Аналіз ранніх ембріонів великої рогатої худоби та свині, що були отримані поза організмом
Запліднення яйцеклітин та культивування ембріонів поза організмом пов’язано з деякими труднощами, наприклад, “блоком розвитку”. У ембріонів великої рогатої худоби він спостерігається на стадії 8-16 клітин, а у ембріонів свині на стадії 4-8 клітин.
Оцінюють та відбирають ембріони за їхньою відповідністю стадії розвитку фактичному віку ембріонів, за відношенням до тест-фарбників, інтенсивностю обміну речовин, за здібністю досягати відповідної стадії розвитку в культурі in vitro, але як правило їх оцінюють та відбирають за морфологічними ознаками.
При морфологічному аналізі отриманих ембріонів корів, культивованих 56 годин, були виявлені ембріони від 2-х клітинної стадії розвитку до стадії ранньої морули (рис.1)
А при морфологічному аналізі, отриманих нами ембріонів свиней (рис.2), що культивували 48 годин, нами були знайдені ембріони від 2-х клітинної стадії розвитку до 8-16 клітинної стадії.
 Рис. 1 Морфологічний аналіз ембріонів великої рогатої худоби після 56 годин культивування поза організмом
Рис. 2 Морфологічний аналіз ембріонів свині після 48 годин культивування поза організмом
При цитогенетичному аналізі отриманих у культурі ембріонів як свиней, так і корів було виявлено, що вони не подолали “блоку розвитку”. Так, ембріони корів, морфологічно оцінені нами як 16-ти клітинні ембріони - морули, виявились фрагментованими 8-10-ти клітинними ембріонами, або навіть дегенерованими яйцеклітинами. Така сама картина спостерігалась і при аналізі ембріонів свиней. Ембріони, морфологічно оцінені як 8-16-ти клітинні, виявилися 4-6-ти клітинними ембріонами або ж фрагментованими яйцеклітинами. Це ще раз вказує на неадекватність оцінки ембріонів за морфологічними ознаками та на необхідність застосування цитогенетичного аналізу як додаткового методу визначення повноцінності зародків.
Під час вивчення метафазних пластинок бластомерів у ембріонах як свиней, так і корів були виявлені аномалії типу: поліплоїдія, гаплоїдія та порушення цитотомії.
Так, під час цитогенетичного аналізу в 2-3-х клітинних ембріонах великої рогатої худоби було виявлено 18,5% аномалій, в 4-5-ти клітинних - 20%, а в 6-8-ми клітинних - 25% (табл.10).
Таким чином, спостерігається тенденція збільшення частки геномних аномалій з ускладненням стадії розвитку ранніх ембріонів корів.
Таблица 10
Цитогенетичний аналіз ембріонів корів, що культивували
поза організмом
У наших дослідженнях при цитогенетичному аналізі ембріонів свиней (табл. 11) було знайдено 20,1% аномалій в 2-3-х клітинних ембріонах, 3,1% - в 4-5-ти клітинних та 28,6% - в 6-8-ми клітинних ембріонах.
Таке зниження долі геномних аномалій у 4-5-ти клітинних ембріонах випадає із загальної картини збільшення аномалій з просуванням стадії розвитку, як це спостерігалось у ембріонів великої рогатої худоби. Однак, це може бути пов’язано з різним механізмом та часом усунення дегенерованих або аномальних ембріонів. Можливо, у великої рогатої худоби усунення аномальних ембріонів проходить на більш пізніх стадіях, а у свиней - на 2-х клітинній стадії.
Таким чином, причиною невдач запліднення та культивування поза організмом ооцитів та ембріонів може бути як неповноцінне цитоплазматичне та ядерне дозрівання ооцитів, так і хромосомні аномалії в ооцитах та ембріонах. Час, а, можливо, і механізм загибелі ембріонів з аномаліями є видоспецифічним.
Таблиця 11
Цитогенетичний аналіз ембріонів свині, що культивували
поза організмом
Аналіз ембріонів великої рогатої худоби, що були отримані в умовах in vivo та in vitro
За літературними джерелами в ембріонах, які були отримані з організму самиць, приктично всі бластомери мають ядра. У дослідженнях по аналізу дегенерованих ембріонів (табл.12), що отримані нехірургічним шляхом із рогів матки на 7-9 добу, нами було виявлено, що доля бластомерів без ядер у них складає 2,5% (7/281).
