Розділ 5. Утворення парабульбочок на коренях шовковиці під впливом абіогенних та біогенних факторів нодуляції
Вивчали явище паранодуляції на коренях шовковиці під впливом абіогенного фактора нодуляції – 2,4-діхлорофеноксіацетата (2,4-Д), біогенного – бактерій Azospirillum brasilense 54, а також при одночасній обробці рослин 2,4-Д та інокуляції азоспіриллами.
Обробка 2,4-Д проростків шовковиці в стерильних умовах і сіянців, вирощених на нестерильному грунті сприяла утворенню дрібних парабульбочок на коренях даної культури, при цьому не спостерігалося збільшення висоти рослин та маси листя, але маса коренів достовірно підвищувалась у порівнянні з контролем на 56%.
При одночасній обробці сіянців шовковиці 2,4-Д і інокуляції їх A. brasilense 54 на 10 – 14 добу утворюються парабульбочки округлої форми (рис. 4).
Парабульбочки діаметром 2-5 мм утворювались переважно нижче кореневої шийки та вздовж головного кореня. Дрібніші парабульбочки ми спостерігали на нижній частині молодих коренів.
а) б)
Рис. 4. Парабульбочки на коренях сіянців шовковиці
а) 1 – контрольна рослина, 2 – рослина шовковиці, коренева система якої була оброблена 2,4-Д за одночасної інокуляції штамом A. brasilense 54; б) Збільшений фрагмент кореня сіянця шовковиці з парабульбочками.
В нестерильному ґрунті, де бактерії інокулюму конкурують з мікроорганізмами природного мікробного ценозу, в парабульбочки можуть проникати різні мікроорганізми. За використання методів отримання стрептоміцин стійких мутантів, імунологічних та імунохімічних методів нами було показано, що азоспірилли здатні заселяти парабульбочки шовковиці, штучно утворені на коренях даної культури в результаті обробки її 2,4-Д (табл. 5).
Таблиця 5
Результати імуноферментного аналізу ізолятів бактерій, виділених з парабульбочок сіянців шовковиці.
- - Співвідношення оптичної густини (ОГ) досліджуваного зразка до ОГ негативного контролю.
Таким чином, ми встановили, що мікрофлора парабульбочок менш різноманітна, ніж мікрофлора коренів. Вірогідно, застосування одночасної обробки рослин 2,4-Д і інокуляції A. brasilense 54 сприяє заселенню новоутворень на коренях шовковиці досліджуваним штамом. Значну роль в цьому процесі відіграє також здатність азоспірил до ендофітії. Заселивши парабульбочки на коренях шовковиці, азоспірили попереджують проникнення в дані структури інших мікроорганізмів, в тому числі і патогенних.
Нітрогеназна активність парабульбочок, отриманих при інокуляції рослин штамами азоспірил значно перевищувала (в 15 – 19 разів) активність парабульбочок, що з’явилися на коренях сіянців в результаті обробки їх лише 2,4-Д (табл. 6).
Слід відмітити, що обробка сіянців 2,4-Д з одночасною інокуляцією A. brasilense 54 забезпечила достовірне підвищення показника маси коренів (в 2,6 разів в порівнянні з контролем), який перевищував аналогічний показник, отриманий при інокуляції рослин A. brasilense 54.
Структура парабульбочок шовковиці схожа зі структурою “кореневих” бульбочок актінорізних рослин, які розвиваються з примордієв бокових коренів і характеризуються центральним розташуванням провідних пучків (рис. 5).
Таблиця 6
Утворення парабульбочок на коренях сіянців шовковиці в результаті обробки кореневої системи 2,4-діхлорофеноксіацетатом і азоспірилами.
Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом
Рис. 5. Схематичне зображення структури парабульбочок шовковиці.
1 – меристема; 2 – провідні пучки; 3 – паренхіма; 4 – перидерма.
