ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
- Розроблені принципи ДНК-прогнозу рекомендуються для використання в селекційній практиці у вигляді нового “Способу прогнозування рівня розвитку кількісних ознак в популяціях злакових культур”. Передбачення рівня розвитку ознак наступного покоління дозволяє значно скоротити терміни селекційних програм.
- Розроблені принципи маркерного добору рекомендуються для використання в селекційній практиці у вигляді методичних рекомендацій “Генетичне поліпшення популяцій кукурудзи шляхом добору за ДНК-маркерами локусів кількісних ознак”. Залучення ДНК-маркерів локусів кількісних ознак у схему традиційного добору дозволяє значно підвищувати його ефективність.
- Отримані під час дослідження самозапилені потомства I3, які виделені в результаті маркерного поліпшення популяції, є цінним вихідним матеріалом для подальшої селекції.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Доменюк В.П., Вербицька Т.Г., Сиволап Ю.М. Оптимізація методики RAPD – аналізу для детекції поліморфізму послідовностей ДНК у ліній кукурудзи // Вісник Одеського національного університету. – 2001. – Т. 6, вип. 1. – С. 51 – 59.
Особистий внесок дисертанта: вдосконалено метод електрофоретичної візуалізації продуктів RAPD-(ISSR-)-ПЛР та впроваджено його для покращення виразності електрофореграм у роботі, спрямованій на пошук поліморфних ділянок ДНК.
2. Доменюк В.П., Вербицкая Т.Г., Белоусов А.А., Сиволап Ю.М. Маркерный анализ количественных признаков кукурузы при помощи ISSR-ПЦР // Генетика. – 2002. – Т. 38, № 10. – С. 1370 – 1378.
Особистий внесок дисертанта: проведено ISSR-генотипування рослин популяції (ГК26 х Мо17) F2; проаналізовано розщеплення за поліморфними локусами; перевірено можливості використання комп’ютерної програми “MAP_QTL” для маркування QTL.
- Доменюк В.П., Белоусов А.А., Сиволап Ю.М. ДНК-маркирование количественных признаков кукурузы // Цитология и генетика. – 2002. – Т. 36, № 6. – С. 12-19.
Особистий внесок дисертанта: генотипування рослини популяції (ГК26 х Мо17) F2 за RAPD- та ISSR-локусами; проведення ДНК-маркування QTLs на основі алгоритму одномаркерного картування; сформульовано критерії інформативності ДНК-маркерів; запропоновано матрицю найбільш інформативних алелів маркерних локусів; перевірено добиральну здатність маркерної тестової системи в межах певного року.
4. Доменюк В.П., Сторчеус Н.І., Белоусов А. О., Сиволап Ю.М. ДНК-маркування ознак продуктивності кукурудзи методом SSRP-ПЛР // Вісник Одеського національного університету. – 2003. – Т. 8, вип. 1. – С. 59 – 67.
Особистий внесок дисертанта: генотипування рекомбінантів популяції (ГК26 х Мо17) у генераціях F2 та F3 за SSR-локусами; перевірка маркерної здатності поліморфних локусів у двох генераціях; оцінка нерівноваги за зчепленням при успадкуванні певних алелів за даними двох років; детектування “каркасних” QTLs.
5. Доменюк В.П., Бєлоусов А.О., Сиволап Ю.М. Добір за ДНК-маркерами локусів кількісних ознак в селекції кукурудзи // Вісник Харківського національного аграрного університету. – 2003, № 3(2). – С. 87-91.
Особистий внесок дисертанта: розроблено принципи прямого маркерного добору на основі ДНК-маркерів QTLs; сформульовано критерії формування маркерних тестових систем; проведено апробацію розроблених принципів на популяції (ГК26 х Мо17) F3-4; генетично поліпшено вихідну популяцію за ознаками “глибина зерна”, “індивідуальна продуктивність”.