Таблиця 12
Порівняльній аналіз ембріонів великої рогатої худоби, що отримані в умовах in vivo та in vitro
* - Р < 0,001
А в ембріонах, що отримані при культивуванні поза організмом, тільки 49% (292/596) бластомерів мали ядра.
Таким чином, можна припустити, що дегенерація ембріонів великої рогатої худоби, які отримані у природних фізіологічних умовах та в культурі in vitro, проходить різними шляхами. Для ембріонів, що отримані заплідненням поза організмом, - це фрагментація цитоплазми або “хибне” (“несправжнє”) ділення, а для ембріонів, що отримані в природних фізіологічних умовах організму, - це вплив генетичних мутацій, порушень процесу митозу і т.д.
висновки
- Дозрівання ооцитів корів у середовищі ТСМ-199 з 10% фетальної сироватки теляти і гормонами при 5% СО2 в повітрі та температурі 38,50С продовжується 24-26 годин, а ооцитів свиней за таких самих умов, але з додаванням 5-10% фолікулярної свинячої рідини в середовище триває 42-44 години.
- Ооцити корів, що отримані із яєчників об’ємом 15-19 мл без жовтого тіла та ооцити свиней, що отримані із яєчників об’ємом 12-16 мл, але мають жовте тіло, володіють більш високою ефективністю дозрівання у порівнянні з іншими типами яєчників.
- Кількість ооцитів з ослизненим кумулюсом, що отримані із яєчників великої рогатої худоби, була вірогідно (Р< 0,05) вища, ніж кількість таких самих ооцитів, що отримані із яєчників свиней.
- Культивування поза організмом яйцеклітинах корів та свиней призводить до однаково високого рівня аномалій, доля яких складає 27,5% і 30%, відповідно.
- Рівень поліспермії у свиней при заплідненні поза організмом спостерігається вірогідно вищий (Р< 0.01), ніж у великої рогатої худоби та складає 32,7% і 17%, відповідно.
- Ранні ембріони великої рогатої худоби та свині, які отримані заплідненням поза організмом, в середньому мають, відповідно, 20% и 11,1% аномалій хромосомного апарату.
- Аномалії хромосомного апарату в ембріонах корів накопичуються (на рівні тенденції) з просуванням стадії розвитку ембріона, а в ембріонах свиней така тенденція не спостерігається.
- Дегенерація ембріонів великої рогатої худоби та свині, що розвивалися поза організмом, проходить шляхом несправжнього ділення або фрагментації цитоплазми, що призводить до появи бластомерів без ядер.
- Ембріони великої рогатої худоби, що розвиваються в умовах організму, налічують у багато разів меншу кількість бластомерів без ядер в порівнянні з ембріонами, що отримані поза організмом.
пропозиції виробництву
- Запліднення яйцеклітин корів та свиней, які дозрівали поза організмом, необхідно проводити через 24-26 годин та 42-44 години, відповідно.
- Для визначення ефективності нових середовищ для культивування дозрівання ооцитів необхідно проводити із кожного окремо взятого яєчника.
- Отримані дисертантом дані можуть бути використані у курсі лекцій з біотехнології, генетики та біології розвитку сільськогосподарських тварин.
список опублікованих праць
- Щегельская Е.А., Щербак Е.В. Динамика событий первого мейотического деления в ооцитах коров и свиней при культивировании вне организма// Научно-технический бюллетень ИЖ УААН. -1996.- №72. - С.26-30.
Дисертантом була виконана частина серій експерименту по встановленню хронології подій першого поділу мейозу в ооцитах корів та свиней, результати яких потім були узагальнені з результатами серій експерименту, що були виконані співавтором.
2. Щербак Е.В. Порівняльний аналіз ембріонів великої рогатої худоби, одержаних в умовах in vivo та in vitro// Научно-технический бюллетень ИЖ УААН. -1998.- №73. - С.81-84.
3. Щербак Е.В., Безуглый Н.Д. Частота геномных аномалий в эмбрионах крупного рогатого скота и свиней при культивировании in vitro //Науково-технічний бюлетень ІТ УААН. - 1998. - №75. - С.205-209.
Дисертант виконав експериментальну частину, провів аналіз та узагальнення отриманих результатів.
- Щербак Е.В. Анализ ооцитов коров и свиней, полученных в условиях in vivo и in vitro// Науково-технічний бюлетень ІТ УААН. - 1998. - №75. - С.210-213.
