Табл.3. Коефіцієнти кореляції між генетичними відстанями і господарсько-цінними ознаками, 1994-1996 гг.
Ознака Рік вивчення
1994 1995 1996
Урожай насіння 0,53 0,45 0,40
Вміст олії в насінні 0,70 0,14 0,18
Висота рослин 0,37 0,32 0,29
Коефіцієнти кореляції істотні на 5% рівні при кrккрит.і0,195
У більшості випадків зростання генетичної відстані між лініями призводило до збільшення урожайності, висоти гібридів F1 і відповідно рівня гетерозису. Так, найбільш урожайні й високорослі гібриди отримані з використанням лінії Х2552. Інтервал дистанцій між лінією Х2552 й іншими лініями змінювався в межах 0,348-0,615. Урожайність гібридів, отриманих з використанням цієї лінії, варіювала від 30,1 до 36,1 ц/га. Максимальний рівень вияву гетерозису від схрещування Х2552 з іншими лініями склав 107,3%. У середньому урожайність склала 33,6 ц/га, а гетерозис – 82,6%. Середня висота гібридів з використанням цієї лінії склала 147,3 см, а гетерозис 34,7% (табл.4).
Табл.4. Середня урожайність гібридів F1 в 1996-1997 рр. в залежності від генетичної відстані між батьківськими лініями
№ п/п Генетичні відстані Кількість гібридів Середня урожайність, ц/га
1 0,078-0,180 24 30,4
2 0,194-0,288 35 32,3
3 0,307-0,531 72 31,7
4* 0,348-0,615 24 33,6
НІР0,5 1,17
*Гібриди, які були створени за участю лінії Х2552
Необхідно відзначити, що подібна закономірність спостерігалася не завжди. Були виявлені гібридні комбінації, в яких показник ознаки, що вивчалася, високий, а генетична відстань між вихідними батьківськими лініями невелика, і навпаки. Наприклад, урожайність гібридної комбінації Х1008хХ1007 при D=0,159 склала 33,9 ц/га.
Коефіцієнт кореляції між генетичними відстанями батьківських ліній і вмістом олії у насінні значно змінювався за роками (табл.3). Рівень гетерозису за три роки досліджень не перевищив 8%. Кліматичні умови випробування сильно впливали на залежність між двома параметрами.
Отримані результати збігаються з даними інших авторів, одержаними при вивченні генетичного різноманіття вихідного матеріалу соняшнику, що мав інше походження (Сиволап и др., 1998; Hunt et al., 1992). Позитивна залежність виявлена не лише для соняшнику, а й таких культур як кукурудза (Heidrich-Sobrino et al., 1975; Smith et al., 1990; Вербицкая и др., 1998), рис (Peng et al., 1988; Xiao et al., 1996; Liu et al., 1998).
Визначення рівня гібридності простих гібридів. В табл. 5 наведені результати по оцінці рівня гібридності у простих гібридів соняшнику. Найбільший рівень гібридності був виявлений для гібриду Ной (94%); а найменший для гібриду Світоч (63%).
Наведені дані свідчать про низький рівень гібридності, крім гібриду Ной. Насамперед, це може бути пов'язано з порушеннями агротехнічних прийомів під час розмноження інбредних ліній та створення гібридів (недотримання просторової ізоляції, несвоєчасне проведення сортових прополок). В роботі (Попереля, 2000) також було відзначено низький рівень гібридності насіння соняшнику за допомогою геліантініну.
Табл.5. Гібридність насіння F1 простих гібридів соняшнику
Гібрид Комбінація схрещування Ізоферментна система Гібридність, %
Харківський 49 Сх908 х Х711 Анодна естераза 73
Харківський 58 Сх508 х Х711 Анодна естераза 75
Світоч Сх1006 х Х711 6-фосфоглюконат- дегідрогеназа, малатдегідрогеназа 63
Кий Сх908 х Х762 Анодна естераза 78
Погляд Сх2111 х Х711 Малатдегідрогеназа 86
Ной Сх1002 х Х720 Катодна естераза 94
Класифікація колекції інбредних ліній соняшнику за допомогою біохімічних маркерів. Систематизація колекції може забезпечити роботу з вихідним матеріалом, а також окреслити шляхи її поповнення. Анодна естераза, катодна естераза, катодна кисла фосфатаза і НАД-залежна малатдегидрогеназа були проаналізовані для встановлення генетичних зв'язків між 79 інбредними лініями, що мають комерційне значення.