6. Доменюк В.П., Вербицкая Т. Г., Сиволап Ю.М. Использование простых повторяющихся последовательностей ДНК (SSR) для молекулярно – генетической характеристики инбредных линий кукурузы // Збірник матеріалів Міжнар. конференції з генетики та молекулярної біології для студентів та молодих вчених. – Львів, 2000. – С. 100.
Особистий внесок дисертанта: проведено молекулярно-генетичний аналіз генотипів 26 інбредних ліній кукурудзи, виявлено певні поєднання алелів, специфічні для різних комплексів господарсько-важливих ознак.
7. Доменюк В.П., Белоусов А.А., Сиволап Ю.М. Отбор RAPD-праймеров для маркирования хозяйственных признаков кукурузы // Сборник материалов 2-й Междунар. научной конференции ”Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии”. – Москва, 2001. С. 141 – 142.
Особистий внесок дисертанта: перевірено інформативність близько 70 RAPD-праймерів щодо виявлення молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів ліній ГК26 і Мо17, оцінено можливість маркування хромосомних блоків QTL групами поліморфних локусів.
8. Доменюк В.П., Сиволап Ю.М. Детекція поліморфізму послідовностей ДНК у ліній кукурудзи методами RAPD, ISSR та SSR- аналізу // Збірник матеріалів Міжнар. конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений”. – Харків, 2001. – С. 21 – 22.
Особистий внесок дисертанта: проведено детекцію молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів ліній ГК26 і Мо17 за допомогою 100 RAPD-, 20 ISSR-, 10 пар SSR-праймерів, для подальшої роботи відібрано 40, 15 і 3 праймери відповідно.
9. Доменюк В.П., Белоусов А.А., Сиволап Ю.М. ДНК - маркирование количественных признаков кукурузы // Сборник материалов Международного симпозиума “Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология”. – Минск, 2001. – С. 42.
Особистий внесок дисертанта: сформовано базу фенотипічних даних популяції F2 по комплексу господарських ознак, генотиповано рекомбінантів F2 за поліморфними SSR-локусами, проведено картування поліморфних локусів та визначено їхні зв’язки з кількісними ознаками.
10. Domenjuk V., Belousov A. A. Sivolap Yu. Microsatellite markers of maize polygenic traits // Збірник матеріалів конференції для студентів, аспірантів та молодих вчених з молекулярной біології та генетики. – Київ, 2001. – С. 7.
Особистий внесок дисертанта: отримано групи зчеплення із ISSR- та SSR-локусів, проаналізовано їхню інформативність щодо різних селекційних груп маркерованих ознак.
11. Domenjuk V., Sivolap Yu. QTLs detection of maize agronomical traits by DNA-markers // Abstracts guide of the Internat. Conf. “Plant, Animal and Microbe Genomes”. – San Diego (USA), 2002. – P. 135.
Особистий внесок дисертанта: проведено генотипування рослин популяції (ГК26 х Мо17) F2 за поліморфними ISSR- та SSR-локусами, отримано маркери до локусів 17 кількісних ознак, запропоновано схему для відображення маркерованої частини генотипу певної ознаки.
12. Domenjuk V., Belousov A. A. Sivolap Yu. Maize QTL allelic combination DNA-marker analysis // Сборник материалов Междунар. конференции. – Ялта, 2002. – С. 6.
Особистий внесок дисертанта: виявлено специфічні поєднання алелів ДНК-маркерів QTL, що найбільш коректно відображають мінливість кількісних ознак в популяції, запропоновано маркерні панелі для прямого добору цінних рослин за їхнім QTL-генотипом.
13. Доменюк В.П., Бєлоусов А,О., Сиволап Ю.М. Добір за ДНК- маркерами QTL в популяціях кукурудзи // Збірник матеріалів 2-ї Міжнар. конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений”. – Харків, 2003. – С. 32.
Особистий внесок дисертанта: проведено експериментальне моделювання маркерного добору за ДНК-маркерами QTL, порівняння ефективності традиційних методів добору із запропонованим.
АНОТАЦІЯ
Доменюк В. П. ДНК-маркери локусів кількісних ознак кукурудзи. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 – молекулярна генетика. – Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2003.