Розділ 6. Ефективність застосування препарату ризобразіну на основі Azospirillum brasilense 54
На основі ендофітного штама А. brаsilense 54 розроблено бактеріальний препарат для інокуляції насіння, однорічних саджанців і дорослих рослин шовковиці, а також вивчено його ефективність. Препарат ризобразін виготовляли у двох формах: торф’яній і рідкого концентрату. Рекомендовано використовувати рідкій концентрат для інокуляції насіння і однорічних саджанців. Так, інокуляція насіння рідкою формою ризобразіну сприяла збільшенню діаметра стовбура сіянців на 33, маси рослин – на 65, маси листя – на 67, площі листової пластинки – на 51%, замочування кореневої системи однорічних саджанців шовковиці в рідкому концентраті ризобразіна забезпечило підвищення висоти рослин – на 12, площі листової пластинки – на 40 і маси листя – на 36%. З метою інтродукції азоспірил в кореневу зону 3 – 5-річних насаджень шовковиці доцільно обробляти рослини торф’яною формою ризобразіна. Такий прийом сприяв підвищенню показників довжини та діаметра стовбура трьохрічних дерев на 11 і 9% відповідно, кількості пагонів на кущі – на 29 і врожаю листя - на 43% в порівнянні з контролем.
Результати внесення торф’яного препарату в кореневу зону рослин шовковиці п’ятирічного віку свідчать про його позитивний вплив на біометричні показники сортів: Українська-5, Українська-6, Українська-7 та гібридних насаджень шовковиці. Слід відмітити, що рослини даних сортів більшою мірою відзиваються на інокуляцію бактеріальним препаратом, ніж гібридні насадження. Так, довжина однорічних пагонів сортових насаджень шовковиці достовірно підвищилась на 10-15, а гібридних – на 7% в порівнянні з контролем. Прибавка урожаю листя гібридних рослин шовковиці складала 23%, в той час як сортових – 35-41% в порівнянні з контролем (рис. 6).
Рис. 6. Вплив обробки рослин шовковиці торфяним препаратом ризобразіном на врожай листя з одного куща: 1 – гібридні насадження; 2 – сорт Українська-5; 3 – Українська-6; 4 – Українська – 7.
В умовах виробничого досліду показана здатність азоспірил сприяти підвищенню врожаю листя гібридних 12-тирічних насаджень шовковиці на 24% (табл. 7).
Таблиця 7.
Вплив торф’яного препарату ризобразіну на врожай листя дванадцятирічних рослин шовковиці (виробничий дослід, Миргородський гренажний завод, Полтавська обл.), (2004).
З метою дослідження впливу ризобразіну на якість листової продукції шовковиці визначали вміст в листі рослин макро- і мікроелементів, органічних речовин і пігментів. Обробка торф’яним препаратом ризобразіном рослин шовковиці через 4 місяця забезпечила підвищення вмісту цинка в листі на 15, заліза – на 65%. Через 16 місяців після інтродукції біоагента препарату в кореневу зону насаджень шовковиці в листі даної культури прибавка вмісту кальцію складала – 20, марганцю – 55, цинку – 23, міді – 50 і заліза – 46%. Підвищення вмісту в листі шовковиці мікроелементів позитивно впливає на активність процесу фотосинтезу.
Одним з основних показників активності фотосинтетичного апарату є вміст хлорофілу в листі рослин. Обробка рослин шовковиці торф’яним препаратом ризобразіном сприяла достовірному підвищенню в листі хлорофілу а та хлорофілу в через 4 місяці на 15 і 19% відповідно, а через 16 місяців – на 12 і 33% (табл. 8). Показано достовірне підвищення каротину в листі шовковиці через 4 місяці після внесення ризобразіну в кореневу зону насаджень шовковиці на 46% і через 16 місяців – на 67%.
Таблиця 8
Вплив торф’яного препарату ризобразіну на вміст фотосинтетичних пігментів в листі шовковиці (мг/100г сирої речовини), (2004 р.)
Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.
Обробка рослин торф’яним препаратом ризобразіном на основі бактерій A. brasilense 54 сприяла збільшенню вмісту розчинних цукрів (глюкози, фруктози и сахарози) в 2,25 рази (табл. 9), що можна пояснити підсиленням активності фотосинтетичного апарату рослин в результаті інтродукції азоспірил в кореневу зону насаджень шовковиці. Через 4 місяці після обробки рослин біопрепаратом прибавка вмісту ліпідів складала 47, а через 16 місяців – 7%. Однак, обидві ці прибавки виявились достовірними в порівняні з контролем.
Таблиця 9.
Післядія препарату ризобразіну на біохімічний склад листя гібридних насаджень шовковиці (в абсолютно сухій речовині, %) (2003 р.)
Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.
Як було показано раніше, штам А. brаsilense 54 активно фіксує азот в чистій культурі, тому вивчали вміст білку в листі шовковиці. Обробка насаджень шовковиці торф’яним препаратом ризбразіном через 4 місяці не забезпечила підвищення вмісту білку. Однак через 16 місяців після інокуляції прибавка вмісту білку в листі в порівнянні з контролем складала 6%.