У результаті кластерізації лінії було поділено на 4 кластери – “А”, “B”, “C”, “D”. Генетичні відстані між лініями соняшнику склали від 0,000 до 0,760 для окремих пар ліній.
Перший кластер (“А”) був представлений переважно батьківськими лініями – відновниками фертильності. В цей кластер увійшли лінії, що мали у своїх родовідних зразки, інтродуковані з Югославії та США. Це зразки Os3, Os5, NS4 (Югославія), SF100, C208, RW637 (США). Слід підкреслити, що більшість відновників фертильності створена з югославських зразків. Наприклад, лінію Х711 створено шляхом добору із зразка Os5. До цього кластера також увійшли два стерильні аналоги – Х4353 і Х1010, які походять від сорту-популяції Харківський 50 і зразка ВІР – W501.
До кластера “В” увійшли як батьківські форми, так і материнські лінії. Матеріалом для їх створення служили міжвидові гібриди від схрещування H.annuus з H. tuberosus, а також сорти популяції Чернянка 66, Харківський 50, Харківський 100.
Лінії, які походять від зразка з США SF100, сорту Чернянка 66 і міжвидових гібридів, були об'єднані в кластери “C” та “D”.
Лінії Х2552 і Х1012 не увійшли до жодного з кластерів. Вони створені шляхом добору з сорту Черняка 66 і Харківський 100, відповідно. Лінія Х2552 характеризувалась найбільшою генетичною віддаленістю від решти ліній.
У цілому можна зробити висновки, що отримана класифікація колекції інбредних ліній у більшості випадків відповідає інформації про родовідні вивчених ліній (Кириченко, 1996).
Молекулярно-генетичний поліморфізм RAPD-локусів і генетичні зв'язки між інбредними лініями
Аналіз внутрішньовидової мінливості методом ПЛР з довільними праймерами. За допомогою RAPD-аналізу було виявлено поліморфізм між 30 лініями соняшнику. Найбільший рівень поліморфізму виявлений з використанням праймера OPW-06 (83%); а найменший одержано з використанням праймера OPW-04 (62%). Середній рівень поліморфізму склав 72,6% (табл.6). При використанні різних праймерів ампліфікувалося від 14 до 23 варіантів фрагментів ДНК. Всього був ідентифікований 221 локус, з яких 161 виявився поліморфним.
Табл.6. Рівень поліморфізму, який виявляється з використанням довільних праймерів
Праймер Послідовність нуклеотидів 5'-3' Процент поліморфізму
P36 CCGAATTCGC 67
P37 CTGACCAGCC 70
P38 GATACGTTGTC 68
P46 GGTTGGGGAG 78
P53 GTCTAAGTCG 72
OPT-08 AACGGCGACA 75
OPW-04 CAGAAGCGGA 62
OPW-06 AGGCCCGATG 83
OPW-09 GTGACCGAGT 78
OPW-10 TCGCATCCCT 77
OPW-15 ACACCGGAAC 68
OPX-01 CTGGGCACGA 73
Кожна лінія соняшнику відрізнялася від інших не лише кількістю фрагментів та їх довжиною, а й ступенем виразності, що ймовірно, може забезпечувати додатковий поліморфізм (Hunt et al., 1992).
Деякі фрагменти були унікальними, присутніми лише в одному генотипі. Так, лише у ліній Х945 і Х1012 при ампліфікації з праймером OPW-04 виявляються фрагменти довжиною ~600 і 1200 п.н. відповідно. У лінії Х908 при використанні праймера P38 вдалося ідентифікувати унікальний фрагмент розміром ~ 900 п.н.
Схожі результати отримано при аналізі самозапилених ліній соняшнику селекції СГІ. Був показаний високий рівень поліморфізму, що виявлявся за допомогою RAPD-аналізу. У середньому він склав 64% (Сиволап и др., 1998).
Рис.2. Дендрограма генетичних зв'язків між лініями, отримана на підставі даних RAPD-аналізу (А) та ізоферментного аналізу (Б).