Дисертація містить теоретичний та експериментальний матеріал із детекції ДНК-маркерів до локусів кількісних ознак та використання специфіки їхнього зв’язку для підвищення ефективності традиційних методів добору в селекції кукурудзи.
Марковано локуси господарсько-цінних (полігенних) ознак – складових габітусу рослини, морфології волоті, продуктивності та біохімічних показників.
Розроблений алгоритм генетико-статистичного зв’язку між генетичними системами маркерів і QTL’s покладено в основу способу ДНК-прогнозу розвитку полігенних ознак, надійність якого в популяції (ГК26 х Мо17) F3 становить 40-83%.
Для генетичного поліпшення популяцій за комплексом агрономічних ознак пропонується метод прямого маркерного добору, експериментальний генетичний ефект якого в популяції (ГК26 х Мо17) F4 cкладає 9,1-17,6% за один цикл добору.
Обґрунтовано вимоги до формування маркерних тестових систем і критерії інформативності маркерів для підвищення ефективності моделей ДНК-прогнозу та маркерного добору.
Ключові слова: ПЛР, QTL, маркування, ДНК-прогноз, маркерний добір, популяції кукурудзи.
АННОТАЦИЯ
Доменюк В.П. ДНК-маркеры локусов количественных признаков кукурузы. – Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 – молекулярная генетика. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2003.
Диссертация содержит теоретический и экспериментальный материал по детекции ДНК-маркеров к локусам количественных признаков и использованию специфичности их связи для повышения еффективности традиционных методов отбора в селекции кукурузы.
Корректность исследования полигенных систем повышена путём использования для детекции полиморфизма генотипов родительских линий трёх типов праймеров – RAPD, ISSR и SSR, которые позволяють изучать различные участки генома.
Генетическая “чистота” исходного материала и стабильность наследования родительских ампликонов генотипом гибрида F1 позволяют считать выявленные полиморфные локусы действительным отображением молекулярно-генетического полиморфизма родительских линий и корректным использование их для маркирования QTL в данной комбинации скрещивания.
Детектированы ДНК-маркеры к QTL, которые существенно влияют на развитие агрономически-ценных признаков, составляющих габитус растения, морфологию метёлки, продуктивность и биохимические показатели.
Картирование маркерных локусов позволило установить четыре группы сцепления, одна из которых отнесена к III хромосоме генома кукурузы. Маркерный анализ расщепления количественных признаков в популяции (ГК26 х Мо17) F2 позволяет считать, что в пределах полученных груп сцепления находятся QTL’s, влияющие большей частью на изменчивость признаков габитуса и продуктивности и в незначительной степени на биохимические показатели.
Маркерным считали локус, аллели которого находились в неравновесии по сцеплению с аллелями QTL в фазе “притяженния” минимум у двух поколений. Поскольку полученные ДНК-маркеры предполагалось рекомендовать к использованию на разных этапах селекции, существенность их связи с QTL, в представленной работе, проверялась двумя способами: 1) сохранение неравновесия по сцеплению между аллелями маркерных локусов и QTL от родительских генотипов до рекомбинантов F2 и 2) от рекомбинантов F2 до следующего поколения F3. Первый способ является наиболее явным и обоснованным для предварительного или экспресс-анализа; второй – позволяет учитывать адаптивные изменения в экспрессии генотипа, затрагивающие, прежде всего, количественные признаки путём изменения набора генов, которые отвечали за развитие признака в предыдущих условиях.
Детекция наиболее стабильных (“каркасных”) QTL, которые сохранили влияние в контрастных условиях среды открывает перспективы прогнозирования и маркерного отбора генотипов с оптимальными уровнями развития количественных признаков у растений кукурузы.