- Щербак Е.В. Цитогенетичний анализ эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo и in vitro // Матеріали Міжнародної науково-виробничої конференції “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин” (жовтень, 1997, Асканія-Нова). - 1997. - С.97-98.
- Щербак Е.В. Сравнительный анализ частоты геномных аномалий в эмбрионах коупного рогатого скота и свиней, полученных вне организма. // Збірник матеріалів ІІ Міжнародної конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (м.Одеса) - 1998, Київ. - С.135-137.
Щербак О.В. Порівняльний аналіз ооцитів, яйцеклітин та ембріонів великої рогатої худоби і свині, що отримані в умовах in vivo та in vitro. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20- біотехнологія. -Інститут тваринництва УААН, Харків, 2001.
У роботі проведено детальний аналіз жіночих гамет та ембріонів великої рогатої худоби і свині, які були отримані в умовах організму та поза ним. Встановлено, що дозрівання у культурі in vitro ооцитів свині до метафази ІІ триває майже в двічі довше, ніж ооцитів великої рогатої худоби. Виявлено, що при культивуванні поза організмом, кількість аномалій хромосомного апарату яйцеклітин цих видів тварин знаходиться на однаково високому рівні. Досліджені морфологічні та цитогенетичні особливості процесів запліднення яйцеклітин та раннього ембріонального розвитку великої рогатої худоби і свині поза організмом. Встановлено, що поліспермне запліднення вірогідно частіше спостерігається у свині. Виявлено, що геномні аномалії в ембріонах корів накопичуються (на рівні тенденції) з просуванням стадії розвитку ембріона, а в ембріонах свиней така тенденція не спостерігається. Проведено порівняльний аналіз ембріонів великої рогатої худоби, які були отримані в умовах in vitro та in vivo. Висунута гипотеза про різні механізми дегенерування таких ембріонів.
Ключові слова: ооцити, яйцеклітини, ембріони, свиня, велика рогата худоба, цитогенетика, хромосомний апарат, культивування поза організмом, запліднення in vitro.
Щербак Е.В. Сравнительный анализ ооцитов, яйцеклеток и эмбрионов крупного рогатого скота и свиньи, полученных в условиях in vivo и in vitro. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20- биотехнология. - Институт животноводства УААН, Харьков, 2001.
В работе проведен детальный анализ женских гамет и эмбрионов крупного рогатого скота и свиньи, полученных в условиях организма и вне его. В работе изучена кинетика мейоза в ооцитах крупного рогатого скота и свиньи, которые созревают в условиях in vitro. Установлено, что созревание ооцитов свиньи в оптимизированных нами условиях длится почти в два раза дольше, чем в ооцитах крупного рогатого скота (42-44 ч и 24-26 ч, соответственно).
Были проведены эксперименты по культивированию ооцитов из отдельных яичников для выяснения возможного влияния их индивидуальных качеств на созревание вне организма. Мы объединили яичники в три группы по их объему. В каждой группе выделили две подгруппы: яичники с желтым телом и без него. Установлено, что ооциты коров, полученные из яичников объемом 15-19 мл без желтого тела и ооциты свиней, полученные из яичников объемом 12-16 мл, но имеющих желтое тело, обладают более высокой эффективностью к созреванию по сравнению с ооцитами, полученными из других типов яичников.
При морфологическом анализе выделенных ооцитов было выявлено, что их можно разделить на два типа: ооциты с ослизненным кумулюсом (ооциты с полностью экспандированным кумулюсом, представляющим собой вязкое студнеобразное вещество с темными скоплениями) и ооциты с разрыхленным кумулюсом. Ооциты второго типа по своей морфологии были похожи на ооциты, которые получают при культивировании вне организма в течение 24-26 часов для ооцитов коров и 42-44 часов для ооцитов свиней, т.е. на те, которые достигли второй метафазы мейоза. Сравнивая ооциты, полученные из яичников разных видов животных, нами было обнаружено, что количество ооцитов с ослизненным кумулюсом, полученных из яичников коров, было достоверно (Р< 0,05) выше, чем количество таких же ооцитов, полученных из яичников свиньи. Ооциты с разрыхленным кумулюсом находились на стадии телофазы І - метафазы ІІ мейоза и никаких аномалий в них не обнаружено, а хромосомы ооцитов с ослизненным кумулюсом в большинстве случаев были полностью или частично дегенерированы.