Таким чином, в результаті наших досліджень було виявлено високий рівень поліморфізму серед інбредних ліній.
Порівняння RAPD та ізоферментного аналізу для визначення генетичних зв'язків між інбредними лініями. На рис. 2 представлені дендрограми, що відображають генетичні зв'язки інбредних ліній соняшнику, побудовані на підставі даних RAPD (A) та ізоферментного аналізу (Б).
У результаті кластеризації лінії в обох випадках об'єдналися в три групи (рис.2). Аналіз топології одержаних дендрограм продемонстрував істотну різницю між ними, оскільки виділені кластери на двох дендрограмах представлені різними лініями. Коефіцієнт кореляції між генетичними відстанями, одержаний за даними RAPD-аналізу та ізоферментного аналізу, склав 0,07 (P<0,05). Характерною особливістю дендрограми, отриманої на підставі RAPD-аналізу, є те, що більшість материнських і батьківських ліній були зосереджені в різних кластерах.
Аналогічна робота була виконана Пізаро із співавторами (Pizarro et al., 2000). Автори цієї роботи також відзначають відмінність в отриманих дендрограмах. Коефіцієнт кореляції склав 0,22.
Таким чином, більш прийнятним для структурування вихідного матеріалу є RAPD-аналіз порівняно з ізоферментним аналізом, через те, що вдалось чітко розподілити лінії на групи материнських та батьківських форм.
ВИСНОВКИ
1. Компонентний склад анодної естерази контролюється генами: Est1, Est2, Est3, Est4; катодної естерази – cEst5, cEst6; катодної кислої фосфатази – cAcp1 і НАД-залежної малатдегідрогенази – Mdh1/ Mdh2 и Mdh3.
2. Ідентифіковано дві групи зчеплення між локусами, що контролюють синтез ферментів у соняшнику: Mdh3-Est1-Est2-Est3-cEst5 і Est4-cAcp1. Гени Mdh1/Mdh2 спадкуються незалежно від цих двох груп зчеплення. Ген листової катодної естерази – cEst6 спадкується незалежно відносно генів Est2 і cEst5.
3. У насінні експресуються гени Est1, Est2, Est3, Est4, cEst5, а в тканинах листа – Est2, cEst5, cEst6.
4. За 10 ізоферментними системами виявлено поліморфізм. Ідентифіковано від 2 до 3 алелів на ген, які характеризуються різною частотою. Виявлені рідкісні алельні варіанти, що зустрічаються в одиничних лініях.
5. Ідентифіковано 46 інбредних ліній соняшнику колекції Інституту рослинництва ім. В.Я.Юр'єва. 38 із 46 інбредних ліній різнилися одна від одної за одним із 16 проаналізованих ізоферментних локусів, які контролюють синтез 10 ізоферментних систем.
6. Встановлена кореляція між генетичними відстанями і господарсько-цінними ознаками. Оцінка генетичного різноманіття інбредних ліній за ізоферментами може служити критерієм прогнозування ефекту гетерозиса тільки по врожайності.
7. Встановлено рівень гібридності 6 простих гібридів соняшнику за допомогою електрофорезу ізоферментів.
8. Класифікована колекція ліній соняшнику за ступенем генетичної спорідненості з використанням 4 ізоферментних систем: анодної і катодної естерази, катодної кислої фосфатази та НАД-залежної малатдегідрогенази.
9. Середній рівень поліморфізму ДНК, встановлений за допомогою RAPD-методу склав 72,6%.
10. Більш прийнятним для диференціації інбредних ліній є RAPD-аналіз у порівнянні з ізоферментним аналізом.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Kirichenko V.V., Sharopova N.R., Popov V.N., Maklyak E.N. Potential use polymorphism of isoenzymes in selective-genetical programs for sunflower (Helianthus annuus L.) // Helia. - 1999. – Vol.22. - №30 – P.149-154.
2. Попов В.М., Кириченко В.В., Панченко І.А. Визначення рівня гібридності насіння соняшнику в промисловому насінництві // Селекція і насінництво. – 1999. – Вип.82. – С.134-138.