ВИСНОВКИ
1. Вперше вивчено якісний і чисельний склад та нітрогеназну активність азотфіксуючих бактерій кореневої зони шовковиці. З ризосферного грунту, ризоплани та гістосфери даної культури виділено 87 штамів діазотрофів, представників родів Azotobacter, Bacillus, Enterobacter, Azospirillum, Pseudomonas, які характеризуються високою нітрогеназною активністю.
2. Розроблено методику одержання штамоспецифічної антисироватки, що включає модифіковану схему імунізації кролів клітинами бактерій Azospіrіllum brasіlense 54.
3. За допомогою стрептоміцин стійких мутантів, а також імунологічних та імунохімічних методів показана здатність азоспірил проникати у внутрішні тканини коренів рослин шовковиці і зберігати там життєдіяльність протягом 16 місяців після інокуляції.
4. Встановлена можливість штучного індукування утворення парабульбочок на коренях рослин шовковиці за допомогою абіогенного фактора нодуляції – 2,4-діхлорофеноксіацетата. Сумісне застосування 2,4-Д та інокуляції A. brasіlense 54 сприяло підвищенню нітрогеназної активності парабульбочок – в 17 разів і маси кореневої системи рослин – в 2,6 разів.
5. Встановлено, що внутрішня структура парабульбочок шовковиці відповідає “кореневому” типу і найбільш схожа зі структурою бульбочок дерев’янистих рослин, що утворюються при інфікуванні рослин мікроорганізмами роду Frankia.
6. Вперше показана пролонгована позитивна дія бактерій А. brаsilense 54 на врожай листя шовковиці та вміст в них вітамінів. Так, через 16 місяців після інокуляції урожай листя шовковиці підвищився на 53,2%, вміст в них вітамінів В1 и В2 – на 8, вітаміна РР – на 11 і вітаміна Е – на 16%.
7. На основі азотфіксуючих бактерій роду Azospirillum створено новий біопрепарат ризобразін. Розроблені, експериментально перевірені та захищені патентом України способи інокуляції рослин шовковиці різного віку бактеріальним препаратом ризобразіном.
8. Показано, що застосування ризобразіну на гібридних і сортових насадженнях шовковиці сприяло істотному підвищенню врожаю листя шовковиці на 23-67% та поліпшенню їх якості: вміст макро- и мікроелементів підвищився на 20-55, органічних речовин – на 6-123, фотосинтетичних пігментів – на 12-67%.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. *Булатова Ю.О., Надкернична О.В., Ушакова М.А., Олексійченко Н.О. Вплив азотфіксуючих бактерій на біометричні показники сіянців і гібридних насаджень шовковиці // Агроекологічний журнал. – 2003. - №1. – С. 57–59. (Здобувачем самостійно проведено експериментальні дослідження по вивченню впливу діазотрофів на біометричні показники сіянців і дорослих рослин шовковиці).
- Гончар Ю.А., Алексейченко Н.А. Увеличение продуктивности растений шелковицы в результате интродукции штаммов азоспирилл в корневую зону // Аграрний вісник причорномор’я: Зб. наук. пр. – Одеса, 2004. – Вип. 26, Ч. 2. – С. 18–22. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження по вивченню здатності азоспірил індукувати морфологічні зміни кореневих волосків проростків шовковиці, здійснено аналіз отриманих результатів).
- Alekseychenko N.A., Galanova A.V., Ananyev P.P., Nadkernichnaya E.V., Gonchar Y.A. The increase of productivity of mulberry plantations as a result of using bacterial fertilizers // Sericologia. – 2004. – Vol. 44, №3. – P. 387–392. (Здобувач брала участь у проведенні польових дослідів, аналізі одержаних результатів та написанні статті).
- Пат. 48835 Україна, A01G29/00. Спосіб підвищення урожайності листової маси шовковиці; Надкернична О.В., Олексійченко Н.О., Ушакова М.А., *Булатова Ю.О. – Заявл. 19.12.01; Опубл. 15.08.02., Бюл. № 8. – 3 с. (Здобувач особисто приймала участь у розробці способу інокуляції насаджень шовковиці).
