiple alignment, homology degree, SRY-gene, gene env, amplicon, leucousis, provirus DNA.
| 