3. Kirichenko V.V., Popov V.N. Genetics of isoenzymes and analyses of isoenzemes linkage and morophological loci in sunflower (Helianthus annuus L.) // Helia. – 2000. – Vol.23. - №33. – P.65-76. 3.
4. Попов В.Н. Классификация коллекции линий подсолнечника Института растениеводства им. В.Я.Юрьева с помощью биохимических маркеров // Весник харьковского университета. – 2000. - №456. – С.80-83.
5. Попов В.Н. Использование RAPD-анализа для изучения полиморфизма линий подсолнечника (H. annuus L.) // Весник харьковского университета. – 2001. - №506. – С.241-243.
6. Попов В.Н., Кириченко В.В. Оценка генетического разнообразия и взаимоотношений между линиями подсолнечника с использованием изоферментов и RAPD-маркеров // Труды по фундаментальной и прикладной генетике. – 2001. – С.223-232.
7. Кириченко В.В., Шаропова Н.Р., Макляк Е.Н., Попов В.Н. Возможность использования генетического разнообразия исходного материала по изоферментам для прогнозирования эффекта гетерозиса у подсолнечника // Тези доповідей міжнародної конференції “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва”. - Харків, Ін-т рослинництва ім.В.Я.Юр'єва. - 1999. - С. 156
8. Попов В.Н. Генетический контроль и сцепление локусов эстеразы, катодной кислой фосфатазы и малатдегидрогеназы у подсолнечника // Тези доповідей VII Конференції молодих вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття”. – К.: Інститут фізіології рослин і генетики. – 2000. - С.106
9. Попов В.Н. Использование RAPD-анализа для изучения полиморфизма подсолнечника // Сборник тезисов 5-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века”. – Пущино: Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения. – 2001. - С.89.
10. Попов В.Н. Полиморфизм изоферментов у инбредных линий подсолнечника // Сборник тезисов международной конференции молодых ученых "Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений". – Харьков: Ин-т растениеводства им. В.Я.Юрьева. – 2001. – С. 55-56.
11. Popov V.N., Urbanovich O.Yu., Kirichenko V.V. Classification of sunflower inbred lines collection with molecular-genetic markers // International conference "Genetics collections, isogenic and alloplasmic lines". – Novosibirsk: IC&G. - 2001. – P.206-209.
Попов В.М. Використання молекулярно-генетичних маркерів в генетико-селекційних дослідженнях соняшнику. – Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук із спеціальності 03.00.15. – генетика. – Інститут клітинної та генетичної інженерії НАНУ, Київ, 2001.
В роботі наведені результати використання різних систем молекулярно-генетичних маркерів в теоретичних та прикладних дослідженнях соняшнику. Вивчено поліморфізм ізоферментних систем. Показано, що алельні варіанти ферментних локусів розподілені не рівномірно. Було ідентифіковано рідкі алельні варіанти. Вивчено генетичний контроль анодної естерази, катодної естерази, катодної кислої фосфатази та НАД-залежної малатдегідрогенази, а також ідентифіковано дві групи зчеплення між ними. По генам анодної і катодної естерази показана різна експресія в тканинах сім'янки та листка. Ідентифіковані генотипи 46 інбредних ліній соняшника. У вивченій виборці ліній були зразки повністю ідентичні за компонентним складом ізоферментів. Виявлено позитивну залежність між генетичним різноманіттям батьківських форм за ізоферментами та урожаєм насіння, висотою рослин і вмістом масла в сім'янках гібридів F1. Виділено гібридні комбінації з високим рівнем прояву ознаки, а також гетерозису, батьківські форми яких мають велику генетичну відстань між собою. Встановлено рівень гібридності простих гібридів соняшнику за допомогою ферментних маркерів. З використанням 4 ізоферментних систем вдалось класифікувати колекцію вихідного матеріалу, який налічує 79 ліній. Вивчено внутрішньовидовий поліморфізм за допомогою RAPD-аналізу. Зроблено порівняння RAPD- і ізоферментного аналізу у вивченні генетичних взаємовідносин між інбредними лініями.
Ключові слова: соняшник, Helianthus annuus L., генетика ізоферметів, ПЛР, RAPD, поліморфізм, кластерний аналіз.
Попов В.Н. Использование молекулярно-генетических маркеров в генетико-селекционных исследованиях подсолнечника. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15. – генетика. – Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАНУ, Киев, 2001.