- Застосування бактеріальних препаратів на основі азоспірил для підвищення продуктивності шовковиці. Методичні рекомендації / О.В. Надкернична, Ю.О. Гончар, М.А. Ушакова та інш. – Чернігів: ІСГМ УААН, 2004. – 16 с. (Здобувач безпосередньо брала участь у проведенні польових дослідів по вивченню впливу азоспірил на продуктивність шовковиці та у підготовці методичних рекомендацій до друку).
- Гончар Ю.А., Надкерничная Е.В., Алексейченко Н.А. Влияние азоспирилл на качество листовой продукции растений шелковицы // Живлення рослин: теорія і практика: Зб. наук. пр. – К.: Логос, 2005. – 294–305. (Здобувач провів аналіз та інтерпретацію одержаних даних).
- Гончар Ю.А. Структура азотфиксирующего микробного комплекса корневой зоны шелковицы // Біологічні науки і проблеми рослинництва: Зб. наук. пр. – Умань, 2003. – С. 298–302.
- *Булатова Ю.А. Влияние диазотрофов, выделенных из клубеньков шелковицы, на всхожесть, дружность и скорость прорастания семян этой культуры // Сталий розвиток агроекосистем. Матеріали міжнародної конференції 17-20 вересня 2002 р. – Вінниця, 2002. – С. 115–117.
- *Булатова Ю.А., Надкерничная Е.В., Ушакова М.А. Влияние азотфиксирующих бактерий на биометрические показатели растений шелковицы // Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье. Материалы IX Международного симпозиума. 9-16 июня 2002 г. – Симферополь, 2002. – С. 577–579. (Здобувачем самостійно розроблено схему досліду).
- Надкернична О.В., Гончар Ю.О., Волкова І.В. Імунологічні методи дослідження взаємодії азоспірил з рослинами шовковиці // Х з’їзд Товариства мікробіологів України: Тези доповідей. – Одеса: Астропринт, 2004. – С. 245. (Здобувач безпосередньо брала участь у розробці схеми імунізації кролів азоспіриллами, самостійно здійснила аналіз отриманих результатів).
- Гончар Ю.А. Влияние эндофитных бактерий рода Azospirillum на биохимический состав листа шелковицы // Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів: Тези доповідей ІХ конференції молодих дослідників. – Київ, 2005. – С. 79.
* - прізвище Булатова змінено на прізвище Гончар.
АНОТАЦІЯ
Гончар Ю.О. Особливості функціонування асоціативної системи: шовковиці – азотфіксуючі бактерії роду Azospirillum. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07. – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболтного НАН України, Київ, 2005.
Дисертація присвячена дослідженню функціонування асоціативної системи: шовковиця – азотфіксуючі бактерії роду Azospirillum, можливості проникнення даних бактерій у внутрішні тканини коренів шовковиці і здатності азоспірил здійснювати пролонговану дію на продуктивність та якість листової продукції шовковиці.
В роботі представлено результати скринінгу діазотрофів, виділених з кореневої зони шовковиці та з бульбочок, що спонтанно утворилися на коренях “гігантської” рослини шовковиці.
Показана здатність азоспірил індукувати морфологічні зміни кореневих волосків.
Вперше розроблено модифіковану схему імунізації кролів клітинами азоспірил, що дозволило отримати штамоспецифічну антисироватку до штаму A. brasilense 54. Виявлено здатність азоспірил проникати у внутрішні тканини коренів дорослих рослин шовковиці.
Показано можливість штучного індукування парабульбочок на коренях шовковиці та заселення даних новоутворень азоспірилами.
На основі штаму A. brasilense 54 розроблено бактеріальний препарат ризобразін та способи інокуляції їм рослин шовковиці різного віку, що сприяє підвищенню біометричних показників і продуктивності шовковиці на 23 – 67%, а також покращенню якості листової продукції даної культури.
Ключові слова: діазотрофи, асоціативна азотфіксація, Azospirillum brasilense, ендофіти, імунологічні методи, паранодуляція, листова продуктивність шовковиці.
АННОТАЦИЯ
Гончар Ю.А. Особенности функционирования ассоциативной системы: шелковица – азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum. – Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07. – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2005.
Диссертация посвящена исследованию функционирования ассоциативной системы: шелковица – азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum, возможности проникновения данных бактерий во внутренние ткани корней шелковицы и способности азоспирилл оказывать пролонгированное действие на продуктивность и качество листовой продукции шелковицы.