Цитогенетический анализ яйцеклеток как коров, так и свиней, созревшие в культуре in vitro, позволил обнаружить такие аномалии, как: диплоидная метафаза ІІ, анеуплоидия, клампинг и фрагментация хромосом. Доля всех обнаруженных аномалий хромосомного аппарата в яйцеклетках этих видов животных находится на одинаково высоком уровне и составляет у коров - 27,5%, а у свиней - 30%. Наиболее часто как в яйцеклетках коров, так и свиней встречалась фрагментация хромосом. В яйцеклетках как коров, так и свиней, на некоторых препаратах была выявлена трехгрупповая метафаза.
Диссертантом исследованы морфологические и цитогенетические особенности процессов оплодотворения яйцеклеток и раннего эмбрионального развития крупного рогатого скота и свиньи in vitro. Выявлено полиспермное оплодотворение вне организма как у свиньи, так и крупного рогатого скота. При чем уровень полиспермного оплодотворения у коров был достоверно ниже по сравнению со свиньями, а спонтанный партеногенез в наших условиях не наблюдался. При цитогенетическом анализе бластомеров эмбрионах, как свиней, так и коров были обнаружены аномалии типа: полиплоидия, гаплоидия и нарушение цитотомии. Было установлено, что ранние эмбрионы коров имеют в среднем 20% аномалий хромосомного аппарата, а эмбрионы свиней - 11,1% аномалий.
В 2-х клеточных эмбрионах крупного рогатого скота было обнаружено 18,5% аномалий, в 4-х клеточных - 20%, а в 6-8-ми клеточных -25%. При цитогенетическом анализе эмбрионов свиней было обнаружено 20,1% аномалий в 2-х клеточных эмбрионах, 3,1% - в 4-х клеточных и 28,6% - в 6-8-ми клеточных эмбрионах. Таким образом, выявлено, что геномные аномалии в эмбрионах коров накапливаются (на уровне тенденции) с продвижением стадии развития эмбриона, а в эмбрионах свиней такая тенденция не наблюдается. Следовательно, причиной неудач оплодотворения и культивирования вне организма может быть как неполноценное цитоплазматическое и ядерное созревание ооцитов, так и хромосомные аномалии в ооцитах и эмбрионах. Время, а, возможно, и механизм гибели эмбрионов с аномалиями являются видоспецифичными.
При анализе дегенерированных эмбрионов, полученных нехирургическим путем из рогов матки на 7-9 сутки, было выявлено, что доля бластомеров без ядер составляла 2%. А в эмбрионах, полученных при культивировании вне организма, только 49% бластомеров имели ядра. Поэтому можно предположить, что дегенерация эмбрионов крупного рогатого скота, полученных в естественных физиологических условиях и в культуре in vitro, идет разными путями.
Ключевые слова: ооциты, яйцеклетки, эмбрионы, свинья, крупный рогатый скот, цитогенетика, хромосомный аппарат, культивирование вне организма, оплодотворение in vitro.
Scherbaсk E.V. The comparative analysis of pig and cattle oocytes, ova and embryos received in vivo and in vitro conditions. Manuscript.
The dissertation for degree of candidate of agricultural science by speciality 03.00.20 - biotechnology.- Institute of animal sсince, Kharkov, 2001.
The detailed analysis female gametes and embryos of cattle and pigs received in conditions of organism and outside of it is carried out in this work.
It is established, that the pig oocyte maturing in the conditions, optimized by us, lasts almost twice longer, than in cattle oocytes. It is revealed, that the quantity of anomalies in ova of these kinds of animals at culture outside of organism, is on identical high level. The morphological and cytogenetic particularities of cattle and pig ova fertilization and early embryo development outside of organism processes are investigated. It is established, that the polisperm fertilisation at pig is observed more often. It is revealed, that genome anomalies at cow embryos are accumulated with progress of embryo development stage, and such tendency at pig embryos is not observed. The comparative analysis of cattle embryos received in conditions in vitro and in vivo is carried out. The hypothesis about different mechanisms of these embryos degeneration is put forward.
Key words: oocytes, ova, embryos, pig, cattle, cytogenetics, chromosome apparatus, in vitro culture, in vitro fertilization
Підписано до друку 12.03.2001 р. Формат 60 х 90/16. Друк офсетний. Ум.друк. арк. 0,8.Тираж 100 прим. Зам. №
____________________________________________________________________
Друк виконано в ТОВ “Нова-Пресс”, м.Харків, пр. 50 років ВЛКСМ, 52
|