Разработка способа ДНК-прогноза и его экспериментальное моделирование позволили отработать некоторые теоретические параметры, которые составляют требования к формированию маркерных тестовых систем. Сущность моделирования состояла в подборе рабочей тестовой сисетмы, которая является генотипом растения, включающего эффективные маркерные аллели, связанные с необходимыми уровнями развития определённого признака. Подбор оптимальной тестовой системы реализуется в нескольких моделях, которые рассматривают возможные маркерные комбинации из общего количества маркеров данного признака. Такое комбинирование не является технической проверкой всех возможных сочетаний, а проводится по следующим критериям (в указанной последовательности): 1) SSR-маркеры, обязательно с учётом “селективного веса” их аллелей, т.к. маркерными, в кодоминантном локусе, могут быть разные аллельные состояния (от 1 до 3); 2) более информативные по маркирующей способности (t-критерий); 3) с большим соответствием теоретическому расщеплению; 4) однотипные маркеры; 5) комбинирование доминантных маркеров в одной тестовой системе возможно при условии, что одинаковые аллели этих локусов характерны для генотипов с одинаковым уровнем развития признака; 6) комбинирование доминантных и кодоминантных маркеров в одной тестовой системе возможно при условии соответствия маркирующих аллельных состояний. Дополнительными критериями могут быть количество маркированных признаков и сцепление между маркерными локусами.
Теоретические параметры, отработанные для моделей ДНК-прогноза по формированию маркерных тестовых систем, в большинстве используются и для моделирования маркерного отбора. Исключение составляет требование к аллельному состоянию маркерного локуса – в данной модели пригодны для использования только гомозиготные маркеры. Проверка эффективности отбора в следующем поколении планируется без генотипирования его особей, поэтому важно в исходной популяции отсеять гетерозиготные генотипы.
Экспериментальная эффективность ДНК-прогноза уровня развития количественных признаков в популяции (ГК26 х Мо17) F3 cоставляет 40-83% (статистический средний уровень надёжности прогноза – 50-70%).
Экспериментальный генетический эффект прямого маркерного отбора в популяции (ГК26 х Мо17) F4 cоставляет 9,1-17,6% за один цикл отбора (еффективность традиционного отбора – початкорядного – составляет 2,6% за год).
Использование двухлокусных тестовых систем на базе SSR-маркеров, комбинированных – SSR- и ISSR-маркеров, а также сцепленных маркеров позволяет повысить уровень надёжности ДНК-прогноза и маркерного отбора.
Апробированные модели ДНК-прогноза и маркерного отбора рекомендуются к использованию в селекционной практике в виде нового “Способа прогнозирования уровня развития количественных признаков в популяциях злаковых культур” и метода “Генетическое улучшение популяций кукурузы путём отбора по ДНК-маркерам QTL”. Полученные в ходе исследования самоопыленные потомства I3, выделенные в результате маркерного улучшения популяции, являются ценным исходным материалом для последующей селекции.
Ключевые слова: ПЦР, QTL’s, маркирование, ДНК-прогноз, маркерный отбор, популяции кукурузы.
SUMMARY
Domenyuk V.P. DNA-markers of maize quantitative trait loci. – Manuscript.
Thesis for degree of Philosophy Doctor (Ph. D.) in Biology, speciality 03.00.22 – Molecular Genetics. – Institute of Molecular Biology and Genetics, of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.
Dissertation contains theoretical and experimental material on QTL DNA-markers detection and use of their specificity connection for increase of traditional selection efficiency in maize breeding.
The economic-valuable (polygenic) trait loci – components of plant gabitus, panicle morphology, yield and biochemical attributes are marked.
Developed algorithm of genetic-statistical connection between marker genetic systems and QTL’s is a basis of DNA-predict way for polygenic trait development, which reliability in (GK26 x Mo17) F3 population makes 40-83%.
For population genetic improvement on agronomical traits complex the direct markers selection method is offered, which experimental genetic effect in (GK26 x Mo17) F4 population makes 9,1-17,6% for one selection cycle.
Requirements to formation of markers test system and informative markers criteria for increase of DNA-predict and markers selection models efficiency are proved.
Key words: PCR, QTL’s, marking, DNA-predicting, marker selection, maize population.
| 