В работе представлены результаты по использованию различных систем молекулярно-генетических маркеров в теоретических и прикладных исследованиях подсолнечника. Изучен генетический контроль анодной эстеразы, катодной эстеразы, катодной кислой фосфатазы и НАД-зависимой малатдегидрогеназы. Показано, что анодная эстераза контролируется генами: Est1, Est2, Est3 и Est4; катодная эстераза – cEst5, cEst6; катодная кислая фосфатаза – cAcp1 и НАД-зависмая малатдегидрогеназа – Mdh1/Mdh2, Mdh3. Было идентифицировано две группы сцепления. Первая группа представлена следующими генами: Mdh3-Est1-Est2-Est3-cEst5, вторая – Est4-cAcp1. Гены Mdh1/Mdh2 наследуются независимо по отношению к этим группам сцепления ферментных генов. По генам эстеразы, показана различная экспрессия в тканях семени и листа. В семенах экспрессируются следующие гены: Est1, Est2, Est3, Est4 и cEst5, а в тканях листа Est2, cEst5, cEst6. В пределах изученной коллекции было отмечено неравномерное распределение аллельных вариантов ферментных локусов. Идентифицированы генотипы 46 инбредных линий подсолнечника. В изученной выборке линий были образцы полностью идентичные по компонентному составу изоферментов. Выявлена положительная зависимость между генетическим разнообразием исходных родительских форм по изоферментам и урожаем семян, высотой растений и содержанием масла в семенах гибридов F1. Выделены гибридные комбинации с высоким уровнем проявления признака, а также гетерозиса, родительские формы которых имеют большое генетическое расстояние между собой. Установлен уровень гибридности простых гибридов подсолнечника. Было показано, что гибридность большинства гибридов низкая. С использованием 4 изоферментных систем удалось классифицировать коллекцию исходного материала, состоящего из 79 линий. Изучен внутривидовой полиморфизм с помощью RAPD-анализа. Средний уровень полиморфизма составил 72,6%. Были идентифицированы уникальные фрагменты, присутствующие у единичных линий. Проведено сравнение RAPD- и изоферментного анализа в изучении генетических взаимоотношений между инбредными линиями. Показано, что для дифференциации исходного материала более приемлемым является RAPD-анализ.
Ключевые слова: подсолнечник, Helianthus annuus L., генетика изоферментов, ПЦР, RAPD, полиморфизм, кластерный анализ.
Popov V.N. The use of molecular-genetic markers in genetic-selection studies of sunflower. – Manuscript.
Thesis for a Candadate's degree in Biological Sciences on speciality 03.00.15. – Genetics. – Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, NASU, Kiev, 2001.
In the dissertation the results on the use of different systems of molecular-genetic markers in theoretical and applied studies of sunflower are submitted. There has been studies a genetical control of anode esterase, cathodal esterase, cathodal acid phosphatase and NAD-dependable malatedehydrogenase as well as two groups of linkage between them have been identified. By the gene of esterase there has been shown a different expression in seed and leaf tissues. The genotypes of forty six inbred lines of sunflower have been identified. There were the samples fully identical as to the component composition of isoenzymes in the studied sampling of lines. It was a success to classify the original material collection consisting of seventy-nine lines by the use of four isoenzymic systems. A positive correlation has been revealed between genetic diversity of primary parental forms by isoenzymes and seed yield, plant height and oil content in seeds of F1 hybrids. There have been determined hybrid combinations with a high level of trait's expression as well as heterosis, the parental lines of these have a great genetical distance between them. The intraspecific polymorphism has been studied by means of RAPD-analysis. The comparison of RAPD- and isoenzymic analyses while studying genetic intercorrelations among inbred lines has been made.
Key words: sunflower, Helianthus annuus L., genetics of isoenzymes, PCR, RAPD, polymorphism, claster analysis.
м.Харків, ТОВ “Спайк”, вул. Сумська, буд. 11.
Тел. (0572) 14-29-61, 12-80-44.
Підписано до друку 14.03.2002р. Формат 60х90/16
Гарнітура Times New Roman. Ум. друк. арк. 1
Обл.-вид. арк. 1. Тираж 100 екз. Зам. №536
| 