В работе представлены результаты скрининга диазотрофов, выделенных из корневой зоны шелковицы и из клубеньков, спонтанно образовавшихся на корнях “гигантского” растения шелковицы. Из ризосферной почвы, ризопланы и гистосферы данной культуры выделено 87 штаммов диазотрофов, представителей родов Azotobacter, Bacillus, Enterobacter, Azospirillum, Pseudomonas, которые характеризуются высокой нитрогеназной активностью.
Показана способность азоспирилл, выделенных из клубеньков “гигиантскогй” шелковицы, индуцировать морфологические изменения (крючковидные, спиралевидные, булавовидные) корневых волосков проростков, что подтверждает способность данных бактерий вызывать ответную реакцию растений на инокуляцию.
Впервые разработана модифицированная схема иммунизации кролей клетками азоспирилл, позволяющая получить штаммоспецифичную антисывортку к штамму A. brasilense 54 с титром 1:32 в реакции преципитации и 4х105 в реакции твердофазного имуноферментного анализа. С помощью стрептомицинустойчивых мутантов, а также иммунологических и иммунохимических методов показана способность азоспирилл проникать во внутренние ткани корней растений шелковицы и сохранять там жизнедеятельность в течение 16 месяцев после инокуляции.
Установлена возможность искусственного индуцирования параклубеньков на корнях растений шелковицы, выращенных в стерильных условиях и на нестерильной почве под воздействием абиогенного агента нодуляции – 2,4-дихлорофеноксиацетата. Паказана способность азоспирилл заселять параклубеньки на корнях шелковицы. Установлена нитрогеназная активность данных структур. Абиогенный нодулирующий агент – 2,4-дихлорофеноксиацетат способствует обазованию параклубеньков на корнях сеянцев шелковицы и увеличению параметров корневой системы растений. Установлено, что внутренняя структура параклубеньков шелковицы соответствует “корневому” типу и наиболее схожа со структурой клубеньков деревянистых растений, образованных микроорганизмами рода Frankia. Параклубеньки на корнях шелковицы развиваются из примордиев боковых корней. То есть их можно рассматривать, как модифицированные корни.
На основе штамма A. brasilense 54 разработан бактериальный препарат ризобразин и способы инокуляции им растений шелковицы разного возраста. Показано, что обработка насаждений данным препаратом способствует увеличению биометрических показателей и продуктивности растений шелковицы. Урожай листовой продукции сортовых насаждений шелковицы в результате инокуляции увеличивается на 35-41% по сравнению с вариантом без инокуляции. Интродукция азоспирилл в корневую зону шелковицы способствует улучшению качества листовой продукции растений. Так, содержание макро- и микроэлементов возросло на 20-55, органических веществ – на 7-123, фотосинтетических пигментов – на 12-67, содержание витаминов на 8 – 16%.
Ключевые слова: диазотрофы, ассоциативная азотфиксация, Azospirillum brasilense, эндофиты, иммунологические методы, паранодуляция, листовая продуктивность шелковицы.
THE SUMMARY
Gonchar Y.A. The feature of functioning of associative system: a mulberry - nitrogenfixing bacteria of sort Azospirillum. - A manuscript.
Thesis for a candidate’s degree in biology speciality 03.00.07. - microbiology. – The Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2005.
Candidat’s thesis is dedicated to investigation of associative system: the mulberry - nitrogenfixing bacteria of sort Azospirillum, the possibility of penetrating of the given bacteria into inner zone of roots of a mulberry and the ability of Azospirillum to make a prolonged effect on productivity and quality of sheet production of a mulberry.
In the work the results of screening of diazotrophs, allocated of a root zone of a mulberry and from nodules, spontaneously formed on roots of a "huge" plant of a mulberry are submitted.
The ability of A. brasilense 54 to induce morphological changes of root is shown.
The application of the modified scheme of the immunization and reimmunization of animals that allowes to receive the antiserum to the strain Azospirillum brasilense 54. It is established, that nitrogenfixing bacteria of sort Azospirillum are capable to penetrate into internal tissues of roots of wood plants.
The opportunity of artificial formation of paranodules on roots of the mulberry and settling of the data structures of Azospirillum is shown.
The bacterial preparation of rizobrasin on a basis of the strain A. brasilense 54 and the ways of inoculation of plants of a mulberry of different age by it is developed. The introduction of Azospirillum in a root zone of the mulberry promotes the prolonged increase of a crop of the given culture on 23 – 67% and the improving of a quality of leaves of a mulberry.
Key words: diazotrophs, associative nitrogenfixation, Azospirillum brasilense, endophites, immunological methods, paranodulation, sheet efficiency of a mulberry.
| 
